一种法国梧桐花粉过敏原磷酸丙糖异构酶及其应用

1.本发明属于分子生物学、免疫学和生物信息学领域，特别涉及一种法国梧桐花粉过敏原磷酸丙糖异构酶及其应用。


背景技术：

2.过敏性疾病，又称变态反应性疾病，是一种常见的慢性炎症性疾病。据统计，全世界有30%~40%的人群被过敏问题困扰，过敏性疾病成为全球第六大疾病。其中以ige介导的过敏性疾病最为常见，包括哮喘、鼻炎、严重过敏反应、药物过敏、食物过敏、湿疹、荨麻疹和血管性水肿等。花粉是最重要的空气过敏原之一，花粉症是指由花粉变应原引起的ige介导的累及呼吸道、皮肤等系统的过敏性疾病，发病率逐年升高，特别是在工业地区。
3.法国梧桐被作为城市观赏树木在西欧、北美等地广泛种植，在中国的许多城市如上海、南京、武汉等也作为行道树随处可见。其传粉期短而密集，近年来，花粉浓度显著增加，致敏率在世界各地从2%-56%不等，被认为是引起花粉症的重要原因之一。在过去的10年里，人们对法国梧桐花粉进行了广泛的研究，特别是在西欧城市，并从提取物中鉴定出四种过敏原，分别是pla a 1, pla a 2, pla a 3和pla a profilin，但其中仍有新过敏原存在。
4.目前，过敏原的诊断和免疫治疗仍然主要基于过敏原的粗提物，这些粗提物都是成分复杂的混合物。因此，鉴定和分离ige介导的过敏原是一项必要的任务，以提高对这种日益增加的临床疾病的诊断和治疗。新致敏组分的发现无疑丰富了梧桐花粉过敏原的组分信息，有利于梧桐花粉过敏的诊断和治疗的精准化和个体化，随着科学技术的发展和对梧桐花粉过敏原组份的不断深入研究，成分清晰且作用机理明确的新型过敏原疫苗有望成为替代花粉粗提物的治疗方案，从而高效地预防和治疗梧桐过敏性疾病。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种法国梧桐花粉的新过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶。
6.本发明还要解决的技术问题包括提供了法国梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的纯化制备、核酸或基因序列的克隆，其编码所述的法国梧桐花粉的过敏原磷酸丙糖异构酶、及其致敏性的研究应用。
7.本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌。
8.本发明还要解决的技术问题是通了法国梧桐花粉的过敏原、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌株在用于制备诊断梧桐花粉过敏性疾病的试剂盒或预防或治疗梧桐花粉过敏性疾病的药物中的应用。
9.本发明最后要解决的技术问题是提供了一种用于预防或治疗梧桐花粉过敏症的药物或疫苗或用于过敏原诊断的试剂盒。
10.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种法国梧桐花粉的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶，所述过敏原磷酸丙糖异构酶包含：（a）如seq id no：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、修饰、缺失或添加一个或几个氨基酸且具具有过敏原活性、低过敏原活性的蛋白质；或（c）与（a）中的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列所组成的具有过敏原活性的蛋白质；或（d）与（a）的蛋白质具有免疫交叉反应性的过敏原蛋白。
11.本发明内容还包括组成如所述过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶的氨基酸，所述氨基酸包含：（2a）如seq id no：2所示的氨基酸序列；（2b）与（2a）所示的氨基酸序列至少有90%的同源性；（2c）与（2a）所示的氨基酸序列的互补序列，以及该互补序列杂交组成的活性过敏原蛋白。
12.本发明内容还包括编码所述的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶或所述的氨基酸的核酸或基因，所述核酸或基因包含：（3a）如seq id no：1所示的核苷酸序列；（3b）与（3a）中的核苷酸序列至少有90%的同源性；（3c）与（3a）核苷酸序列互补的单链dna或者rna序列。
13.本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌，其包含所述的核酸或基因。
14.本发明内容还包括所述的法国梧桐花粉的过敏原磷酸丙糖异构酶、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白或重组细胞在用于制备诊断梧桐花粉过敏性疾病的试剂盒或预防或治疗梧桐花粉过敏性疾病的药物中的应用。
15.本发明内容还包括所述的法国梧桐花粉的过敏原磷酸丙糖异构酶、所述的氨基酸、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌在制备检测患者血清中的磷酸丙糖异构酶特异性ige含量的药物或试剂中的应用。
16.本发明内容还包括任何涉及以下（d）~（f）中的用于预防、诊断、治疗过敏性疾病的制剂：（d）以所述的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶、所述的氨基酸或所述的核苷酸作为有效成分的预防或治疗剂；（e）源自所述的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶的具有免疫调控性的t-细胞反应性多肽片段、b-细胞反应性多肽片段、多肽片段与载体蛋白融合构建的蛋白或多核苷酸的至少一种作为有效成分的预防或治疗剂；（f）源自所述的过敏原蛋白的特异性治疗抗体，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化改性抗体中的一种。
17.本发明内容还包括一种用于预防或治疗过敏性疾病的药物，所述药物为单方或复方制剂，其包括所述的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶、所述的氨基酸或所述的核酸或基因。
18.其中，所述药物为过敏原疫苗。所述过敏原疫苗包括dna疫苗、重组活菌疫苗和重
组蛋白疫苗。
19.本发明内容还包括一种用于过敏原诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述的过敏原蛋白磷酸丙糖异构酶、所述的氨基酸或所述的核酸或基因。
20.其中，所述试剂盒还包括吸附或连接所述的过敏原的固相载体。
21.有益效果：本发明通过对梧桐花粉中的过敏原组分进行挖掘，最终通过传统的色谱分离纯化与串联质谱鉴定技术结合的方法从梧桐花粉过敏原中鉴定到一种新的具有血清特异性ige结合活性的组分，其为法国梧桐花粉的过敏原磷酸丙糖异构酶的基因序列及其氨基酸序列。通过对该过敏原磷酸丙糖异构酶进行研究发现，其可以通过制备过敏原疫苗或相关药物用于过敏性疾病的脱敏治疗和预防。因此以上发明对临床诊断和治疗梧桐花粉过敏患者均具有重要价值。
附图说明
22.图1a是在hitrap q hp阴离子交换柱上对梧桐花粉提取物的洗脱图谱，用箭头标记的部分被合并起来用于进一步纯化的，黑色框中是含有梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的部分。
23.图1b是合并后在superdex g75 increase色谱柱上的洗脱图，其中5-6部分（黑框标出）是含有梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的部分。
24.图1c是合并后的组分在1ml hitrap sp hp柱上纯化的图谱，黑色框标记的部分为纯化得到的梧桐花粉磷酸丙糖异构酶蛋白。
25.图2是nano-lc ms/ms 分析得到的梧桐花粉磷酸丙糖异构酶蛋白的肽段，共12个。
26.图3是编码梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的序列扩增产物电泳图，最左侧m泳道为dna 2000 maker；1-10号泳道为pcr扩增产物。
27.图4是编码梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的cdna序列和相应的氨基酸序列，下划线和粗体标示部分是lc-ms/ms鉴定到的肽段。
28.图5是elisa法验证梧桐花粉磷酸丙糖异构酶与梧桐花粉过敏患者血清中特异性ige的结合活性，在58例梧桐花粉过敏患者的血清中，24例呈阳性反应。
具体实施方式
29.一、花粉过敏原蛋白本发明提供的花粉过敏原蛋白是选自以下的（a）~（c）的蛋白质。
30.（a）包含由序列2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；（b）包含由序列2所示的氨基酸序列中任何氨基酸被取代、修饰、缺失或添加而成的氨基酸序列所构成的具有过敏原活性、低过敏原活性的蛋白质；（c）包含与序列2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列所构成的具有过敏原活性的蛋白质，或与序列2所示的氨基酸序列构成的蛋白质具有免疫交叉反应性的过敏原蛋白。
31.二、构成花粉过敏原蛋白的氨基酸本发明的氨基酸为构成上述花粉过敏原蛋白的氨基酸序列，包含以下（a）~（c）所述过敏原的氨基酸。
32.（a）包含序列2所示的氨基酸序列；（b）与所述的氨基酸序列2至少有90%的同源性；（c）包含序列2所示的氨基酸序列的互补序列，以及该互补序列杂交构成的活性过敏原蛋白；三、编码花粉过敏原蛋白的核苷酸序列本发明的核苷酸为编码上述花粉过敏原蛋白的核苷酸序列，包含以下（a）~（c）所述的核苷酸序列。
33.（a）包含序列1所示的核苷酸序列；（b）与所述的核苷酸序列1至少有90%的同源性；（c）与所述的核苷酸序列1互补的单链dna或者rna序列四、编码花粉过敏原蛋白的多核苷酸的获得本发明的编码花粉蛋白的多核苷酸能够通过克隆获得，克隆方法没有限定。
34.五、花粉过敏原蛋白的制造本发明的过敏原蛋白由梧桐花粉浸提物通过分离纯化得到。分离纯化方法没有特别限定。
35.还可以将本发明的多核苷酸插入载体中制作的重组质粒导入宿主细胞内，使花粉过敏原蛋白在细胞内或细胞外表达而收集。本发明所述载体和宿主没有特别限定。
36.用于插入本发明的多核苷酸的载体只要能够在上述的宿主中复制，就没有特别限定，可以根据所导入的宿主的种类、导入方法等适当决定。
37.六、过敏性疾病的预防、诊断或治疗剂本发明的花粉过敏原蛋白可以用于生产过敏性疾病的预防或治疗剂，所述过敏性疾病包括外界特异抗原引起的所有的过敏性疾病；将本发明所述过敏性疾病的预防或治疗剂包括：（a）将本发明的花粉过敏原蛋白直接使用、或者干燥而成粉末状;（b）根据需要通过添加各种辅料，例如稳定剂、赋形剂、溶解辅助剂、乳浊剂、缓冲剂、无痛剂、保存剂、着色剂等而成的制剂。
38.七、花粉过敏原蛋白的抗体本发明的花粉过敏原蛋白的抗体是能够与本发明的花粉过敏原蛋白特异性结合的抗体。上述抗体是指免疫球蛋白(iga、igd、ige、igg、igm和它们的fab片段、f(ab')2片段、fc片段)，例如可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体(anti-idiotype antibody)和人源化抗体，但并不限定于此。
39.上述抗体可以使用各种公知的方法制作，制作方法没有特别限定。
40.上述抗体可以用于表达本发明的花粉过敏原蛋白的生物体或其组织或细胞的鉴定等。
41.以下，利用实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。
42.实施例1
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法国梧桐花粉过敏原磷酸丙糖异构酶的纯化称取8.0 g梧桐花粉提取总蛋白：首先将花粉与60 ml 0.01 m磷酸盐缓冲液(pbs)混合，加入终浓度为1 mm 蛋白酶抑制剂（pmsf）在4℃颠倒孵育过夜，12000
×
g离心后收集上清，0.22μm膜过滤备用。
43.梧桐花粉中磷酸丙糖异构酶的纯化：梧桐花粉提取物在
ä
kta-go系统(ge healthcare, uppsala, sweden)上通过阴离子交换、凝胶过滤和阳离子交换的层析步骤分离。具体地，先将花粉粗提物以0.02 m tris-hcl、ph 8.4平衡的hitrap脱盐柱进行脱盐，收集的组分在与上述相同缓冲液预平衡的hitrap q hp柱上吸附(uppsala, sweden)，吸附的蛋白用含有1m 氯化钠的0.02 m tris
–
hcl溶液按梯度0%到100%洗脱。洗脱的组分通过sds-page电泳和考马斯亮蓝r250染色，将蛋白分布相似的部分合并后于superdex g75分离，该柱用含有150 mm氯化钠的50 mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)平衡，以0.5 ml/min的流速洗脱，用sds-page对所得组分进行分析合并进行下一步的分离。合并的部分被进一步吸附到1ml hitrap s hp（uppsala, sweden）柱上，用 50 mm 2-吗啉乙磺酸，ph 6.0，流速1ml/min进行洗脱，用sds-page电泳分析，最终纯化出一种在sds-page上以单个条带的迁移至约27kda处。
44.实施例2
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内部肽段鉴定通过lc-ms/ms鉴定ige结合蛋白：首先在sds-page上分离实施例1中纯化得到的27 kda的蛋白，用考马斯亮蓝r250染色。从凝胶中切取蛋白带，用胰蛋白酶消化后进行质谱分析，使用pfind软件对原始数据进行分析得到12个内部肽段，其对氨基酸全长的覆盖率为89.3%。
45.实施例3 梧桐花粉磷酸丙糖异构酶全长cdna的克隆我们通过pfind软件对质谱结果进行分析，获得了内部肽段。将肽段与高通量花粉转录组测序结果进行匹配，得到编码梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的理论cdna序列，并通过t-a克隆和sanger测序进一步确认该序列。具体地，首先提取梧桐花粉总rna，逆转录得到cdnas。根据匹配得到的理论梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的cdna序列，设计pcr扩增的引物，上游引物为5 '
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ctctagccttactgtgtt-3 '，下游引物为5 '
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cccatacctgattccaag-3 '，以25μl的体系进行实际序列的pcr扩增：extaq酶（0.125 μl）、10
×
extaq buffer（2.5μl）、dntp混合物（2μl）、梧桐花粉cdna产物（1μl）、上游引物和下游引物混合物（1μl）、灭菌蒸馏水补充至25μl。pcr 扩增条件是 98
°
c/5s （一个循环）进行预变性, 98
°
c/10s变性, 55
°
c/30s退火 and 72
°
c/1min延伸 (30 个循环), 72
°
c/10min再延伸 (一个循环)。将pcr扩增产物回收、纯化并连接到pce2 ta/blunt-zero质粒载体上，转化至jm109感受态细胞。在含有100
µ
g/ ml卡那霉素的luria-bertani (lb)平板上筛选阳性克隆菌，并通过dna测序确认，得到梧桐花粉磷酸丙糖异构酶天然蛋白实际序列，该基因全长762 bp，编码253个氨基酸，理论分子量为27kda。氨基酸序列如seq id no.2所示。
46.进一步进行重组反应。首先，利用clonexpress ii one step cloning kit（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）试剂盒（操作步骤参照其试剂盒提供的说明书）提取上述梧桐花粉磷酸丙糖异构酶克隆菌的质粒以及pet28a大肠杆菌的质粒，然后将克隆菌的编码区核苷酸序列通过重组反应连接至pet28a+质粒的ncoi和xhoi位点之间得到重组质粒，重组质粒经热激转化至bl21（de3）宿主菌（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）进行平板克隆，挑取单克隆菌落在液体培养基中37℃培养，再次进行测序确认质粒成功构建。
47.实施例4
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elisa实验证明梧桐花粉磷酸丙糖异构酶的致敏性96孔板中包被实施例1制备得到的梧桐花粉磷酸丙糖异构酶过夜。然后用含1% 牛
血清白蛋白（bsa）的pbst（含0.1%吐温20的pbs）溶液在37℃下封闭1.5h。用pbst洗涤后加入58例梧桐花粉过敏患者血清（血清来源于江苏省人民医院），37℃孵育1.5 h。非过敏患者血清为阴性对照。用100 μl抗人ige-辣根过氧化物酶结合物（1：2500稀释）在室温下孵育1 h。洗涤后加入显色液13分钟后终止，酶标仪od450检测。结果显示58例梧桐过敏患者的血清中，24例对梧桐花粉磷酸丙糖异构酶呈阳性反应，其致敏率在梧桐过敏患者中为41%。