一种水稻隐性雄性不育系的繁育方法

1.本发明涉及一种水稻隐性雄性不育系的繁育方法，涉及杂交水稻育种技术领域。


背景技术：

2.杂交水稻种子的生产过程需借助雄性不育水稻为母本的遗传工具，因此雄性不育是杂种优势利用的基础。长久以来，三系和两系雄性不育种质资源的发掘创制有限；而普通的隐性雄性不育系虽然败育彻底，遗传简单，但其实际生产应用比较困难，制约了杂交水稻的发展。随着最近被称为第三代杂交水稻育种技术的出现，极大地拓宽了雄性不育种质的范围。该技术通过操纵普通隐性雄性不育形成的关键核基因，建立了稳定高效，以及不育系和保持繁殖两用系一体的新型不育杂交育种体系，实现将普通隐性雄性不育种质资源改良为商业化的遗传工程雄性不育系。
3.第三代杂交水稻育种技术的关键是利用转基因技术解决普通隐性雄性不育种质自身繁殖困难的问题，即将水稻隐性雄性育性恢复元件、花粉致死元件和荧光筛选元件构建的三元载体转入隐性雄性不育种质，并经过对种子的不同荧光进行筛选，分离出不含转基因的成分的不育系。然而在实际筛选过程中，由于设计上对荧光检测设备的灵敏度、智能化和集约化要求相对较高，使得该类设备的制造成本较高，为第三代杂交水稻育种技术的大规模推广带来了一定障碍，也对发展低成本、高效的筛选方法提出了需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种水稻隐性雄性不育系的繁育方法，用于第三代杂交水稻繁种和制种中含有转基因成分的保持繁殖两用系或者不含有转基因成分的不育系的提纯去杂。
5.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
6.一种水稻隐性雄性不育系的繁育方法，包括以下步骤：
7.s1：将水稻隐性雄性育性恢复元件、花粉致死元件、除草剂a抗性筛选元件和除草剂b敏感性筛选元件构建四元转基因元件连锁表达载体；
8.s2：将s1得到的四元转基因元件连锁表达载体转化入对应水稻隐性雄性不育材料中，获得保持繁殖两用系；
9.s3：将s2得到的保持繁殖两用系自交结实，其自交后代中包括不含所述四元转基因元件的不育系和含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系；
10.s4：将s3得到的保持繁殖两用系自交结实种子采用对应类型除草剂进行筛选，去除其中的保持繁殖两用系或不育系，从而对不育系或保持繁殖两用系进行去杂提纯。
11.进一步的，所述除草剂a抗性元件由启动子、除草剂抗性筛选标记基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；所述除草剂b敏感性筛选元件由启动子、除草剂显性敏感构建及终止子依序可正常工作的相连。
12.进一步的，所述除草剂抗性筛选标记基因为bar，对应除草剂类型为草铵膦类除草
剂，所述草铵膦类除草剂包括草丁膦(glufosinate ammonium)、4-[羟基(甲基)膦酰基]-dl-高丙氨酸和2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵的任意一种或几种；来源于细菌的bar基因赋予水稻对草铵膦类除草剂抗性；
[0013]
进一步的，所述除草剂显性敏感构建基于rnai沉默技术的rnai沉默元件；
[0014]
所述rnai沉默元件由水稻内源除草剂抗性基因oshis1的cds序列和其反向互补序列以及pdk intron序列通过同源重组反应一起连入rnai沉默载体pkannibal后得到；所述cds序列如seq id no.5所示；所述反向互补序列如seq id no.6所示；
[0015]
所述水稻内源除草剂抗性基因oshis1对应类型除草剂为β-三酮类除草剂(β-triketone herbicides)，所述β三酮类除草剂包括磺草酮(sulcotrione)、呋喃磺草酮(tefuryltrione)、甲基磺草酮(mesotrione)、双环磺草酮(benzobicyclon)和环磺酮(tembotrione)中的任意一种或几种；水稻内源除草剂抗性基因oshis1的功能缺陷或下降，会使水稻对β-三酮类除草剂敏感，但不会对水稻正常生长造成影响。
[0016]
进一步的，所述s1水稻隐性雄性育性恢复元件由水稻隐性雄性育性恢复基因的启动子、基因编码区和终止子依序可正常工作的相连；
[0017]
所述水稻雄性育性恢复基因为osstrl2，基因序列如seq id no.1。
[0018]
进一步的，所述s2四元转基因元件连锁表达载体通过农杆菌介导转入具有除草剂b抗性的水稻隐性雄性不育系中。
[0019]
进一步的，所述s3保持繁殖两用系自交后代中含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系和不含所述四元转基因元件的不育系数量各占一半。
[0020]
进一步的，所述s4保持繁殖两用系自交后代中筛选含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系或不含所述四元转基因元件的不育系的方式具体包括：
[0021]
采用对应类型除草剂对所述保持繁殖两用系自交后代种子进行包衣、在所述保持繁殖两用系自交后代种子浸种催芽过程中添加对应类型除草剂或在所述保持繁殖两用系自交后代种子播种、种植后进行田间喷施对应类型除草剂。
[0022]
本发明的技术方案的原理如下：
[0023]
将水稻隐性雄性育性恢复元件、花粉致死元件、除草剂a抗性筛选元件和除草剂b敏感性筛选元件四个紧密连锁的四元转基因元件转入具有除草剂b抗性的水稻隐性雄性不育系得到携带单拷贝四元转基因元件的保持繁殖两用系杂合单株，携带单拷贝四元转基因元件的保持繁殖两用系杂合单株在自交结实过程中，含有四元转基因元件的花粉因花粉致死元件的作用使其败育而不能参与受精过程，而不含四元转基因元件的花粉与雌配子(含有四元转基因元件和不含有四元转基因元件的雌配子数目各占一半)正常受精结实产生种子，得到含有四元转基因元件的保持繁殖两用系和不含有四元转基因元件的不育系后代。
[0024]
由于含有四元转基因元件的保持繁殖两用系中含有除草剂a抗性筛选元件而获得了除草剂a抗性，而不含有四元转基因元件的不育系则没有获得除草剂a抗性，因此可以通过施用除草剂a进行筛选，去除不具有除草剂a抗性的不育系，提纯具有除草剂a抗性的保持繁殖两用系。由于含有四元转基因元件的保持繁殖两用系中含有除草剂b敏感性筛选元件而丧失了对除草剂b的抗性，而不含有四元转基因元件的不育系则保留了对除草剂b的抗性，因此可以通过通过施用除草剂b进行筛选，去除丧失了除草剂b抗性的保持繁殖两用系，提纯具有除草剂b抗性的不育系。
[0025]
本发明的有益效果：
[0026]
本发明在原有第三代杂交水稻育种技术的三元载体基础上，将荧光筛选元件替换为除草剂a抗性筛选元件，并增加一个除草剂b敏感性筛选元件，形成四元转基因元件连锁表达载体转化水稻隐性雄性不育系，通过施用对应类型除草剂，杀死或去除不具有对应类型除草剂抗性的保持繁殖两用系或不育系，降低了因昂贵的荧光筛选设备给第三代杂交水稻育种技术带来的门槛，更加简便、低成本、高效地筛选出保持繁殖两用系或不育系后代。
[0027]
本发明亦可应用于水稻隐性雄性不育材料的杂交育种和杂交制种，从而获得优质高产广适高抗植物新品种及其种子，具有巨大的经济价值。
[0028]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0029]
图1为本发明实施例所述水稻隐性雄性不育系的繁育方法操作流程示意图；
[0030]
图2为本发明实施例所述水稻隐性雄性育性恢复元件posstrl2-osstrl2结构示意图；
[0031]
图3为本发明实施例所述花粉致死元件ppg47-zm-bt1-zmaa1-in2-1结构示意图；
[0032]
图4为本发明实施例所述除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35s polya结构示意图；
[0033]
图5为本发明实施例所述除草剂b敏感性筛选元件p35s-oshis1i-ocs结构示意图；
[0034]
图6为本发明实施例所述四元转基因元件pbar-osstrl2-zmaa1-oshis1i结构示意图；
[0035]
图7为本发明实施例中pcambia1300-bar载体结构示意图；
[0036]
图8为本发明实施例中pcambia1300-bar-zmaa1载体结构示意图；
[0037]
图9为本发明实施例中pcambia1300-bar-zmaa1-oshis1i载体结构示意图；
[0038]
图10为本发明实施例中pcambia1300-bar-osstrl2-zmaa1-oshis1i载体结构示意图；
具体实施方式
[0039]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
[0040]
实施例1
[0041]
一种水稻隐性雄性不育系的繁育方法，包括以下步骤：
[0042]
如图1a所示
[0043]
(1)合成除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35s polya(如seq id no.3和图4所示)并通过同源重组连入sali单酶切后的pcambia1300载体得到含有除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35s polya的一元pcambia1300-bar载体(如图7所示)；
[0044]
(2)合成花粉致死元件ppg47-zm-bt1-zmaa1-in2-1(如seq id no.2和图3所示)并通过同源重组连入psti单酶切后的pcambia1300-bar载体得到含有除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35s polya和花粉致死元件ppg47-zm-bt1-zmaa1-in2-1的二元pcambia1300-bar-zmaa1载体(如图8所示)；
[0045]
(3)设计引物扩增除草剂b敏感性筛选元件p35s-oshis1i-ocs(如seq id no.4和
图5所示)
[0046]
扩增水稻oshis1的cds片段的引物为(下划线引物为扩增seq id no.5的正反引物，下划线之前的序列为同源重组接头)：
[0047]
oshis1-sence-f:gaggacacgctcgaggaattcgcaccctcttgacgattcttc
[0048]
oshis1-sence-r:ttccttaccaattggggtacccacgctgtataacatggcca
[0049]
b)扩增水稻oshis1的cds片段反向互补序列的引物为(下划线引物为扩增seq id no.6的正反引物，下划线之前的序列为同源重组接头)：
[0050]
oshis1-antisence-f:aagcaggactctagaggatcccacgctgtataacatggcca
[0051]
oshis1-antisence-r:gggttcgaaatcgataagcttgcaccctcttgacgattcttc
[0052]
c)应用pcr反应分别扩增水稻oshis1i的cds片段(如seq id no.5所示)及其反向互补序列(如seq id no.6所示)
[0053]
pcr反应体系为：2
×
pcr buffer 25μl，10mm dntps 2μl，f-primer：2μl，r-primer：2μl，phatamax：1μl，template：2μl，加ddh2o至50μl；
[0054]
pcr反应程序为：
[0055][0056]
d)将a)扩增后得到的片段通过同源重组连入ecori和kpni双酶切后的rnai沉默载体pkannibal中得到pkannibal-oshis1-sence构建，再将b)扩增后得到的片段连入hindiii和bamhi双酶切后的pkannibal-oshis1-sence构建，使得水稻oshis1的cds片段及其反向互补序列被pdk intron序列隔开，得到p2
×
35s-oshis1i-ocs构建(如seq id no.4和图5所示)；
[0057]
e)扩增p35s-oshis1i-ocs元件(如seq id no.4和图5所示)的引物为(下划线引物为扩增seq id no.4的正反引物，下划线之前的序列为同源重组接头)：
[0058]
rnai-oshis1-f:cgtctgcaggcatgcaagctttgagacttttcaacaaagga
[0059]
rnai-oshis1-r:acgacggccagtgccaagcttctgctgagcctcgacatg
[0060]
f)将e)扩增后得到的片段通过同源重组连入hindiii单酶切后的pcambia1300-bar-zmaa1载体得到含有除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35spolya、花粉致死元件ppg47-zm-bt1-zmaa1-in2-1和除草剂b敏感性筛选元件p35s-oshis1i-ocs的三元pcambia1300-bar-zmaa1-oshis1i载体(如图9所示)。
[0061]
(4)设计引物扩增水稻osstrl2的基因片段(如seq id no.1所示)，获得水稻隐性雄性育性恢复元件posstrl2-osstrl2-t(如图2所示)；
[0062]
扩增水稻osstrl2的基因片段的引物为(下划线引物为扩增seq id no.1的正反引物，下划线之前的序列为同源重组接头)
[0063]
osstrl2-f:tccagatcgtcgacctgcaggtatgcactttgttatattac
[0064]
osstrl2-r:tccggtgcagatccctgcaggacctgtgctgtcctgctc
[0065]
应用pcr反应扩增水稻osstrl2的基因片段(如seq id no.1所示)
[0066]
pcr反应体系为：2
×
pcrbuffer 25μl，10mm dntps 2μl，f-primer：2μl，r-primer：2μl，phatamax：1μl，template：2μl，加ddh2o至50μl；
[0067]
pcr反应程序为：
[0068][0069]
c)将b)扩增后得到的片段通过同源重组连入sbfi单酶切后的pcambia1300-bar-zmaa1-oshis1i载体得到含有除草剂a抗性筛选元件p35s-bar-35s polya、花粉致死元件ppg47-zm-bt1-zmaa1-in2-1、除草剂b敏感性筛选元件p35s-oshis1i-ocs和水稻隐性雄性育性恢复元件posstrl2-osstrl2的四元pcambia1300-bar-ossrl2-zmaa1-oshis1i载体(如图10所示)。
[0070]
(5)将步骤(4)得到的四元pcambia1300-bar-ossrl2-zmaa1-oshis1i载体通过农杆菌介导转化入抗β-三酮类除草剂的水稻隐性雄性不育系osstrl2，获得对草铵膦类除草剂具有抗性但对β-三酮类除草剂敏感的基因工程保持繁殖两用系；
[0071]
(6)保持繁殖两用系自交结实，其自交后代中包括含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系或不含所述四元转基因元件的不育系，其数量各占一半。
[0072]
(7)在水稻种衣剂里加入草铵膦，用搅拌机对保持繁殖两用系自交结实种子进行包衣，使每一粒种子被种衣剂均匀包衣，然后浸种催芽后播种于秧田，对播种7天后保持繁殖两用系自交后代秧苗喷施草铵膦，在此过程中，保持繁殖两用系自交后代里不含所述四元转基因元件的不育系因不具有草铵膦类除草剂抗性而被杀死，而含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系因具有草铵膦类除草剂抗性可正常存活生长并用于后代保持繁殖两用系和不育系的继续繁殖。
[0073]
实施例2
[0074]
一种利用草铵膦除草剂筛选水稻隐性雄性不育系方法，如图1b所示，包括如下步骤：
[0075]
将实施例1中得到的对草铵膦类除草剂具有抗性但对β-三酮类除草剂敏感的基因工程保持繁殖两用系自交后代种子用加入了磺草酮的水稻种衣剂搅拌包衣，然后浸种催芽后播种于秧田，对播种7天后保持繁殖两用系自交后代秧苗喷施磺草酮，在此过程中，保持繁殖两用系自交后代里含有所述四元转基因元件的保持繁殖两用系因对β-三酮类除草剂敏感而被被杀死，而不含所述四元转基因元件的不育系因具有β-三酮类除草剂抗性可正常存活生长并用于杂交育种和杂交制种。