一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法

1.本发明属于微生物多糖技术领域，具体涉及一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法。


背景技术：

2.冠突散囊菌，俗称“金花菌”，安全无毒，是茯砖茶加工过程中，通过控制温、湿度自然“发花”而成的一种有益真菌，是茯砖茶发酵过程中的优势菌种，它的的质量和数量是衡量茯砖茶品质优劣的重要指标。在生长条件方面，它对营养物质的需求以及外界环境要求较低，且适应能力较强，在28～30℃，ph值为5～6可以茁壮生长；在生物活性方面，冠突散囊菌可以提高机体免疫力、降血脂、降血糖以及调节肠道菌群等；在医药价值方面，冠突散囊菌可以抗肿瘤、减肥、治疗腹泻等，未来冠突散囊菌也会有良好的应用前景。冠突散囊菌可以通过发酵工艺产出较多的次级代谢产物，这些代谢产物对分离与培养条件要求不高，且有效成分的发酵工艺也较简单，培养条件与发酵工艺的不断优化也为将来实现大规模连续培养及产业化提供了可能，未来可通过发酵工程技术源源不断地获取活性产物，为该活性产物将来的大规模应用奠定基础。
3.现有冠突散囊菌胞外多糖的发酵方法为：冠突散囊菌液体培养基(主要为包括马铃薯葡萄糖肉汤培养基、含有淀粉、玉米粉的培养基)经过无菌接种冠突散囊菌孢子悬浮液，恒温震荡培养后，发酵液经过离心、浓缩、醇沉、冷冻干燥后获得冠突散囊菌胞外多糖。这种方法存在多糖得率低，多糖不纯等问题。因此迫切需要一种冠突散囊菌胞外多糖得率高，纯度高的发酵方法。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法，解决现有冠突散囊菌胞外多糖发酵方法多糖得率低，多糖不纯的问题。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明公开了一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法，将冠突散囊菌菌悬液接种于固体培养基中培养，得到冠突散囊菌菌株，再将菌株与无菌水混合制备冠突散囊菌孢子悬浮液，对液体生长培养基中接种，得到发酵液，离心，去除沉淀，收集上清液，浓缩，醇沉，透析除杂，得到透析液；冷冻、干燥后得到冠突散囊菌胞外多糖粉末；
7.其中，所述固体培养基由琼脂粉、蔗糖、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钾、硝酸钠和蒸馏水以2000：3000：1：50：50：100：200：100000的质量比组成；所述液体生长培养基由蔗糖、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钾磷酸氢二钾、硝酸钠和蒸馏水的质量比为3000：1：50：100：200：100000。
8.优选地，固体培养基和液体培养基在使用前，先于0.1mpa下120℃高温灭菌20min。
9.优选地，固体培养基为自然ph值，液体生长培养基ph值为5。
10.优选地，醇沉采用体积分数为95％乙醇，醇沉倍数为3～4倍。
11.优选地，冠突散囊菌菌悬液的制备方法为：称取茯砖茶和无菌水，混合摇匀，过滤茶渣，即得到冠突散囊菌菌悬液。
12.进一步优选地，茯砖茶和无菌水的质量比为1:30。
13.优选地，接种按照7％的接种量进行。
14.优选地，离心转速为8000r/min，减压浓缩温度为60℃，浓缩至原发酵液原体积的1/4。
15.优选地，所述透析的方法为：将加水复溶后胞外多糖水溶液透析2～3d，8h换一次水，换6～9次蒸馏水，得到透析液。
16.优选地，液体生长培养基中培养的条件为：ph值＝5，28℃、150r/min震荡培养。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明提供的一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法，不同于常规生产冠突散囊菌胞外多糖工艺中的培养基，本方法对培养基的碳、氮源还有发酵工艺参数进行了优化，确定培养基的碳源为蔗糖、氮源为硝酸钠，采用微生物分离纯化技术、微生物液体发酵技术、酒精醇沉以及冷冻干燥技术，以胞外多糖的含量及产量为指标，探索了本发明最优的发酵工艺条件，相比现有培养基通过发酵醇沉获得冠突散囊菌胞外多糖杂质多、纯度不高且后期会分离的问题，本方法获得的多糖杂质更少、纯度更高，获得的多糖得率(胞外多糖含量可达93％以上，高于现有方法的60％)也更高，且可以保持其原有的活性和免疫性。该方法培养基原料廉价易得，方法流程简单，控制方便，可操作性强，成本低，适用于大规模工业化生产，能够为以后研究冠突散囊菌胞外多糖的理化性质、结构特征以及将其应用于医药工业或食品工业构建基础。
19.进一步地，采用3～4倍进行醇沉，能够使得多糖得率最大化。
20.进一步地，茯砖茶与无菌水的用量比为1:30，使得菌悬液经过无菌涂布后在平板上长得更旺盛更均匀。
附图说明
21.图1是本发明的紧压茯砖茶的图；
22.图2是本发明的冠突散囊菌生长平板图；
23.图3是本发明的冠突散囊菌液体发酵图；
24.图4是本发明的冠突散囊菌胞外多糖粉末图；
25.图5是本发明的冠突散囊菌胞外多糖高效液相色谱图；
26.图6是本发明的冠突散囊菌胞外多糖高效气相色谱图。
具体实施方式
27.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
28.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第
二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
29.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
30.本发明提供的一种冠突散囊菌胞外多糖发酵的方法，包括以下步骤：
31.(1)称取茯砖茶，加入无菌水，混合摇匀，用纱布过滤掉茶渣，得到冠突散囊菌菌悬液。用涂布器将菌悬液接种于改良的czg固体培养基，28～30℃恒温培养5～6d；
32.其中，所述茯砖茶和无菌水的质量比为1:30，所述固体培养基由琼脂粉、蔗糖、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钾、硝酸钠和蒸馏水以2000：3000：1：50：50：100：200：100000的质量比组成，自然ph值；所述固体培养基在使用前，先于0.1mpa下120℃高温灭菌20min。
33.(2)用接种针将活力旺盛的菌株轻轻刮下，加入无菌水，混合摇匀，得到冠突散囊菌孢子悬浮液，按照7％的接种量对改良的czg液体生长培养基进行接种，28℃、150r/min放入摇床6d得到发酵液；
34.其中，所述液体生长培养基由蔗糖、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钾磷酸氢二钾、硝酸钠和蒸馏水的质量比为3000：1：50：100：200：100000，ph值为5；所述液体培养基在使用前，先于0.1mpa下120℃高温灭菌20min。
35.(3)对步骤(2)得到的发酵液进行离心，去除沉淀，合并收集上清液，减压浓缩至原发酵液体积的1/4，加入3～4倍95％乙醇进行醇沉，静置过夜；滤出沉淀物，加水复溶，将冠突散囊菌胞外多糖水溶液透析除杂，期间勤换水，得到透析液；
36.其中，离心的转速为8000r/min，减压浓缩温度60℃，透析液用透析袋储存，透析袋选用分子量范围为8000～14000da，透析48h。
37.(4)将步骤(3)得到的透析液放入冰箱冷冻12～24h，冷冻结实后对其进行冷冻干燥后得到冠突散囊菌胞外多糖粉末。
38.实施例1
39.(1)称取琼脂粉20g，蔗糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钠2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，自然ph值，置于磁力搅拌器使其充分溶解，再高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，趁热分装至平板，冷却后得到冠突散囊菌的固体培养基(即改良的czg培养基)。如图2，利用改良的czg培养基固体发酵冠突散囊菌，观察到菌落生长良好，呈现不规则的圆形，形态小，表面含有金黄色颗粒，菌落整体呈现金黄色，边缘呈锯齿状，菌落向四周蔓延，菌株生长产生的次级代谢产物也使培养基颜色加深。
40.(2)称取1g紧压茯砖茶(如图1，茯砖茶内部含有大量的金黄色闭囊壳是“金花菌”)，加入30ml无菌水，充分震荡，用两层纱布过滤掉茶渣，得到冠突散囊菌菌悬液，再将冠突散囊菌菌悬液均匀涂布接种于步骤(1)制得的固体培养基中，放入培养箱28℃恒温培养5d。
41.(3)用接种针轻轻刮取生长活力旺盛的菌株，加入无菌水，混合均匀，得到冠突散
囊菌孢子悬浮液。称取蔗糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钠2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，置于磁力搅拌器使其充分溶解，用盐酸调节ph值为5，分装于10个容量为250ml的三角瓶中，装液量为40％，在高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，冷却至室温后得到冠突散囊菌液体培养基，如图3，液体发酵产生的菌丝球大而饱满，经过浓缩、醇沉、透析、冷冻干燥得到的冠突散囊菌胞外多糖呈现乳白色蓬松的棉花状；以7％接种量对液体培养基无菌接种，28℃、150r/min放入摇床恒温培养6d，得到发酵液。
42.(4)对步骤(3)的发酵液离心，去除底部沉淀物，合并收集上清液，减压浓缩为原发酵液体积的1/4，即250ml；加入1000ml体积分数为95％乙醇对其醇沉，静置过夜；
43.(5)过滤收集冠突散囊菌胞外多糖沉淀物，加水复溶后，对其透析48h，每8h换一次水，换6次蒸馏水，得到透析液；将透析液分装于平皿放入冰箱-20℃冷冻12h，待冷冻结实后放入冷冻干燥机冷冻干燥，如图4，得到冠突散囊菌胞外多糖粉末，对其密封干燥保存。如图5和图6，获得的胞外多糖干燥粉末质量为1.15g，产品纯度(胞外多糖的糖含量)93.40％，蛋白含量仅1.17％。利用高效凝胶渗透色谱法对它的分子量进行测定，可以得到它的相对分子质量为8.45
×
105±
2.72da，利用气相色谱法对冠突散囊菌的中性单糖组成进行测定，可以得到其是由鼠李糖(rha)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)组成，通过计算得到冠突散囊菌胞外多糖的摩尔比例为1:1.01:13.56。
44.实施例2
45.(1)称取琼脂粉20g，蔗糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钾2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，自然ph值，置于磁力搅拌器使其充分溶解，再高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，趁热分装至平板，冷却后得到冠突散囊菌的固体培养基(即改良的czg培养基)。
46.(2)称取1g紧压茯砖茶，加入30ml无菌水，充分震荡，用两层纱布过滤掉茶渣，得到冠突散囊菌菌悬液，再将冠突散囊菌菌悬液均匀涂布接种于步骤(1)制得的固体培养基中，放入培养箱30℃恒温培养5d。
47.(3)用接种针轻轻刮取生长活力旺盛的菌株，加入无菌水，混合均匀，得到冠突散囊菌孢子悬浮液。称取葡萄糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钾2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，置于磁力搅拌器使其充分溶解，用盐酸调节ph值为5，分装于10个容量为250ml的三角瓶中，装液量为40％，在高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，冷却至室温后得到冠突散囊菌液体培养基，以7％接种量对液体培养基无菌接种，28℃、150r/min放入摇床恒温培养6d，得到发酵液。
48.(4)对步骤(3)的发酵液离心，去除底部沉淀物，合并收集上清液，减压浓缩为原发酵液体积的1/4，即250ml；加入1000ml体积分数为95％乙醇对其醇沉，静置过夜；
49.(5)过滤收集冠突散囊菌胞外多糖沉淀物，加水复溶后，对其透析48h，每8h换一次水，换6次蒸馏水，得到透析液；将透析液分装于平皿放入冰箱-20℃冷冻18h，待冷冻结实后放入冷冻干燥机冷冻干燥，得到冠突散囊菌胞外多糖粉末，对其密封干燥保存。
50.实施例3
51.(1)称取琼脂粉20g，蔗糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钠2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，自然ph值，置于磁力搅拌器使其充分溶解，再高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，趁热分装至平板，冷却后得到冠突散囊菌的固体培
养基(即改良的czg培养基)。
52.(2)称取1g紧压茯砖茶，加入30ml无菌水，充分震荡，用两层纱布过滤掉茶渣，得到冠突散囊菌菌悬液，再将冠突散囊菌菌悬液均匀涂布接种于步骤(1)制得的固体培养基中，放入培养箱29℃恒温培养6d。
53.(3)用接种针轻轻刮取生长活力旺盛的菌株，加入无菌水，混合均匀，得到冠突散囊菌孢子悬浮液。称取麦芽糖30g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钠2g于烧杯中，加入蒸馏水1000ml，置于磁力搅拌器使其充分溶解，用盐酸调节ph值为5，分装于10个容量为250ml的三角瓶中，装液量为40％，在高压灭菌锅0.1mpa下120℃灭菌20min，冷却至室温后得到冠突散囊菌液体培养基，以7％接种量对液体培养基无菌接种，28℃、150r/min放入摇床恒温培养6d，得到发酵液。
54.(4)对步骤(3)的发酵液离心，去除底部沉淀物，合并收集上清液，减压浓缩为原发酵液体积的1/4，即250ml；加入1000ml体积分数为95％乙醇对其醇沉，静置过夜；
55.(5)过滤收集冠突散囊菌胞外多糖沉淀物，加水复溶后，对其透析48h，每8h换一次水，换6次蒸馏水，得到透析液；将透析液分装于平皿放入冰箱-20℃冷冻24h，待冷冻结实后放入冷冻干燥机冷冻干燥，得到冠突散囊菌胞外多糖粉末，对其密封干燥保存。
56.以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。