一种快速制备TaqDNA聚合酶的方法与流程

一种快速制备taq dna聚合酶的方法
技术领域
1.本发明属于聚合酶制备技术领域，具体涉及一种快速制备taqdna聚合酶的方法。


背景技术：

2.dna聚合酶是pcr反应体系中的重要物质。常见的几种dna聚合酶有taq dna聚合酶、pfu dna聚合酶、tth dna聚合酶、tfi dna聚合酶等。其中taq dna聚合酶是发现最早也是目前应用最广泛的dna聚合酶。最早是t.d.brock在1969年从美国黄石国家森林公园的火山温泉中分离得到的一种水生栖热菌(thermus aquaticus)yt-1，生长在70℃-75℃富含矿物质的环境中。在1976年从中提取了taq dna聚合酶，应用到pcr技术上。但是水生嗜热菌yt-1培养困难，而且taq dna聚合酶的产量低，难以满足pcr技术的需求。同样的在美国黄石国家森林公园，1988年saiki和mullis等又在火山温泉中分离出另一株水生嗜热杆菌，并从中提取了一种耐热的dna聚合酶，在93℃-95℃仍有稳定的酶活，这样在pcr反应中不需要每个循环都停下来添加taq dna聚合酶，这个酶在温度降低到75℃时酶活最大，提高了pcr的效率，降低了反应成本，从而使pcr技术得到了广泛推广应用。
3.随着pcr技术的推广，对聚合酶的需求逐渐增大，市场上的一些商业dna聚合酶在使用过程中会发现外源dna也随着循环被扩增，对于外源dna去除，要既不影响产量，又能控制在有效范围内，适应商业化生产，因而，在taq dna聚合酶制备过程中高产率，高纯度的制备方法是非常重要的。
4.重组的大肠杆菌融合表达taq dna聚合酶，胞内表达，需要将大肠杆菌细胞破碎提取蛋白，破碎细胞后，胞内的杂蛋白、核酸等，以及细胞膜碎片等杂质较多，使得纯化的过程中除杂困难，杂蛋白较多，影响taq dna聚合酶酶活，外源dna的污染会导致在pcr反应中，外源dna也随着反应扩增。在粗纯过程中增加高盐处理裂解液，使核酸碎片打开，不附着在蛋白上，接着做亲和纯化，在纯化过程中使用去污剂tritonx-114洗涤以去除残余的核酸和细胞膜，进一步去除外源dna。根据taq dna聚合酶蛋白的性质，例如等电点来调整纯化过程中的溶液ph，以及目标蛋白的咪唑洗脱浓度的优化等来提高蛋白的纯度。


技术实现要素：

5.针对上述背景技术所提出的问题，本发明的目的是：旨在提供。
6.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种快速制备taq dna聚合酶的方法，包括以下步骤，
8.s1：菌种制备；
9.含有taq dna聚合酶基因序列的质粒dna转入大肠杆菌(bl21(de3))中，经过平板划线培养后挑取单克隆，经过筛选，选取生长最快、蛋白表达最好菌株保存菌种，加入甘油，分装后-80
±
1℃冰箱保存；
10.s2：发酵培养；
11.将s1得到的甘油菌接种至2
×
yt培养基中，经一级种子培养后扩大培养并达到一
定菌浓后做诱导培养，结束后，使用离心机收集菌体；
12.s3：菌体破碎；
13.将s2离心后的菌体用裂解液缓冲液重悬，使用超声波细胞破碎仪将细菌破碎，释放出细胞内的所有蛋白质及其他杂质，再置于70
±
1℃水浴锅中孵育30
±
2min以去除热变性的杂质蛋白，离心收集上清即为蛋白裂解液；
14.s4：蛋白纯化；
15.将蛋白裂解液经ni-nta亲和纯化柱洗脱溶液除杂后，再用含高浓度的咪唑洗脱液洗脱下目标蛋白并收集；
16.s5：透析；
17.将纯化得的蛋白液经透析换液和复性，检测蛋白纯度和酶活，合格后进行制剂和分装，并保存在-80
±
1℃冰箱，得到taq dna聚合酶。
18.作为本发明发一种优选方案，所述s1中，筛选的次数至少两次。
19.作为本发明发一种优选方案，所述s2和s3中，离心机工作的时间为2～3min。
20.作为本发明发一种优选方案，所述s4中ni-nta亲和纯化柱洗脱的次数不低于三次。
21.作为本发明发一种优选方案，所述高浓度的咪唑洗脱液为300mm咪唑浓度的洗脱液。
22.本发明的有益效果：
23.1、简单，快速，收率高；
24.2、通过一步亲和，成本低，易操作；
25.3、高效的去除外源dna，且不影响产品收率，
26.4、此方法适用范围广，包括其他的重组蛋白。
附图说明
27.本发明可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明；
28.图1为本发明一种快速制备taq dna聚合酶的方法实施例的工艺流程示意图。
具体实施方式
29.为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。
30.实施例1：
31.如图1所示，一种快速制备taq dna聚合酶的方法，包括以下步骤，
32.s1：菌种制备；
33.含有taq dna聚合酶基因序列的质粒dna转入大肠杆菌(bl21(de3))中，经过平板划线培养后挑取单克隆，经过三次筛选，选取生长最快、蛋白表达最好菌株保存菌种，加入甘油，分装后-80℃冰箱保存；
34.s2：发酵培养；
35.将s1得到的甘油菌接种至2
×
yt培养基中，经一级种子培养后扩大培养并达到一定菌浓后做诱导培养，结束后，使用离心机离心3min收集菌体，；
36.s3：菌体破碎；
37.将s2离心后的菌体用裂解液缓冲液重悬，使用超声波细胞破碎仪将细菌破碎，释放出细胞内的所有蛋白质及其他杂质，再置于70℃水浴锅中孵育30
±
2min以去除热变性的杂质蛋白，离心2.5min，收集上清即为蛋白裂解液；
38.s4：蛋白纯化；
39.将蛋白裂解液经ni-nta亲和纯化柱洗脱溶液洗涤三次除杂后，再用含高浓度的咪唑洗脱液洗脱下目标蛋白并收集；
40.s5：透析；
41.将纯化得的蛋白液经透析换液和复性，检测蛋白纯度和酶活，合格后进行制剂和分装，并保存在-80℃冰箱，得到taq dna聚合酶。
42.实施例2：
43.一种快速制备taq dna聚合酶的方法，包括以下步骤，
44.s1：菌种制备；
45.含有taq dna聚合酶基因序列的质粒dna转入大肠杆菌(bl21(de3))中，经过平板划线培养后挑取单克隆，经过两次筛选，选取生长最快、蛋白表达最好菌株保存菌种，加入甘油，分装后-80℃冰箱保存；
46.s2：发酵培养；
47.将s1得到的甘油菌接种至2
×
yt培养基中，经一级种子培养后扩大培养并达到一定菌浓后做诱导培养，结束后，使用离心机离心2.5min收集菌体，；
48.s3：菌体破碎；
49.将s2离心后的菌体用裂解液缓冲液重悬，使用超声波细胞破碎仪将细菌破碎，释放出细胞内的所有蛋白质及其他杂质，再置于70℃水浴锅中孵育30
±
2min以去除热变性的杂质蛋白，离心2min，收集上清即为蛋白裂解液；
50.s4：蛋白纯化；
51.将蛋白裂解液经ni-nta亲和纯化柱洗脱溶液洗涤三次除杂后，再用含高浓度的咪唑洗脱液洗脱下目标蛋白并收集；
52.s5：透析；
53.将纯化得的蛋白液经透析换液和复性，检测蛋白纯度和酶活，合格后进行制剂和分装，并保存在-80℃冰箱，得到taq dna聚合酶。
54.通过实施例1和实施例2得到的taq dna聚合酶经过检测，其纯度高于99.5％，适合推广。
55.上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。