一种B组柯萨奇病毒的多肽抑制剂及其制备方法和应用

一种b组柯萨奇病毒的多肽抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种b组柯萨奇病毒的多肽抑制剂及其制备方法和应用，特别涉及一种b组柯萨奇病毒2b蛋白的多肽抑制剂及其制备方法和应用。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.b组柯萨奇病毒(coxsackievirus b，cvb)是单正链小rna病毒，b组柯萨奇病毒属于小rna病毒科肠道病毒属，有6个血清型(cvb1～cvb6)。
3.cvb是人类病毒性心肌炎、扩张型心肌病的主要病原，50％病毒性心肌炎和25％扩张型心肌病的心肌组织中可检出cvb抗原和核酸。用cvb攻击小鼠可致病毒性心肌炎。cvb基因组结构包括5
’‑
端非编码区、p1区、p2区、p3区和3
’‑
端非编码区。p1区编码4种结构蛋白；p2、p3区为功能蛋白编码区，分为2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d功能蛋白。
4.cvb病毒的2b蛋白为具有99个氨基酸残基的跨膜蛋白，由两亲性hr1结构域和疏水螺旋结构hr2结构域组成。2b蛋白以四聚体的形式定位于内质网膜和高尔基体膜上，缺少hr1或hr2会导致2b蛋白不能形成聚体插入膜中，没有生物学活性。因此，hr1和hr2结构域对于2b蛋白与宿主细胞膜结构的相互作用至关重要。
5.基于b组柯萨奇病毒编码的2b蛋白结构域的特性，我们推测这些疏水结构的完整性及其相互作用对2b蛋白的生物学功能至关重要。这些发现可能为未来抗病毒药物的研究和开发提供突破。
6.tat蛋白是人类免疫缺陷病毒i型的反式激活因子，近期研究表明tat蛋白可以介导多肽、基因等外源物质进入细胞，具有无毒性，比较稳定的特点，因而可以直接应用于细胞。tat蛋白的蛋白质转导结构域的核心区域是由11个氨基酸残基所组成的，我们可以基于此特性进行多肽类药物的给药。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是提供一种b组柯萨奇病毒的多肽抑制剂及其应用。
8.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
9.本发明发明人根据b组柯萨奇病毒2b的hr1区域设计了三条多肽抑制剂的序列，所述的多肽抑制剂的氨基酸序列如seq id no.1-3任一所示，通过western blotting检测内源性表达多肽抑制剂的抑制效果。结果表明，2b
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多肽抑制剂在细胞内源性表达后可以最有效地抑制b组柯萨奇病毒蛋白的表达。进一步的，本发明发明人合成了2b
109-150
的外源性抑制剂2b
109-150’，通过显微镜下观察细胞病变效应，westernblotting检测3d蛋白表达水平，cck8实验检测多肽抑制剂2b
109-150’对b组柯萨奇病毒的抑制效果，结果表明，外源性加入2b
109-150’多肽抑制剂后可以有效地抑制b组柯萨奇病毒。
10.因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种b组柯萨奇病毒的多肽抑制剂，所述的多肽抑制剂的氨基酸序列如seq id no.1-4任一所示。
11.其中，优选的，所述的多肽抑制剂的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.4所
示。
12.编码所述的多肽抑制剂的多核苷酸、含有所述的多核苷酸表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
13.进一步的，本发明还提出了所述的多肽抑制剂或b组柯萨奇病毒2b蛋白在制备抑制b组柯萨奇病毒复制的药物中的应用。
14.所述的多核苷酸在制备抑制b组柯萨奇病毒复制的药物中的应用。以及
15.所述的表达载体在制备抑制b组柯萨奇病毒复制的药物中的应用。
16.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
17.目前临床尚无针对cvb的特异性药物，本发明根据b组柯萨奇病毒编码的2b蛋白疏水结构域的特性，提供了三条多肽抑制剂，并成功构建了表达多肽抑制剂的真核表达质粒，通过westernblotting检测3d蛋白表达水平，选择抑制效果最好的2b
109-150
进行多肽的合成，通过显微镜下观察细胞病变效应，westernblotting检测3d蛋白表达水平，cck8实验检测多肽抑制剂对b组柯萨奇病毒的抑制效果。结果表明，2b
109-150
多肽抑制剂可以有效地抑制b组柯萨奇病毒。
附图说明
18.图1为pegfp-c1’质粒图谱；
19.图2为测序结果比对；
20.图3为westernblotting检测含有不同长度2b序列质粒的表达蛋白抑制效果；
21.图4为显微镜下观察细胞病变效应(cpe)，检测外源性加入2b
109-150
后对病毒的抑制效果；
22.图5为westernblotting检测外源性加入2b
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后对病毒蛋白的抑制效果；
23.图6为cck8实验检测外源性加入2b
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抑制剂对于cvb3病毒感染的抑制效果。
具体实施方式
24.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
25.实施例1构建含有多肽抑制剂序列的融合蛋白真核表达质粒
26.1、以pcdna3.1+质粒作为基本质粒骨架，从pegfp-n1质粒上扩增出绿荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein egfp)的核酸片段，将egfp片段插入pcdna3.1质粒，构建pegfp-c1’质粒，egfp读码框位于cmv启动子下游，egfp读码框已敲除taa终止密码子，两端分别由nheⅰ和hindⅲ限制性内切酶连接。egfp读码框下游连接了保证两侧蛋白空间结构相对独立的柔性连接(5
’‑
ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg-3’)，质粒图谱如图1所示。
27.2、分别设计3对引物用于扩增不同大小的3个多肽抑制剂的编码序列，在上下游引物的5’端分别引入限制性内切酶核酸位点hindⅲ(aagctt)和xbaⅰ(tctaga)用于之后的载体连接，引物序列如表1所示，通过完全overlap-pcr的方式获得目的片段，目的片段所编码的氨基酸序列如表2所示，核苷酸序列如表3所示。应用限制性核酸内切酶hindⅲ和xbaⅰ双酶切处理pegfp-c1’，胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物，将目的片段与载体连接，转化连
接产物，测序鉴定分别获得表达2b
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、2b
109-162
、2b
109-189
三个融合蛋白真核表达质粒，序列比对结果如图2所示，分别命名为pegfp-c1
’‑
2b
109-150
、pegfp-c1
’‑
2b
109-162
、pegfp-c1
’‑
2b
109-189
。
28.表1 b组柯萨奇病毒2b蛋白抑制剂的引物序列
[0029][0030]
表2 b组柯萨奇病毒多肽抑制剂的氨基酸序列
[0031][0032]
表3编码b组柯萨奇病毒多肽抑制剂的核苷酸序列
[0033]
[0034][0035]
同时，本发明还构建了表达2b、2c全长融合蛋白真核表达质粒，命名为pegfp-c1
’‑
2b，pegfp-c1
’‑
2c。
[0036]
实施例2含有多肽抑制剂序列的融合蛋白真核表达质粒的抑制效果
[0037]
western blotting实验：
[0038]
首先分别提取含有多肽抑制剂序列的融合蛋白真核表达质粒pegfp-c1
’‑
2b
109-150
、pegfp-c1
’‑
2b
109-162
、pegfp-c1
’‑
2b
109-189
、pegfp-c1
’‑
2b以及pegfp-c1
’‑
2c进行真核细胞转染实验：
[0039]
将vero细胞铺于6孔板内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的60％-70％时，将1μg融合蛋白表达质粒转染至vero细胞内，所用的转染试剂为neofect
tm
dna transfection reagent，转染操作参考试剂说明书。转染24h后加入含有病毒(moi＝0.1)的dmem，1h后换为有血清的细胞培养液，观察细胞病变后，离心收取细胞沉淀，然后加入裂解液裂解细胞30分钟，提取蛋白，测定蛋白浓度后使用10％sds-page。用抗3d、egfp抗体进行westernblotting，检测表达蛋白抑制病毒的抑制效果。
[0040]
结果：
[0041]
图3是western blotting检测含有不同长度2b序列质粒的表达蛋白抑制效果，其中2b
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的抑制效果最为显著，选取它为外源性多肽抑制剂进行下一步实验。
[0042]
实施例32b
109-150’多肽抑制剂的合成及其对病毒的抑制效果
[0043]
1、2b
109-150’多肽抑制剂的合成
[0044]
根据实施例2的研究结果，本发明发明人合成了外源性2b抑制剂，其氨基酸序列如表4所示。
[0045]
表4外源性2b抑制剂的氨基酸序列
[0046][0047]
2、2b
109-150’多肽抑制剂对病毒的抑制效果
[0048]
(1)cpe实验：
[0049]
将vero细胞铺于6孔板内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的60％-70％时，加入不同浓度的多肽抑制剂2b
109-150’，4h后加入含有cvb3病毒(moi＝0.1)的dmem，1h后换为有血清的细胞培养液，继续培养观察细胞病变效应。
[0050]
结果：
[0051]
图4是显微镜下观察细胞病变效应(cpe)，检测外源性加入多肽抑制剂2b
109-150’后对病毒感染的抑制效果。从该结果可以看出，2b
109-150’对病毒有显著的抑制作用。
[0052]
(2)westernblotting实验：
[0053]
观察细胞病变后，离心收取细胞沉淀，然后加入裂解液裂解细胞30分钟，提取蛋白，测定蛋白浓度后使用10％sds-page。用抗vp1、3d抗体进行western blotting，检测外源性加入2b
109-150’后对病毒的抑制效果。
[0054]
结果：
[0055]
图5是用抗vp1、3d抗体进行westernblotting，检测2b
109-150’多肽抑制剂对病毒的抑制效果。从该结果可以看出，2b
109-150’对病毒有显著的抑制作用。
[0056]
(3)cck8实验：
[0057]
将vero细胞铺于96孔板内，每孔100ul细胞培养液，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的50％时，加入不同浓度的多肽抑制剂2b
109-150’，4h后加入含有cvb3病毒(moi＝0.1)的dmem，1h后换为有血清的细胞培养液，继续培养观察到细胞病变效应后加入10ul cck8，培养1-2h，待颜色变为橙红色后测定450nm吸光度。
[0058]
结果：
[0059]
图6是cck8实验检测外源性加入2b
109-150’抑制剂对于cvb3病毒感染的抑制效果。从该结果可以看出，2b
109-150’对病毒有显著的抑制作用。