一种稳定表达Luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用

一种稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤生物学和肿瘤治疗学技术领域，具体涉及一种稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.乳腺癌是目前发病率和死亡率最高的妇科恶性肿瘤，且于2020年发病率首次取代肺癌成为全球第一大癌症，占所有新增癌症患者的11.7％，其中超过50％的乳腺癌患者雌激素受体阳性，该类乳腺癌的治疗也成为人们关注的焦点。传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。因此，针对不同分子遗传学背景的群体或/和个体，根据其分子特点进行有选择性的“个体化”治疗，以使疗效达到最优化，毒性最低化。内分泌治疗在雌激素受体阳性患者的临床治疗中成为主流疗法，且表现出了良好的疗效，有力改善患者临床结局，但大部分患者在接受内分泌治疗肿瘤消退后的5年甚至更长时间后出现复发，且针对此类晚期乳腺癌患者，他莫昔芬作为其主流临床的内分泌药物，在改善患者预后方面非常有限，这类患者通常即使服用药物，生存期也只有1-2年，临床结局不佳。他莫昔芬耐药是雌激素受体阳性乳腺癌临床治疗的一大挑战。
3.目前国内尚无模拟临床体内构建的他莫昔芬耐药细胞株，仅有的耐药模型并未模拟临床进行耐药方向的建模，且细胞株产生多药耐药，致使耐药机制复杂，影响因素过多，不利于对单一药物引起的肿瘤耐药及转移的研究。
4.随着肿瘤研究的深入，应用传统方法(如卡尺测量肿瘤体积、肿瘤组织切片等)进行肿瘤研究已存在诸多限制。如进行组织切片观测前需要处死小鼠取出肿瘤组织，因此，在不同时间点或不同实验组都需要处死一批实验小鼠以获取足够的统计学数据，这样不但大大增加了实验成本，而且很难消除由于小鼠个体差异而产生的误差，无法获取可靠的重复性数据，在制作切片时也无法保证实验的准确性。另外，微小转移灶也很难被传统手段检测到。
5.荧光素酶(luciferase)是一类产生生物发光的氧化酶，可以在实验室中通过基因工程生产，并被用于多种目的，荧光素酶基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中。在萤光素酶反应中，当萤光素酶作用于合适的萤光素底物时会发光，而发出的光子可以通过光敏设备，如光度计或改进的光学显微镜检测，这就使得对于生物过程观察成为可能。由于荧光素酶生物发光不需要光激发，因此自发荧光很小，因此几乎没有背景荧光。表达荧光素酶的细胞移植到动物身上时，可进行全动物体内活体成像，是研究活体动物(如小鼠)细胞群的强大技术。这种技术已被应用于动物模型中跟踪肿瘤发生和肿瘤对治疗的反应，尤其对微小转移灶具有更高敏感性。


技术实现要素：

6.本发明为了解决现有技术中的不足和缺点，提出一种他莫昔芬耐药细胞株及其构
建方法和应用。本发明通过使用表达luciferase的载体质粒转染mcf7细胞系并进行稳定筛选，以表达此载体的mcf7细胞系构建小鼠来源的细胞他莫昔芬耐药模型，可稳定标记与活体示踪，用于后期他莫昔芬治疗压力下耐药转移等方向的深入研究，为开发内分泌治疗耐受的雌激素受体阳性乳腺癌患者的新治疗策略提供参考。本发明模拟雌激素受体阳性乳腺癌患者主要内分泌药物他莫昔芬的临床给药，创新性地从体内构建他莫昔芬耐药模型。
7.本发明的具体技术方案如下：
8.本发明第一方面提供一种稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株的构建方法，包括如下步骤：
9.(1)转染表达荧光素酶基因的载体进入mcf7细胞，筛选稳定表达荧光素酶基因的mcf7细胞；
10.(2)将步骤(1)所述稳定表达荧光素酶基因的mcf7细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，肿瘤大小超过100mm3时，注射不断增大剂量的他莫昔芬治疗，肿瘤在治疗期间形成持续增殖的肿瘤块，取出该肿瘤块原代培养，获得的细胞即为稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞。
11.进一步地，步骤(2)中，当裸鼠成瘤后肿瘤大小超过100mm3时，依次分别按照5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗各1周，此后以50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗6周。
12.本发明第二方面提供上述构建方法构建获得的稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株。
13.本发明第三方面提供一种稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株，其分类命名为人源雌激素受体阳性乳腺癌细胞cs-mcf7-tr，保藏编号为cctcc no:c2022118。
14.本发明第四方面提供所述稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤耐药或转移机制研究的细胞模型的应用。
15.本发明第五方面提供所述稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤靶向治疗位点筛选细胞模型的应用。
16.本发明第六方面提供所述稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为肿瘤靶向治疗药物筛选细胞模型的应用。
17.上述的应用中，所述肿瘤为晚期雌激素受体阳性乳腺癌。
18.进一步地，所述稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为他莫昔芬耐药肿瘤的靶向治疗位点筛选细胞模型的应用。
19.进一步地，所述稳定表达luciferase的他莫昔芬耐药细胞株作为他莫昔芬耐药肿瘤的靶向治疗药物筛选细胞模型的应用。
20.本发明的有益效果为：
21.1、本发明提供的他莫昔芬耐药细胞株的体内构建方法，通过生物学手段，转染表达荧光素酶基因的载体进入肿瘤细胞，筛选稳定表达荧光素酶基因的肿瘤细胞进行裸鼠原位异种移植成瘤实验，裸鼠成瘤后，注射肿瘤内分泌治疗药物他莫昔芬治疗。治疗结束后，取出稳定增殖的肿瘤块，进行原代培养，验证细胞他莫昔芬耐受特性，得到他莫昔芬耐药细胞株。一方面，该构建方法模拟雌激素受体阳性乳腺癌患者主要内分泌药物他莫昔芬的临床给药，创新性地从体内构建他莫昔芬耐药细胞模型，克服了当前从人体直接分离雌激素
受体阳性乳癌病灶组织难以在小鼠体内成瘤建模的问题；且该构建方法可以针对单一药物引起的肿瘤耐药及转移进行研究，专一性强；另一方面，细胞内稳定表达的荧光素酶可稳定标记与活体示踪，尤其对微小转移灶具有更高敏感性，便于后期他莫昔芬治疗压力下复发转移等方向的深入研究，为开发晚期雌激素受体阳性乳腺癌患者的新治疗策略提供参考。
22.2、本发明提供的体内构建的他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr，相对于亲本细胞的他莫昔芬耐受性明显增强。一方面，建模过程和临床给药高度贴合，有利于研发雌激素受体阳性乳腺癌晚期患者内分泌治疗抵抗的临床肿瘤转移和耐药的分子机制，进行相关生物学研究和挖掘新的治疗策略，期望有效改善晚期雌激素受体阳性乳腺癌患者的预后和临床结局。另一方面，细胞内稳定表达的荧光素酶可稳定标记与活体示踪，进行肿瘤早期观测及微小转移灶的观测，既能对活体癌组织生长进行连续监测并进行定量分析，又能在离体的肿瘤组织及体外共培养体系中标识癌细胞以便于准确的定性和定量，还能更灵敏的发现残余病灶点或尽早发现肿瘤的复发，从而更准确的对药物治疗效果进行判定。他莫昔芬诱导的人源雌激素受体阳性乳腺癌的耐药细胞株cs-mcf7-tr可视化效果更佳，为研究相关机制、靶点探索和新药筛选提供了更为合理的实验模型。
附图说明
23.图1为他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr的构建流程图。
24.图2为他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr细胞的形态学观察。
25.图3为不同浓度他莫昔芬下亲本细胞、耐药细胞株cs-mcf7-tr的细胞存活情况。
26.保藏说明
27.他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr，分类命名为人源雌激素受体阳性乳腺癌细胞cs-mcf7-tr，于2022年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:c2022118。
具体实施方式
28.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
29.术语：
30.mcf7细胞：人乳腺癌细胞
31.fbs：胎牛血清
32.g418：遗传霉素
33.d-luciferin：萤虫素(d-虫荧光素)
34.实施例1
35.他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr的构建流程如图1，具体包括如下步骤：
36.(1)筛选稳定表达荧光素酶基因的mcf7细胞
37.构建含荧光素酶基因的表达载体，备用。载体的构建参照试剂盒中说明书。
38.将mcf7细胞接种于6孔板，当细胞汇合度达80％时进行瞬时转染。6孔板各孔以质
粒dna2μg、脂质体6μl进行转染，37℃、5％co2孵育24h。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。mcf7细胞转染72h后吸弃上清液，加入含有10％fbs、800μg/ml g418的rpmi 1640培养基，培养约3周，其间换液，去除死亡的细胞，筛选出稳定表达luciferase的细胞(命名为luc-mcf7)。
39.检测稳定表达luciferase细胞系生物发光：活性消化计数luc-mcf7细胞，以0.25
×
106个、0.5
×
106个、1
×
106个、1.5
×
106个、2
×
106个细胞分别接种至6孔板，预留一孔仅添加培养基作为空白对照。细胞贴壁过夜后，于6孔板每孔添加15mg/mld-luciferin，轻轻摇匀置于lumina成像系统进行检测。lumina成像结果表明，筛选的luc-mcf7细胞能够稳定表达luciferase。
40.(2)原位异种移植物成瘤实验
41.取6只4周龄balb/c雌性裸鼠，分为2组，每组3只，分别为对照组、耐药实验组，检疫一周，种植雌激素缓释片，一周后在裸鼠身上通过原位移植进行接种肿瘤细胞luc-mcf7(5
×
106万细胞/只)，每天用游标卡尺测量肿瘤大小，每周进行2次活体成像观察肿瘤大小。当肿瘤大小超过100mm3时，耐药实验组依次分别按照5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗各1周，此后以50mg/kg剂量腹腔注射给予他莫昔芬治疗持续6周，肿瘤在治疗期间形成持续增殖的肿瘤块。
42.对照组当肿瘤大小超过100mm3时，持续给予与耐药实验组等量的药物溶剂，待肿瘤长大至1000mm3时，牺牲小鼠，取出肿瘤进行原代培养，此细胞为亲本细胞。
43.(3)获得他莫昔芬耐药细胞株
44.10周治疗结束后，取出耐药实验组持续增殖的肿瘤块进行原代培养，获得的细胞即为他莫昔芬耐药细胞，命名为cs-mcf7-tr，保藏编号为cctcc no:c2022118。
45.实验例1：他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr细胞的形态学观察
46.使用倒置相差显微镜观察活细胞形态：取对数生长期的cs-mcf7-tr细胞，在倒置显微镜放大200倍下观察活细胞形态，如图2所示。
47.通过光镜可以观察到cs-mcf7-tr细胞大小和形状较为一致，成片生长。
48.实验例2：他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr细胞对他莫昔芬耐药指数的测定
49.取实施例1获取的他莫昔芬耐药细胞cs-mcf7-tr和亲本细胞，在含有2％胎牛血清的rpmi1640培养基中培养，培养至对数生长期，用0.25％腆蛋白酶消化并计数，用1640培养液调整细胞浓度至2
×
104/ml。同时设置仅接种细胞的无药对照孔和仅加培养液的调零孔。在96孔板的每个孔中分别接种0.1ml单细胞悬液，每个孔含2000个细胞，置于培养箱中培养过夜。吸弃每孔中的上清液，pbs洗一次，之后加入含他莫昔芬的细胞培养液0.1m1，他莫昔芬的浓度梯度如表1，每一种药物的浓度设3个复孔。表中的化疗药物浓度是经过多次测定确定的稳定浓度范围，每次耐药指数测定3次，该范围可能根据会有小幅度的调整，以利于更准确的测定耐药指数。
50.表1他莫昔芬的给药浓度
[0051][0052]
96孔板放入培养箱培养72h后，在200倍倒置显微镜下计数每孔活细胞数量，每3个
复孔取其平均值。不同浓度他莫昔芬下亲本细胞、他莫昔芬耐药细胞株cs-mcf7-tr的细胞存活，如图3。用软件graphpad primer5计算药物的半数抑制率ic50，结果如表2。结果表明休他莫昔芬耐药细胞cs-mcf7-tr对他莫昔芬的耐受程度约是亲本细胞的70倍，为高度耐受他莫昔芬的细胞。
[0053]
表2他莫昔芬对不同组细胞的半数抑制浓度测定
[0054][0055]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。