一种丹参花药的内参基因及其用途

1.本发明具体涉及一种丹参花药的内参基因及其用途。


背景技术：

2.丹参(salvia miltiorrhiza bunge)隶属于唇形科(lamiaceae)鼠尾草属(salvia)多年生草本植物。主要分布在四川、山东、河南、陕西等地，是常见大宗中药材。《中华人民共和国药典》2020年版中规定，药材丹参为唇形科鼠尾草属丹参的干燥根及根茎，其主要成分为脂溶性的丹参酮类以及水溶性的酚酸类化合物。丹参具有改善血液循环、保护心血管、保护神经和抗癌等药理作用，不仅在中药开发和利用方面具有重要的价值，而且也可用于食品、饲料及天然产物提取，以获得其独特的功效。因此，对丹参花药发育调控机制的研究，需要进一步挖掘参与发育的功能基因，并研究基因的表达模式和生物学功能。
3.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)是对目标基因表达定量应用最广泛的分子生物学方法，具有精确度高、灵敏性强、特异性强和重复性好等特点，也常用于植物学、医学、微生物学等众多领域的研究。但是qrt-pcr对目标基因表达量准确分析的前提是筛选出稳定表达的内参基因。理想的内参基因应该不受生长阶段、组织器官及实验处理条件的影响。然而，内参基因在不同植物以及不同实验条件下并不是恒定的，而且内参基因在不同植物、不同的组织中并不具有通用性。此外，关于丹参花药内参基因的研究还较为匮乏，虽然用于丹参的内参基因已有报道，然而经过实验验证并不适用于花药。因此，现有的内参基因并不能作为丹参花药qrt-pcr的内参基因。
4.目前，针对适宜用于丹参花药qrt-pcr研究的内参基因还未见报道，为研究丹参花药功能基因表达特性，得到表达稳定可靠的丹参花药的内参基因是目前迫切需要的。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种丹参花药的内参基因，所述内参基因为sm073914基因和/或sm083165基因。
6.进一步地，所述sm073914基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述sm083165基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了一种扩增前述内参基因的引物，所述sm073914基因的引物包括核苷酸序列如seq id no.3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的反向引物；
8.所述sm083165基因的引物包括核苷酸序列如seq id no.5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的反向引物。
9.本发明最后提供了一种sm073914基因和/或sm083165基因作为内参基因在丹参花药基因检测中的用途。
10.进一步地，所述sm073914基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述sm083165基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.进一步地，所述基因检测是检测丹参花药基因转录表达水平。
12.更进一步地，所述基因检测是实时荧光定量检测丹参花药基因转录表达水平。
13.更进一步地，所述基因检测使用的引物包括核苷酸序列如seq id no.3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的反向引物。
14.更进一步地，所述基因检测使用的引物还包括核苷酸序列如seq id no.5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的反向引物。
15.本发明所述的丹参花药为四川丹参和/或山东丹参。
16.本发明丹参花药的内参基因，通过对丹参花药的转录组数据分析，并结合genorm，normfinder和bestkeeper软件得到了丹参花药最适的内参基因sm073914基因和sm083165基因。本发明首次提出以sm073914和/或sm083165基因作为丹参花药qrt-pcr的内参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了丹参花药qrt-pcr没有内参基因的现状。并且，本发明提供的适用于丹参花药qrt-pcr的两个内参基因序列均来自丹参花药转录组序列，与其他物种上的通用内参基因相比具有特异性好，稳定性高的优点。
17.其次，本发明sm073914基因和/或sm083165基因作为内参基因在qrt-pcr检测丹参花药基因转录表达水平中的应用，能够用于丹参花药发育过程中关键基因的表达分析，能显著提高所得数据的精准性，应用广泛、灵敏度高、稳定性好。并且，本发明还提供了上述内参基因的特异性引物，引物的pcr扩增片段只有一个，没有非特异扩增，表明sm073914和sm083165荧光定量pcr引物特异性强，保证了目的片段的扩增效率。
18.最后，本发明还通过转录组筛选了4个果胶酶相关基因作为验证基因，并以sm073914、sm083165、sm073914+sm083165及表达稳定性相对较低的sm082070分别作为内参基因，进行qrt-pcr分析，其分析结果与转录组对应基因的fpkm值进行相关性分析，从而验证内参基因的稳定性，进一步确定内参基因的适用性与可靠性。
19.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
20.以下通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
21.图1丹参花药9个候选内参基因引物pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
22.图2丹参花药中9个候选内参基因qrt-pcr熔解曲线。
23.图3 9个候选内参基因平均cq值分布。
24.图4genorm软件比较9个候选内参基因的表达稳定性m值折线图。
25.图5genorm分析得到的vn/v
n+1
，用于确定准确定量分析最优的内参基因数目。
26.图6以sm073914、sm083165、sm073914+sm083165及sm082070分别作为内参基因对验证基因进行qrt-pcr分析的结果图及验证基因的fpkm值。(注：a、b、c、d、e：sm022309作为验证基因；f、g、h、i、j：sm013701作为验证基因；k、l、m、n、o：sm021008作为验证基因；p、q、r、s、t:sm054957作为验证基因。a、f、k、p：fpkm值；b、g、l、q：sm073914作为参考基因；c、h、m、r：sm083165作为参考基因；d、i、n、s：sm073914+sm083165作为参考基因；e、j、o、t：sm082070作为参考基因)
具体实施方式
27.具体实施方式中使用的设备和试剂均为市售购买获得，供试材料丹参花药为种植在四川农业大学中江试验田的二倍体四川(sc)和山东(sd)丹参不同发育时期的花药，即四川四分体时期(sctd)、四川小孢子时期(scym)、四川成熟期(scmp)、山东四分体时期(sdtd)、山东小孢子时期(sdym)、山东成熟期(sdmp)，每份样品进行3次生物学重复混合取样。将所取样品迅速放入液氮中速冻并放置于-80℃冰箱保存备用。
28.实施例1：植物总rna的提取及cdna的合成
29.按照rna提取试剂盒(plant rna lsolation kit，labgene)的说明书对所有试验样品进行总rna的提取，通过dna酶处理，去除基因组dna的污染。采用nanodrop 2000超微量紫外分光光度计对总rna的浓度和质量进行测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性。每个试验样品rna的od
260
/od
280
、od
260
/od
230
均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28s及18s条带清晰，无降解现象，满足要求。
30.采用反转录试剂盒au341型(transgen biotech，北京)进行反转录合成cdna。用于cdna第一链合成需要约1μg的总rna，4μl uni all-in-one supermix for qpcr，1μl gdna remover，加去离子水补齐至20μl。反应程序为：50℃，5min；85℃，5s终止反应。
31.每个样品进行3次生物学重复。由此制备得到丹参花药各个样品的cdna。
32.表1丹参花药转录组数据中9个候选参考基因的fpkm值
[0033][0034]
实施例2：候选内参基因的选择与引物设计
[0035]
根据丹参花药的转录组测序数据，筛选了9个候选内参基因，分别为sm073914、sm083165、sm053393、sm082070、sm041998、sm011428、sm062969、sm071437和sm031332。在所有供试样品(不同发育时期的花药：四川四分体时期(sctd)、四川小孢子时期(scym)、四川成熟期(scmp)、山东四分体时期(sdtd)、山东小孢子时期(sdym)、山东成熟期(sdmp))中，这
9个基因fpkm值均相对稳定(表1)。其中fpkm即每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片，该值可以反映基因的表达水平，fpkm值越大即基因的表达水平越高。然后根据基因的cds序列在primer 5软件上设计定量特异性引物(表2)，引物pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0036]
表2丹参花药9个候选内参基因引物序列及扩增产物特征
[0037][0038]
实施例3：候选内参基因稳定性分析
[0039]
以稀释1倍的cdna为模板，根据全式金的green qpcr supermix(transgen biotech，北京)试剂盒说明书配制qrt-pcr反应体系，每个反应进行3次重复，并在bio-rad08554定量仪(伯乐，上海)的96孔板上进行实时荧光定量pcr。
[0040]
反应体系为：所述qrt-pcr的反应体系为20μl，包含green qpcr supermix 10μl，正向引物和反向引物分别1μl，cdna 2μl，ddh2o补足20μl。
[0041]
qrt-pcr反应程序为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，15s，40个循环。
[0042]
候选内参基因的表达水平可以初步通过qrt-pcr得到的原始cq值进行评估，基因的cq值越大，则基因的表达量越低，反之，则越高。而候选内参基因的稳定性则通过genorm、normfinde和bestkeeper 3种软件进行分析。
[0043]
结果：实施例2中提供的9对引物在实时荧光实时定量中熔解曲线均为明显的单一
峰(图2)，且电泳检测也只有单一条带图(图1)，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。cq值与基因的表达量呈反比，9个候选内参基因cq平均值在20.90-23.93之间，其中sm083165基因表达量较高，sm082070基因的表达量较低(图3)。
[0044]
数据分析：
[0045]
genorm软件分析：genorm软件是根据平均变异度m值来衡量基因的稳定性，程序默认m阈值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参基因，且m值越低表示基因越稳定。此外genorm软件还能够根据候选内参基因的配对差异值vn/v
n+1
来确定合适的内参基因个数，当vn/v
n+1
＜1.5时，采用n个内参基因个数。根据软件计算结果9个候选内参基因在丹参花药中的表达稳定性依次为：sm073914＝sm083165＞sm031332＞sm053393＞sm062969＞sm011428＞sm071437＞sm041998＞sm082070(图4)。此外genorm软件还能够根据候选内参基因的配对差异值vn/v
n+1
来确定合适的内参基因个数，理想情况下当vn/v
n+1
＜0.15时，采用n个内参基因个数。根据本实验的配对差异值vn/v
n+1
，显示vn/v
n+1
均大于0.15，因此它推荐使用所有的9个内参基因，用于基因表达研究(图5)。但是0.15的值规定太过严格，并非所有条件下都适用，应该取决于实验对象的研究结果。
[0046]
normfinder软件分析：normfinder同样是计算候选内参基因的表达稳定性，同时考虑了组内和组间的变异。表3列出了normfinder计算的9个候选内参基因在丹参花药中表达稳定性值(m)。由normfinder列出的候选内参基因稳定性排列顺序，可以确定在丹参花药中表达较稳定的前3个基因分别是sm073914、sm083165、sm053393，最不稳定的基因是sm082070。
[0047]
表3normfinder软件分析结果
[0048][0049]
bestkeeper软件分析：bestkeeper软件是基于内参基因cq值的标准差(sd)和调节系数标准差sd来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达cq值进行分析。该算法得到的cv和sd值越小，内参基因表达越稳定，其中程序默认sd临界值为1，当sd值大于1时，认为该基因表达不稳定。r是选择内参基因组合的重要指标，r越大表明该基因与其他基因的相关性越好，越适宜与其他基因共同作为内参基因组合。bestkeeper分析结果显示在丹参花药中
表达相对较稳定的基因是sm062969、sm083165和sm073914，表达最不稳定的基因是sm041998(表4)。
[0050]
表4 bestkeeper软件分析结果
[0051][0052][0053]
9个候选内参基因表达稳定性的统计分析：
[0054]
根据3种不同算法对9个候选内参基因的稳定性进行赋值分析，按基因的稳定性由高至低，分别赋值1-9，以综合评定候选内参基因的稳定性(表5)。由统计分析结果显示6个候选内参基因的稳定性由高至低分别为：sm083165＞sm073914＞sm062969＞sm031332＞sm053393＞sm011428＞sm071437＞sm041998＞sm082070。由于genorm分析确定最适内参基因数目为2，因此确定丹参花药qrt-pcr的内参基因为sm083165(核苷酸序列如seq id no.2所示)和sm073914(核苷酸序列如seq id no.1所示)。
[0055]
表5 9个候选内参基因表达稳定性的统计分析
[0056][0057]
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：
[0058]
试验例1：sm073914基因和sm083165基因作为内参基因的应用及稳定性验证
[0059]
为了进一步验证丹参花药中内参基因的稳定性和可靠性，基于转录组数据筛选了4个基因(sm022309、sm013701、sm021008和sm054957)，分别以稳定表达的sm073914、sm083165、sm073914+sm083165及表达相对不稳定的sm082070作为内参基因，对4个基因(sm022309、sm013701、sm021008和sm054957)进行实时荧光定量pcr分析(具体的反应体系和方法与“实施例3：候选内参基因稳定性分析”中qrt-pcr的方法一致)，并将基因表达量的变化趋势比对rna-seq结果得到的对应基因fpkm值的变化趋势(图6)，并进行相关性分析。
[0060]
4个用于验证的基因分别为sm022309(seq id no.7)、sm013701(seq id no.10)、sm021008(seq id no.13)和sm054957(seq id no.16)基因其特异性引物分别为：sm022309(seq id no.8和seq id no.9)、sm013701(seq id no.11和seq id no.12)、sm021008(seq id no.14和seq id no.15)、sm054957(seq id no.17和seq id no.18)；sm082070(seq id no.19)基因的特异性引物为sm082070(seq id no.20和seq id no.21)。
[0061]
验证涉及的核苷酸序列信息如下：
[0062]
sm073914基因(seq id no.1)
[0063]
atggcggcatggttggaggggctaaagcagctgaggccactggtgcacctgctgttgccactgatggtgcattggattgctgatgagatgactgtttctgtgctggttgacctcactaccaacgctctttgtccaggcgacaccaattgccctgaagccatctatatcaatggcatccagcaaactattgttggaatattcaagatgatagttataccactcatgggtcagctgtctgatgagtatggacgtaaacctttcctgcttctcacagtatcgacgaatattgttcctttcagtttacttgccatcaatcaatctagaggaacagtctatgcttattatgctcttcgcactattgctatgataataagcaaggggaccattttctgcattgcagtcgcatatgctgcagatatagtcgatgtgggcaagagggctgctgtcttcagttggatgacgggccttttctctatatcacttgtcgtaggaaacttgctagcgcgctttcttcctgaagaatatattttccaggtgtcaatagttctgttgatcttcgtcccagtttacatgtccctgtttctgaaagaaacaataagatcaactcgaaaacctgacgatgacaattcttgcttaaacaaggcagttaagatcgttacaaatcgatattactcgatgaagaatgctgcttatgttgtcactagcagctcaacacttaagcgcatttcttttgtatccttcttctacgagctgggatcatctggtatcagcagtgtcataatgtactatatgaaggcagtttttggttttgacaaaaatcaattatcagaagtttcaatgattgtggaaataggatcaattttttcccagatattggtgctgcctctacttaatcccttggttggcgagagagtgattctttgtgtagccttgctcgcatatactggatatggattgctttatggcttggcctgggcaccatgggtgccttatgtgagtacttcttttggaatcatctacgtccttgtcaaacccgctacctatgcagtgatatctaagggatcaacttcagcagatcaggggaaagcacaaggtttcgtggctggcgttcagtccattgcaagctttctctcgccacttgcgatgagtcctctaaccacgtggtttctgtcaagcgacgcgccattcaactgtaaaggtttcagcattataatcgccactctgagcacggtggtcgcgttgtgctttgcttggacgctaaacctagacgctccgccgaagaagaatgcagaggcggaggagcaagctgaagatgtcgaaacaccacttctgtcataa
[0064]
sm083165基因(seq id no.2)
[0065]
atggacgaattagtcggccctcgtctctacagctgctacaaatgccggaatcatgtttgccttcatgatgatataatctccaaggcatttcagggacgacacggacgagcctttctgttctcccacgccatgaacatcgttgtcggggccaaagaggacaggcatctaatgactggtctgcacactgtggctgatatctcctgtgcagattgcagtgaggtgttggggtggaaatacgaacgggcttttgaggcgtcgcagaaatacaaggagggtaaattcatattcgagaaatcaaagattgtgaaggagaactggtag
[0066]
sm073914基因的特异性引物:
[0067]
sm073914-f(seq id no.3)：5
’‑
aatggcatccagcaaacta-3’[0068]
sm073914-r(seq id no.4)：5
’‑
tgtgagaagcaggaaaggt-3’[0069]
sm083165基因的特异性引物
[0070]
sm083165-f(seq id no.5)：5
’‑
aatctccaaggcatttcag-3’[0071]
sm083165-r(seq id no.6)：5
’‑
gttcgtatttccaccccaa-3’[0072]
sm022309基因(seq id no.7)
[0073]
atggggcgagtggaattatattcgctctcgctcatcttgatcttcgcttttgcttcgactcttccattc
tcgacggccaatatcgccgaatacgacgattattgggccaagagagctgcagaagcttggaatcgcacgttggagacctacgagcccattcctgcaaccgtcgtcaaccatttgaatgtccacacccaaagggctctgaaggagctggagggttcgaacaacggcacgaggaggcagctggcccacaattacaacggtccgtgcatggcgacgaacccgatcgaccggtgctggcgttgcgacccggactgggccaacaaccggttcaggctggccgactgcggcctcgggttcgggcgcaaggccaagggcgggaagggcggcaagatctacgtggtgaccgactcctccgacaacgacatggtgaacccgaagccgggcacgctccggcacgccgtgatccagaaggagccgctgtggatcatcttcggccgcagcatggtcatccgcctcaaccaggagctcatcatgaccagcgacaagaccatcgacgcccgcggcgcctccgtccacatcgcccacggcgccggcatcaccatccagttcgtccgcaacgtcatcatccacggcctcaagatccacgacatcgtccccggcaccggcggcctcatcagggactccgtcgaccactacggctaccgcagccgcagcgacggcgacggcatctccgtcttcggagccaccgacgtctggatcgaccacgtctccatgaaacaggccagcgatggcctcattgatgtcatttggggatccactggaatcaccatttccaacggtcacttcactgaccacaacgaggcgatgctcttcggggccagcgacgcgcacgacatcgacaagaagatgcagatcacggtggtgttcaaccacttcgggaagaggatggtgcagaggatgccgaggtgcaggttcgggtacttccacgttgtcaacaacgactacacgcactggaacatgtacgccataggcgggagcatgaaccctaccatcatcagtcagggcaacaggtacattgccccaccgctcaacggctacgccaaggaggtgacgaagagggagtacacgccggaatccacctggaagtcgtggacgtggaggtcacagggagatatattcctgaggggcgctttcttcatcgagtcgggcgaccagagctttgtcggaaagcatccggagctctacgaccacgtcgaggcggcgtccggtgagaaagtagcggagatgactaaatttgcaggatcacttggttgtagagtgggagaaccttgctag
[0074]
sm022309基因特异性引物
[0075]
sm022309-f(seq id no.8)：5
’‑
tcttgatcttcgcttttgc-3’[0076]
sm022309-r(seq id no.9)：5
’‑
aatggttgacgacggttgc-3’[0077]
sm013701基因(seq id no.10)
[0078]
atgggggactccaaatcgagagtcgtcgtcctcgccgtcctcgccaccgtgctccttttggcggcggtgatcgccgcggtcgtcgtcttctcgaagggcgaagagaagcacgatggcggcaagggcggcggcggcagcgtcgtcgtctcggcctctaaagcggtgaagctcgtgtgctccccgacggactacaaggagacctgcgagaagagcctcgccggcgccaacaccaccgaccccaagaagctgatcgaggcggcgttcgacgccaccgtcggcagcatcatgggggcgctcgagagctccgccgagctgaagaaggtcgccaccgacccctccaccaagggcgccttcgacgtctgcgacgaggtgctgcacaacgccgtcgacgatctgaagagctcgatcacgaaggtcgcgcacttcgacgccggcgaggccaaggccctcgccgccgacctccgcacgcgcctcgccgccgtcggggacgaccaggagacgtgcaccgacgccttcgagaacaccaccggcgacaccggggagaagatgaaggccctattgaaaaccgctaaggagatgtcgagcaacggcctcgccatggtgagcgacctctccgcgatcctcggatcgctgcagctggcgaagttcctcggcggcggcggcggcggcggcggaagcgcgaggaggctcatggcggaggaagccggcgatttcgtggatcggaggatcctgaaggtggcggcgttgaagccgacgatggtggtggcgaaggacgggagcgggcagtttaagacgatctcggcggcgttgaagacgctgccgaagaagaataatgagacgttcatcgtgattcatatcaaagccggcgtgtatgcggagacggtgatcattccgaagaaggtgaataaggtggtgttgctcggagacggcccgaagaagacggtgatcaccggaaaattgagcttcgccggaggtgttaagacctaccacaccgccaccgtcggtgagtatattcatatatctctctctcttatatattctagtaaaatatcatga
[0079]
sm013701基因特异性引物
[0080]
sm013701-f(seq id no.11)：5
’‑
acgggagcgggcagtttaa-3’[0081]
sm013701-r(seq id no.12):5
’‑
acggtggcggtgtggtagg-3’[0082]
sm021008基因(seq id no.13)
[0083]
atgaaagaaattaagatgaattcatggttgttaatggtgtgttttggttttggttttggttggatgtcacaagtcgttaatggtaatattggagaatgggatgaggtgtggaagaagcgctccgaggagtcttggaatagaactcttgagacctatgagcccatcccagaacacatagttagtcatttgaatgtgcatgccaaaaaggcagtaaaggaaatagaaaaaggaagttcagacacaaatagcacaagaagggagctactaagggggtacacgggtccgtgcatggtgacaaacccgatcgaccgttgctggagatgccagccgaattgggcgcagaggcggttcaggttggccgactgcgtcttagggttcggatacaaaacgaccggcggcaagaacggcgccttctacgtggtgacggacccttcggactcggacttgataaaccctaggccgggaaccctacggcacgccgtgatccagaaggaggcgctgtggatcatcttcgagcgcagcatgctcatcgtcctccagcaggagctcatcatgcagggcgacaagaccatcgacggccgcggcgtccgcgtcgacatcgcctacggcgccggcatcaccatccagttcgtcagcaacgtcatcatccacaacatccggatccacgacatcgtcagcacgagcggcggcatgatcagggactccgtcgaccactacggcttccgcaccgtcagcgacggcgacggcatctccatcttcggctcgcagaatatctggatcgaccacgtctccatgaagaattgcagcgacgggctgattgacgccatcgagggctccacgggcatcagcatcaccaacagccacttcaccgatcacgatgaggcgctgctctttggtgccaatgatttagcgacttacgatgacaaaatgcaagtgacggtagctttcaaccattttgggaagagactggtgcagagactgccacggtgcagatttggatattttcacgtagtgaacaatgactacactcattggaaaatgtatgcgattgggggaagcagtcatcccaccatcattagccagggcaacagatttgtggcggatcacccttttgccaagcaggtgacgaagagggagaagtctccagaatcagagtggatgaaatggacatgggtatcagagggagacctatttttgagaggtgcatattttgtggaatcgggcgataaggattggacgaagaaacatccggagctgtatgacaagattatggcagctccagcaaaacatacagcagaaatgaccaaatttgcaggcgttcttggttgtacggtaggagaaccatgctaa
[0084]
sm021008基因特异性引物
[0085]
sm021008-f(seq id no.14)：5
’‑
tcaccaacagccacttcac-3’[0086]
sm021008-r(seq id no.15)：5
’‑
caatcgcatacattttcca-3’[0087]
sm054957基因(seq id no.16)
[0088]
atggccctcacaaattataaactatctatattccttttgtgcatcttgctcccgctcgcagctcaggctaaaatcgccgatttcgacgaatatttgcaaaagaaggctgcggaatcgtacgaggaatccttgaactcgttcgatcccaaccccgaaggcgtgaccgatgatttcaacatgatggttggcaaacagaaggaaaaatatgcagggaccttgatcggtaccaaaaatgcgacgaggagaaatctccgtaacgaggatgggtgcaaggcgaccaacccgatcgatcgttgctggcggtgcgaccagaactgggacaagaacaggaagaggctggccgagtgcggcgccgggttcgggtaccgcacaaccggcgggaaagaagggaggtactacgtggtccacgacccgtcggacgacgacatggtgaaccctaaaccgggcaccctgcggcacgccgtgacccagagcgagccgctgtggatcgtgttcgcccacagcatggtgatccggctgaagcaggagctgatcgtgagcagccacaagaccatcgacggccgcggcgtgcaggtccacgtggcctacggcgccggcatcacgctgcagttcgtgcagaacgtgatcatccacaacatctggatccacaacatcgtccccgccagcggcggcaccatcagggacgccgtcgaccacgtcgggctgcggacgcagagcgacggcgacgccatcaccgtcttcagctccagcaacgtctggctcgaccacatctcgctttccaaggccaccgacggcctcattgatgtcatcgagggctccaccgccatcaccatctccaactgcaaattcaaccaccacaacgatgtgatgctcttgggggcaaatgacctgagctccaaagacgcgatcatgcaagtgacggtggccttcaacagattcgggatcgggctcatccagcgcatgcccagggcacgatgggggttcgtccacgtcgtcaacaacgactactcccattgggaactctacgccatcggcggcagcgctcaccccaccattattagccagggcaaccgcttcagagcctccaactaccgttacactaaagaggtgactaagagggactacgcccaagagagcgagtggatgaaatggcagtggcggtcggagggcgatctgttcacgaacggggcctacttccgtgagtcgggcccaccgttgaaacacacgaagaacccgttgacgggggagaatttgatcaagtacaagccgggatcattcgtcgggagactcacacgcagctc
cggtgcacttagatgccgcaatggtcactattgctag
[0089]
sm054957基因特异性引物：
[0090]
sm054957-f(seq id no.17)：5
’‑
cgctcaccccaccattatt-3’[0091]
sm054957-r(seq id no.18)：5
’‑
ccgaccgccactgccattt-3’[0092]
sm082070基因(seq id no.19)
[0093]
atgtcatccgacgccggaatcctgtcgcgcgtgtcctcctccgtgtcggagtctcccatcgtgtacaaaggcaagaaagcggcgtccgacaccgcctttgtggcctcgaaactcctcaagagcaccggaaaagccgcatggatcgtcggcaccaccttcctcgtcctcgtcgtcccgctcattattgagatggaccgcgaggctcagttcaacgagctcgagttgcagcaggctagcttgcttggctcctctaagcaagtgtgttcttggccaatttctagtgttctgataacggatattagtttgattaggatcagtagtggctctgagttttgtgtgactgtgtattga
[0094]
sm082070基因特异性引物：
[0095]
sm082070-f(seq id no.20)：5
’‑
gcctcgaaactcctcaaga-3’[0096]
sm082070-r(seq id no.21)：5
’‑
cacaaaactcagagccact-3’[0097]
用所筛选出的内参基因sm073914、sm083165和sm073914+sm083165组合分别作为内参时，4个验证基因与转录组的pfkm值有着相似的变化趋势，但用sm082070基因来做内参时，4个验证基因表达情况与转录组数据不一致，说明所筛选的内参基因sm073914和sm083165是准确可靠的(图6)。为了更准确的归一化qrt-pcr的结果，我们采用sm073914+sm083165组合作为丹参花药qrt-pcr的内参基因。
[0098]
综上，本发明以sm073914和/或sm083165基因作为丹参花药qrt-pcr的内参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了丹参花药qrt-pcr没有内参基因的现状。