一种口腔癌标志物线性表位融合肽及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体的说是一种口腔癌标志物线性表位融合肽及其应用。


背景技术：

2.口腔癌是世界上第六大癌症，按照世卫组织的统计，每年新增大约657000例口腔癌患者。口腔癌患者的五年生存率大约为50％；然而2012年到2016年的统计数据发现，i、ii、iii、iv期的生存率分别为79.9％、71.0％、56.5％和35.6％。这些数据表明，口腔癌的早发现早治疗能大大提高生存率。
3.口腔粘膜检测是现阶段口腔癌临床评估的重要手段。损伤处的组织活检是口腔癌诊断的金标准。尽管如此，由于口腔癌的异质性，准确的选择活检位点是一个较大的挑战。按照世卫组织的统计，口腔粘膜的筛查的灵敏度和特异性分别为0.5-0.99和0.64-0.99；耗钱耗时、对临床医生的操作也要求较高；且具有侵入性。因此，灵敏度高、特异性好、操作方便的口腔癌检测指标对于口腔癌的早发现早治疗具有极其重要的意义。
4.在诸多口腔癌标志物中，金属基质蛋白酶-1(mmp-1)被认为是最有前途的一个检测指标，大多数口腔癌患者唾液中mmp-1的含量比对照组高约83倍，具有较高的区分度，其灵敏度和特异性分别为69.5％和95％。由于检测的样品是唾液，检测基本无创，简单易行，方便居家检测，mmp-1是一种较理想的检测指标。
5.综合研究表明，mmp-1是最早被鉴定的mmp家族成员，该家族基因主要编码中心粒细胞胶原酶；参与细胞外基质的重构，与肿瘤发生过程的迁移、激动及炎症密切相关；其他一些癌症组织中，mmp-1的表达也会上升。人体内编码该家族蛋白的基因有24个，具有较高的同源性，给mmp-1特异性的抗体及后续检测试剂盒的研发带来巨大挑战。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提出了一种口腔癌标志物线性表位融合肽及其应用，该口腔癌标志物线性表位融合肽可与t细胞表位融合，以促进免疫反应的发生，产生的抗血清具有较高的亲和力和特异性，为进一步制备高亲和力的单克隆抗体和检测试剂盒的开发打下良好基础，融合肽1和融合肽2通过化学偶联处理，可替代全长的mmp-1作为检测试剂盒的校准品。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种口腔癌标志物线性表位融合肽，包括融合肽1和融合肽2；
9.所述融合肽1的核苷酸序列为：
10.skdqikkltslknklerrqnrsqnpvqpigpqtpkacdsk；
11.所述融合肽2的核苷酸序列为：
12.skdqikkltslknklerrqnederwtnnfreynl。
13.优选地，所述融合肽1和融合肽2从基质金属蛋白酶-1中提取或通过化学合成方法
获得。
14.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将融合肽1和融合肽2偶联于载体蛋白或者与t细胞表位融合，用于免疫动物来获得mmp-1特异性的免疫血清或进一步制备多克隆抗体和单克隆抗体。
15.优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白bsa或血蓝蛋白klh；所述t细胞表位是一种疟疾来源的小分子短肽，该小分子短肽的核苷酸序列为：
16.skdqikkltslknklerrqn。
17.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将所述融合肽1和融合肽2用于mmp-1的抗原或抗体的检测。
18.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将所述融合肽1和融合肽2通过化学偶联处理，替代全长的mmp-1作为检测试剂盒的校准品。
19.采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：本发明的融合肽1和融合肽2由于肽段较短，适合通过化学合成的方法获得，获取简单方便，成本较低；口腔癌标志物线性表位融合肽可与t细胞表位融合，以促进免疫反应的发生，产生的抗血清具有较高的亲和力和特异性，为进一步制备高亲和力的单克隆抗体和检测试剂盒的开发打下良好基础，同时线性表位的完全抗原的合成，包含t细胞表位及线性表位，有利于产生高效价的血清，且由于表位单一，减少不必要的抗体的生产，有利于特异性抗体的生产；此外，融合肽1和融合肽2通过化学偶联处理，可替代全长的mmp-1作为检测试剂盒的校准品。
附图说明
20.图1为mmp-1与mmp-8的同源性分析，其中框住的为两个线性表位；
21.图2为本发明的融合肽1和融合肽2在mmp-1结构中的位置图；
22.图3为本发明的融合肽1免疫血清对mmp-1和mmp-8的免疫滴度图；
23.图4为本发明的融合肽2免疫血清对mmp-1和mmp-8的免疫滴度图。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.参见图1至图4，一种口腔癌标志物线性表位融合肽，包括融合肽1和融合肽2；
26.所述融合肽1的核苷酸序列为：
27.skdqikkltslknklerrqnrsqnpvqpigpqtpkacdsk；
28.所述融合肽2的核苷酸序列为：
29.skdqikkltslknklerrqnederwtnnfreynl。
30.所述融合肽1和融合肽2从基质金属蛋白酶-1中提取或通过化学合成方法获得。
31.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将融合肽1和融合肽2偶联于载体蛋白或者与t细胞表位融合，用于免疫动物来获得mmp-1特异性的免疫血清或进一步制备多克隆抗体和单克隆抗体。
32.所述载体蛋白为牛血清白蛋白bsa或血蓝蛋白klh；所述t细胞表位是一种疟疾来
源的小分子短肽，该小分子短肽的核苷酸序列为：
33.skdqikkltslknklerrqn。
34.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将所述融合肽1和融合肽2用于mmp-1的抗原或抗体的检测。
35.一种口腔癌标志物线性表位融合肽的应用，将所述融合肽1和融合肽2通过化学偶联处理，替代全长的mmp-1作为检测试剂盒的校准品。
36.1、小鼠免疫试验
37.在6-8周龄的balb/c小鼠首次免疫时，取融合肽1、融合肽2作为免疫原稀释至1mg/ml(用0.01mol/l pbs缓冲液稀释)，分别与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化。乳化好的抗原，分别采用颈背部皮下多点接种的方式接种小鼠3只，接种抗原剂量为50μg/只，每只0.1ml；14天后进行第2次免疫，用弗氏不完全佐剂与免疫原等体积乳化，免疫剂量和首次免疫剂量相同，加强免疫次数为4次。
38.2、免疫效价的鉴定
39.五免一周后尾尖采血200μl，离心，收集血清，采用酶联免疫吸附实验(elisa法)测血清效价。
40.1)抗血清效价的测定，其步骤如下：
41.(1)包被：将mmp-1和mmp-8蛋白分别用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液(ph9.6)稀释成10μg/ml，按100μl/孔加入到酶标板中，置于37℃温箱中孵育2小时。倾去孔内液体，用pbst缓冲液(ph 7.2)洗板3次，甩干洗涤液。
42.(2)封闭：每孔加150μl的封闭液(5％bsa)，37℃封闭1h，甩干孔内液体，用pbst缓冲液(ph 7.2)洗板3次，拍干洗涤液。
43.(3)加抗血清：各列孔加入100μl用封闭液(5％bsa)稀释后的抗血清，抗体从1:1000开始，以2为梯度用0.01m pbs脱脂奶粉溶液开始稀释，共稀释8个梯度。加样量为每孔100μl，37℃孵育60min，pbst缓冲液(ph 7.2)洗涤3次，拍干。同时设置未经免疫的小鼠血清作为阴性对照。
44.(4)加酶标二抗：每孔加入100μl hrp-羊抗鼠igg(pbs稀释5000倍)，37℃孵育30min，pbst缓冲液(ph 7.2)洗涤3次，拍干。
45.(5)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺溶液和质量分数为30％的过氧化氢按照1:1的体积比混合，每孔100μl，37℃孵育15min。然后每孔加入50μl的终止液(2mol/l h2so4)。
46.(6)读数测定：在波长450nm条件下用酶标仪读取吸光值(od)。以阴性对照的od的2.5倍对对应的稀释度为抗血清效价，测试结果如图3和图4所示，图中bx表示融合表位x，-x-表示小鼠编号，mmp-x表示mmp家族蛋白成员。
47.结果表明，本发明的融合肽1和融合肽2可以促进免疫反应的发生，产生的抗血清具有较高的亲和力和特异性，为进一步制备高亲和力的单克隆抗体和检测试剂盒的开发打下良好基础，融合肽1和融合肽2通过化学偶联处理，可替代全长的mmp-1作为检测试剂盒的校准品。
48.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，
都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。