一种AS1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针及其制备方法和应用

一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及纳米探针技术领域，特别涉及一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在当今精准医疗和个体化医学时代，分子成像因其在肿瘤早期的确诊和分期、指导制定计划以及预测和评价疗效方面的潜在效用而备受关注。由于其对小分子的高度特异性，一种从selex(指数富集的配体系统进化技术)衍生出来的人工合成的短的单链寡核苷酸适配子因其在构建纳米探针方面的潜在效用而越来越受关注。一般来说，适配子可以连接到纳米材料上，形成靶向肿瘤细胞的纳米探针。例如，通过稳定的au-s键将抗muc1适配子负载到aunps表面，构成肿瘤靶向药物传递系统。此外，三磷酸腺苷结合适配子可以被结合到dna三角柱中构成dna逻辑装置，有望发展为药物可控释放和疾病治疗方面的潜在应用。
3.然而，由于以上适配子与纳米材料构成的探针具有膜穿透效率低、毒性大的缺陷，限制了其临床上的进一步应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针及其制备方法和应用。本发明提供的as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针可被癌细胞有效地吸收和滞留，准确、灵敏地识别癌细胞并成像，且具有良好的体内安全性。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针，包括g-四链体构象的as1411寡核苷酸，和与所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸氢键连接的钌配合物，所述钌配合物具有式1所示结构：
[0007][0008]
优选的，所述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针中钌元素的含量为3～10wt％。
[0009]
优选的，所述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针的粒径为200～500nm。
[0010]
本发明提供了上述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
将g-四链体构象的as1411寡核苷酸分散液与具有式1所示结构的钌配合物混合，
进行自组装和透析，得到as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针。
[0012]
优选的，所述自组装的温度为25～40℃，时间为4～12h。
[0013]
优选的，所述透析的截留分子量为0.5～3.0kda；所述透析的温度为25～40℃，时间为1～3天。
[0014]
优选的，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
将as1411寡核苷酸与含钾离子缓冲溶液混合，依次进行高温变性和低温复性，得到g-四链体构象的as1411寡核苷酸；
[0016]
所述高温变性的温度为90～100℃，时间为5min；所述低温复性的温度为4～8℃，时间为24～72h。
[0017]
本发明提供了上述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针在制备癌诊断试剂中的应用。
[0018]
优选的，所述癌诊断试剂为乳腺癌诊断试剂。
[0019]
本发明提供了一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针(简写为as1411@rupep)，包括g-四链体构象的as1411寡核苷酸，和与所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸氢键连接的钌配合物，所述钌配合物具有式1所示结构。在本发明中，g-四链体构象的as1411寡核苷酸具有稳定的结构，且能与肿瘤细胞膜上的核仁素(ncl)特异性结合；具有式1所示结构的钌配合物rupep具有优秀的发冷光性能，可以作为磷光探针来点亮突出肿瘤细胞。在本发明中，g-四链体构象的as1411寡核苷酸具有折叠堆积的四链螺旋结构，能与钌配合物rupep以沟槽方式结合，从而诱导as1411自组装形成纳米探针。同时钌配合物rupep咪唑环上的n原子能够与g-四链体构象的as1411寡核苷酸中的g15和t16残基上的两个h原子间形成两个分子内氢键，提高结合稳定性。本发明提供的as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针具有良好的癌细胞入胞性，可以作为癌诊断试剂，选择性识别并激活癌细胞表面ncl受体到细胞核的运输，从而促进癌细胞的成像。同时，本发明提供的纳米探针具有良好的体内安全性。
附图说明
[0020]
图1为as1411@rupep纳米探针的构建过程及其用于ncl靶向识别的乳腺癌成像的原理；
[0021]
图2为钌配合物rupep与g-四链体构象的as1411寡核苷酸氢键结合的示意图；
[0022]
图3为rupep和as1411@rupep的电子吸收光谱和荧光发射光谱；
[0023]
图4为as1411@rupep纳米探针的tem图像；
[0024]
图5为as1411@rupep纳米探针的原子力显微镜显微图；
[0025]
图6为as1411@rupep纳米探针元素光谱的eds分析图；
[0026]
图7为as1411@rupep纳米探针的eds mapping图；
[0027]
图8为as1411@rupep纳米探针的粒径分布图；
[0028]
图9为纳米探针通过内吞进入细胞核的过程示意图；
[0029]
图10为as1411@rupep(5μm)在mda-mb-231细胞中的细胞定位；
[0030]
图11为mda-mb-231乳腺癌细胞在2h内处理as1411@rupep结果的实时成像结果；
[0031]
图12为探针从细胞外环境转移至细胞核的成像结果；
[0032]
图13为as1411@rupep处理mda-mb-231细胞的生物透射电镜成像结果；
[0033]
图14为as1411@rupep纳米探针靶向识别细胞膜表面ncl选择性成像肿瘤细胞的过程；
[0034]
图15为ncl在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的分布结果；
[0035]
图16为ncl在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的表达结果；
[0036]
图17为as411@rupep纳米探针在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的定位；
[0037]
图18为mda-mb-231和mcf-10a细胞与as1411@rupep共培养6h后的lscm图像；
[0038]
图19为图18的叠加数据分析结果；
[0039]
图20为注射纳米探针后的不同时间点拍摄特定的肿瘤靶向图像；
[0040]
图21为定量测定小鼠肿瘤区和非肿瘤区as1411@rupep的荧光强度结果；
[0041]
图22为定量测定解剖器官或组织as1411@rupep(平均cps)的荧光强度结果；
[0042]
图23为as1411@rupep在24、72和108h的组织分布和药物代谢结果；
[0043]
图24为通过尾静脉注射纳米探针后不同组织的病理学变化；
[0044]
图25为5例浸润性导管癌患者标本的人乳腺癌组织切片苏木精-伊红染色组织化学分析；
[0045]
图26为在荧光显微镜下观察新鲜人浸润性导管癌组织冰冻切片成像结果；
[0046]
图27为clsm放大观察核仁素和纳米探针在癌区和癌旁区的分布；
[0047]
图28为利用image-pro plus软件分析癌旁细胞三通道发射强度的合并曲线；
[0048]
图29为5例浸润性导管癌标本ncl表达及肿瘤分级定量分析；
[0049]
图30为5例浸润性导管癌标本ncl表达及肿瘤分级定量分析；
[0050]
图31为纳米探针检测肿瘤组织标本的操作流程流程图；
[0051]
图32为浸润性导管癌标本正常及i-iii级组织he染色病理特征；
[0052]
图33为as1411@rupep纳米探针对正常和不同肿瘤分级标本的成像结果；
[0053]
图34为不同样品中纳米探针在白标记线迹处的发射强度曲线的发射强度曲线；
[0054]
图35为不同肿瘤分级的正常标本的重复等面积平均强度的统计分析结果。
具体实施方式
[0055]
本发明提供了一种as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针，包括g-四链体构象的as1411寡核苷酸，和与所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸氢键连接的钌配合物(简写为rupep)，所述钌配合物rupep具有式1所示结构：
[0056][0057]
在本发明中，所述as1411寡核苷酸的序列如seq id no.1所示，具体为5’至3’，tggtggtggttgttgtggtggtggtggt。
[0058]
在本发明中，所述as1411寡核苷酸的来源优选为市售。作为本发明的一个具体实施例，所述as1411寡核苷酸购自上海生工生物科技有限公司。
[0059]
本发明对所述钌配合物rupep的来源没有特殊的要求，采用本领域市售的具有式1所示结构的钌配合物rupep或自行制备均可。当自行制备时，所述制备方法优选包括以下步骤：
[0060]
于30ml微波反应管中加入[ru(bpy)2cl2]
·
2h2o(105mg,0.2mmol)，p-epip(236.7mg,0.3mmol)，乙二醇和水混合溶剂，通氩气10min，微波辅助120℃加热20min，反应毕，冷却至室温，加水稀释，过滤除去不溶物，得深红色滤液，滤液中加入过量的高氯酸钠，静置过夜，产生大量橙红色沉淀，过滤得沉淀，分别用水，乙醚洗涤数次后，真空干燥器中干燥，得到橙黄色固体。粗产品乙腈溶解，过200-300目中性氧化铝柱，乙腈淋洗下主红色组分，减压旋干溶剂，得到棕红色固体，即为钌配合物rupep。
[0061]
在本发明中，所述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针中钌元素的含量优选为3～5wt％，更优选为4wt％。
[0062]
在本发明中，所述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针的粒径优选为200～500nm，更优选为300～400nm。
[0063]
在本发明中，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸具有折叠堆积的四链螺旋结构，能与钌配合物rupep以沟槽方式结合，从而诱导as1411自组装形成纳米探针。同时钌配合物rupep咪唑环上的n原子能够与g-四链体构象的as1411寡核苷酸中的g15和t16残基上的两个h原子间形成两个分子内氢键，提高结合稳定性。
[0064]
在本发明中，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸能与肿瘤细胞膜上的核仁素(ncl)特异性结合，靶向识别癌细胞；钌配合物rupep具有优秀的发冷光性能，可以作为磷光探针来点亮突出肿瘤细胞，且具有良好的生物安全性。本发明提供的as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针具有良好的癌细胞入胞性，可以作为癌诊断试剂，选择性识别并激活癌细胞表面ncl受体到细胞核的运输，并通过内吞过程将纳米探针定位到肿瘤细胞的细胞核中从而促进癌细胞的成像。
[0065]
本发明提供了上述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
[0066]
将g-四链体构象的as1411寡核苷酸分散液与具有式1所示结构的钌配合物混合，进行自组装和透析，得到as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针。
[0067]
在本发明中，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸分散液优选为g-四链体构象的as1411寡核苷酸的含钾离子缓冲溶液分散液。在本发明中，所述含钾离子缓冲溶液优选为tris-hcl kcl缓冲溶液，所述tris-hcl kcl缓冲溶液的ph值优选为7.2。在本发明中，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸分散液的浓度优选为50～100μmol/l，更优选为60～80μmol/l。
[0068]
在本发明中，所述g-四链体构象的as1411寡核苷酸的制备方法，优选包括以下步骤：
[0069]
将as1411寡核苷酸与含钾离子缓冲溶液混合，依次进行高温变性和低温复性，得到g-四链体构象的as1411寡核苷酸。
[0070]
在本发明中，所述含钾离子缓冲溶液优选为tris-hcl kcl缓冲溶液。本发明对所
述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。
[0071]
在本发明中，所述高温变性的温度优选为90～100℃，更优选为95℃，时间优选为5min；所述低温复性的温度优选为4～8℃，更优选为5～6℃，时间优选为24～72h,更优选为36～60h。在本发明中，所述高温变性目的是将dna序列变性成为单链形式，所述低温复性的目的是让单链dna围绕k
+
离子形成g-四链体dna的二级结构。
[0072]
在本发明中，所述具有式1所示结构的钌配合物优选以缓冲溶液分散液的形式提供。在本发明中，所述缓冲溶液优选为tris-hcl kcl缓冲溶液，所述tris-hcl kcl缓冲溶液的ph值优选为7.2。在本发明中，所述钌配合物缓冲溶液分散液的浓度优选为20～100μmol/l，更优选为50μmol/l。
[0073]
在本发明中，所述g-四链体构象的as1411与钌配合物的摩尔比优选为1:1。
[0074]
本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。
[0075]
在本发明中，所述自组装的温度优选为25～40℃，更优选为37℃，时间优选为4～12h，更优选为8～10h。
[0076]
在本发明中，所述透析的截留分子量优选为0.5～3.0kda，更优选为1～2kda；在本发明中，所述透析的温度优选为更优选为37℃，时间优选为1～3天。
[0077]
本发明提供了上述as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针在制备癌诊断试剂中的应用。在本发明中，所述癌诊断试剂优选为乳腺癌癌诊断试剂，进一步优选为乳腺浸润性导管癌诊断试剂。
[0078]
在本发明中，as1411@rupep纳米探针的构建过程及其用于ncl靶向识别的乳腺癌成像的原理如图1所示。
[0079]
下面结合实施例对本发明提供的as1411寡核苷酸复合钌配合物纳米探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0080]
实施例1
[0081]
(1)合成钌配合物rupep
[0082]
于30ml微波反应管中加入[ru(bpy)2cl2]
·
2h2o(105mg,0.2mmol)，p-epip(236.7mg,0.3mmol)，乙二醇和水混合溶剂，通氩气10min，微波辅助120℃加热20min，反应毕，冷却至室温，加水稀释，过滤除去不溶物，得深红色滤液，滤液中加入过量的高氯酸钠，静置过夜，产生大量橙红色沉淀，过滤得沉淀，分别用水，乙醚洗涤数次后，真空干燥器中干燥，得到橙黄色固体。粗产品乙腈溶解，过200-300目中性氧化铝柱，乙腈淋洗下主红色组分，减压旋干溶剂，得到棕红色固体，即为钌配合物rupep。
[0083]
(2)合成as1411@rupe纳米探针
[0084]
所用as1411寡核苷酸购自上海生工生物科技有限公司，as1411寡核苷酸的序列如seq id no.1所示，具体为5’至3’，tggtggtggttgttgtggtggtggtggt。
[0085]
将as1411寡核苷酸与tris-hcl kcl缓冲液中混合，在95℃下变性5分钟，然后在4℃下复性24小时，得到g-四链体构象的as1411分散液，浓度为50μm。
[0086]
将所述g-四链体构象的as1411分散液与钌配合物rupep(50μm，tris-hcl kcl缓冲液)按照体积比1:1混合，使用截留分子量为0.5～3.0kda的透析袋在37℃下透析3天，所得
产物冷冻干燥，得到as1411@rupe纳米探针。
[0087]
钌配合物rupep咪唑环上的n原子能够与g-四链体构象的as1411寡核苷酸中的g15和t16残基上的两个h原子间形成两个分子内氢键，其示意图如图2所示。
[0088]
(3)as1411@rupe纳米探针的表征
[0089]
rupep(5μm)和as1411@rupep(5μm)在pbs溶液中的电子吸收光谱和荧光发射光谱如图3所示。由图3可以看出，纳米探针的荧光强于等摩尔的rupep，这可能归因于rupep与as1411相互作用的开启以至于增强了纳米探针的荧光发射。
[0090]
as1411@rupep纳米探针的tem图像如图4所示。由图4可以看出，as1411@rupep纳米探针是平均直径为200nm的单分散的纳米颗粒。
[0091]
as1411@rupep纳米探针的原子力显微镜显微图(afm)如图5所示，由图5可以看出，as1411@rupep纳米探针纳米颗粒分布均匀，平均直径为200nm。
[0092]
as1411@rupep纳米探针元素光谱的eds分析图如图6所示。由图6可以看出，as1411分子中p原子(16.41％)有强烈的信号，rupep中ru原子(4.83％)有明显的信号。此外，as1411和rupep中还有c(33.24％)、n(18.32％)和o(27.20％)的明显的信号峰。以上色散谱分析表明as1411和rupep的组装成功构建了纳米探针。
[0093]
as1411@rupep纳米探针的eds mapping图如图7所示。由图7可以看出，c、p和ru元素分布不均匀，p和ru主要集中在颗粒核心，而c优先发现在颗粒表面。我们在整个样品中都观察到了类似的性质，p和ru有很强的空间相关性，这两种原子在颗粒中心很丰富。
[0094]
as1411@rupep纳米探针的粒径分布图如图8所示。其中，粒径分布用dls法测量，由图8可以看出，纳米探针的平均长度范围在200～500nm。
[0095]
实施例2细胞摄取和纳米探针在肿瘤细胞核内的定位
[0096]
(1)用ncl高表达的乳腺癌细胞mda-mb-231来研究纳米探针对肿瘤细胞的靶向识别能力。纳米探针通过内吞进入细胞核的过程示意图如图9所示。
[0097]
as1411@rupep(5μm)在mda-mb-231细胞中的细胞定位如图10所示。由图10可以看出，在和mda-mb-231乳腺癌细胞孵育后，纳米探针被细胞完全吸收，并从细胞核发出强烈的红色磷光，可以观察到红色磷光共定位在同一位置，并且完全覆盖了蓝色荧光条带。在放大的图像中，双色荧光条带局限于细胞核。来自纳米探针和dapi的三条色带的重叠率非常接近100％。此外，来自深度切片图像的3d断层扫描成像中的红色荧光填充了整个细胞核，并与纳米探针和dapi观察到的染色模式相匹配。这些结果表明，纳米探针被肿瘤细胞有效地吸收和滞留，并定位于细胞核中。
[0098]
mda-mb-231乳腺癌细胞在2h内处理as1411@rupep(5μm)实时成像结果如图11所示，图11中，每15分钟使用磷光显微镜捕获的细胞形态学。
[0099]
(2)为了确定探针从细胞外环境转移至细胞核的摄取机制，分别在37℃和4℃下用as1411@rupep纳米探针(5μm)培养mda-mb-231细胞6小时。在37℃孵育后，大多数纳米探针定位在细胞核，而在4℃孵育后，纳米探针仍滞留在细胞质中。所得结果如图12所示。基于上述结果，我们假设纳米探针通过一条能量依赖途径进入细胞核，该途径源于一种主动的转运机制，该机制通过胞内反式定位驱动ncl进入细胞核。这些过程在4℃时变慢了。通常，内吞作用描述了各种细胞外物质进入细胞的常见机制，该机制是一种能量依赖的过程。在这个过程中，笼状蛋白包被的小孔是主要的质膜特化载体，参与了对多种分子的吸收。
[0100]
为了明确纳米探针参与细胞内化的特定内吞途径，我们在与纳米探针孵育前先用氯丙嗪(网格蛋白依赖抑制剂，6nm)预处理mda-mb-231细胞1小时。然后我们观察到纳米探针的荧光信号主要定位在细胞膜表面，同时胞浆内几乎无荧光分布。这些数据表明，活的癌细胞通过内吞途径处理纳米探针。众所周知，2-脱氧-d-葡萄糖和寡霉素作为一种常见的离子载体抑制剂组合，它们能降低atp合成的能力，因此被用来确定本质核聚集的机制。经2-脱氧-d-葡萄糖和寡霉素处理后，纳米探针对细胞核的染色被显著抑制。这一数据再次支持了该观点，即纳米探针进入细胞核的主要原因是通过一个能量依赖的主动转运途径。
[0101]
(3)在37℃下，用as1411@rupep处理mda-mb-231细胞6小时，所得mda-mb-231细胞的生物透射电镜成像结果如图13所示。由图13可以看出，纳米探针被包裹在细胞质和细胞核中的囊泡中。可以观察到，纳米探针可以诱导mda-mb-231细胞产生多个囊泡来携带它们进入细胞质，并移动到细胞核膜附近(黄色箭头，步骤1和2)。在这些囊泡中发现了许多不同大小和形状的纳米探针复合体。这些囊泡包含着纳米探针颗粒逐渐接近细胞核，它们接触细胞核膜引起囊泡破裂(步骤2)，然后纳米探针颗粒通过atp依赖的内吞作用进入细胞核(步骤3)。纳米探针复合体从囊泡中逃逸的图像通过在细胞核中的黄色箭头显示(步骤4)。从囊泡中逃逸是它们完成多方面活动的一个重要功能。因此假设纳米探针颗粒在细胞核中的分布与atp依赖的ncl转运有关，该过程依赖于纳米探针中as1411组分识别和结合ncl。
[0102]
(4)as1411@rupep纳米探针靶向识别细胞膜表面ncl，选择性成像肿瘤细胞的假设过程如图14所示。
[0103]
ncl是一种主要的核仁蛋白，能够在细胞表面、细胞质和细胞核之间穿梭，这一特性使ncl成为抗肿瘤药物选择性递送的有吸引力的靶标，而不会影响正常细胞。许多研究表明，ncl在人乳腺癌细胞中过表达，并主要分布在细胞膜表面。然而，在正常的上皮细胞中，ncl主要局限于细胞核内，在细胞膜中稀缺。ncl在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的分布如图15所示。可以看出，在两种情况下，ncl都清楚地位于核仁中，与dapi染色的细胞核和未染色的核仁完美匹配，说明ncl主要分布在细胞核中，仅少量分布于细胞膜，而且在肿瘤细胞中分布丰富。
[0104]
ncl在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的表达如图16所示。这说明ncl在mda-mb-231细胞中的表达明显高于mcf-10a细胞。
[0105]
(5)as411@rupep纳米探针在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞和人正常mcf-10a细胞中的定位如图17所示。由图17可以看出，对于mcf-10a细胞，纳米探针无法进入细胞内，正常上皮细胞中的ncl靶点表现出微弱且弥散的摄取。但对于mda-mb-231细胞，在纳米探针存在的情况下，细胞核中dapi染色和探针颜色重合，且ncl位点数量比mcf-10a细胞明显增加。这些结果表明，纳米探针可以选择性识别并激活细胞细胞表面ncl受体到细胞核的运输，从而促进乳腺癌细胞的成像。
[0106]
(6)为了进一步评价纳米探针对乳腺癌细胞的选择性，本发明显微镜载玻片上建立了mda-mb-231和mcf-10a细胞共培养模型。考虑到ncl在人乳腺癌细胞mda-mb-231中的过表达和在正常永生化的人表皮细胞mcf-10a中的缺乏，可以推测纳米探针的摄取应该优先定位在乳腺癌细胞系中。为了在共培养中区分这两种细胞系，使用通过gfp标记肌动蛋白的绿色荧光mcf-10a细胞，并用hoechst 33258蓝色荧光标记共培养体系中的所有细胞，将纳米探针与共培养细胞在5μm下孵育6小时。
[0107]
mda-mb-231和mcf-10a细胞在0.2ml as1411@rupep(5μm)共培养6h后的lscm图像如图18所示。叠加数据使用image pro plus进行分析，所得结果如图19所示。结果显示，mda-mb-231细胞的细胞核内有强烈的红色磷光，而在mcf-10a细胞中只观察到了微弱的红色磷光。这些结果清楚地表明，纳米探针能特异性地靶向和识别混合培养中的肿瘤细胞。
[0108]
实施例3体内成像肿瘤细胞
[0109]
as1411@rupep在mda-mb-231肿瘤balb/c小鼠体内的表现
[0110]
(1)24周龄雌性转基因mmtv-pymt原发性乳腺癌小鼠(25-30g)购自常州cavens实验动物有限公司。以3只mmtv-pymt原发性乳腺癌小鼠为对照组，静脉注射纯生理盐水(100μl)，评价纳米探针不同时间方案在体内的靶向肿瘤效果和图像质量。另3只小鼠分别静脉注射等效纳米探针剂量20μm(100μl)。在0、2、4、6、8、12、24、48、72和108h对所有动物进行近红外监测。在24、72和108h分别切除肿瘤结节和器官(心、肝、脾、肺、肾和脑)，并进行离体近红外成像。在注射纳米探针后的不同时间点拍摄特定的肿瘤靶向图像如图20所示。定量测定小鼠肿瘤区和非肿瘤区as1411@rupep的荧光强度结果如图21所示。
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由图20～21可以看出，在注射探针前对小鼠进行近红外成像，显示几乎没有信号。由于探针的快速分布，尾静脉注射后在小鼠尾巴处立即可见近红外磷光。由于纳米探针通过增强的渗透性和滞留效应(epr效应)，可以快速识别并结合肿瘤组织中的ncl靶点，使其在最初的6小时内可以快速界定小鼠的肿瘤区域。在12小时的时候，由于来自肿瘤部位残留信号和来自正常组织的荧光背景的干扰，被点亮的肿瘤区域的面积增加。随着时间的延长，由于正常组织荧光的干扰和探针的清除及非特异性摄取，肿瘤区域的界定变得不够清晰。
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相比之下，非靶向探针rupep在6小时内在整个小鼠体内观察到强烈的磷光，这表明游离的rupep在迅速分布全身，并随着时间的推移而增加。以上结果表明，在系统给药6小时内，本发明纳米探针能够选择性地快速定位肿瘤组织。最终，纳米探针会在全身分布，但仍主要积聚在肿瘤中。
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定量测定解剖器官或组织as1411@rupep(平均cps)的荧光强度结果如图22所示，图22中，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。由图22可以看出，24小时和48小时纳米探针在肿瘤中的保留是相似的，说明纳米探针具有较长的肿瘤保留时间。解剖后的体外图像显示，不同器官的荧光强度决定了纳米探针和非靶向rupep组分的定量分布。两种探针在脑组织中的信号在24小时时明显高于48小时，而在肾脏中的信号在24小时时显著低于48小时。这表明两种探针均通过血脑屏障运输，并通过肾脏过滤从体内清除。
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as1411@rupep在24、72和108h的组织分布和药物代谢如图23所示。图23可以看出，低代谢和缓慢的肾脏清除导致了探针在肿瘤中的高聚集，使得纳米探针的荧光强度在24小时时高于48小时。体内测量和器官摘除后的体外测量都表明探针在肿瘤和肾脏的聚集，尽管探针会在肾脏中被清除，但这些数据都一致表明，该探针用于特定肿瘤的非侵入性实时体内成像是可行的。
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实施例4体内初步安全性评价
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用健康的昆明小鼠评估纳米探针的全身毒性，通过尾静脉注射纳米探针，剂量为50mg/kg/天，连续3天。然后，取心、肝、脾、肺、肾和脑等原代组织，he染色，光学显微镜下观察组织病理学变化，所得结果如图24所示，比例尺:50μm。所有实验组在研究期间均未发现死亡和严重的体重下降。由图24可以看出，两组的主要组织，包括心、肝、脾、肺和肾，均未出
现明显的组织病理学异常和损害。这些结果说明多次剂量的纳米探针对这些组织的影响较小，表明该纳米探针没有引起明显的副作用。
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实施例5纳米探针作为乳腺癌诊断试剂在临床组织标本中的潜在应用
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使用了5例乳腺浸润性导管癌患者的新鲜活检标本来评价纳米探针靶向ncl对肿瘤组织成像的有效性。5例浸润性导管癌患者标本的人乳腺癌组织切片苏木精-伊红染色组织化学分析如图25所示。由图25可以看出，切除标本组织学检查显示，明显的肿瘤性病变由大的多角形细胞组成，呈浸润性固体和微乳头状排列，细胞质丰富，嗜酸性、空泡化、泡沫状。病变的原位区域含有呈鞋钉外观排列的肺泡状细胞。此外，可以很明显看到图像中的大多数核都产生了分割，几乎没有与非上皮核对象相对应的轮廓。然而，肿瘤组织和癌旁组织之间有明显的区别。可以看到，肿瘤组织细胞排列紊乱，结构松散，核仁比正常细胞大且染色更深。
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在荧光显微镜下观察新鲜人浸润性导管癌组织冰冻切片成像结果如图26所示。由图26可以看出，体外肿瘤标本的组织学分析中，在dapi通道下可以观察到病理切片中的蓝色磷光。此外，核仁素高表达的癌变区域(绿色荧光点)和核仁素低表达的癌旁区域有明显的分界。
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clsm放大观察核仁素和纳米探针在癌区和癌旁区的分布，结果如图27所示。图27中，全组织dapi染色为蓝色，ncl染色为绿色，纳米探针nanoprobe染色为红色。由图27可以看出，核仁素在肿瘤区域与细胞核内的红色磷光大量重合，而在癌旁区域没有纳米探针和核仁素的荧光信号。
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利用image-pro plus软件分析癌旁细胞三通道发射强度的合并曲线如图28所示。由图28可以看出，纳米探针的红色磷光在癌组织中与核仁素的绿色荧光完美融合，而在癌旁组织中没有明显的红色磷光。
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以上结果表明，本发明as1411@rupep纳米探针可以有效地、有区别地点亮乳腺浸润性导管癌活检标本中的癌组织。
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通过免疫印迹法检测了ncl在肿瘤组织和癌旁正常乳腺组织中的表达，5例浸润性导管癌患者癌旁组织ncl蛋白表达情况(n＝5)如图29所示。5例浸润性导管癌标本ncl表达及肿瘤分级定量分析如图30所示，图30中，*p《0.05，**p《0.01,ns-不显著。由图29可以看出，大多数肿瘤组织的ncl水平显著高于临近的正常组织。由图30可以看出，结合临床诊断报告的结果，ncl的高表达表明肿瘤的恶性程度较高。这表明ncl的表达水平是不同恶性程度的人浸润性导管癌的一个可行的界定特征，可以用于预测肿瘤的恶性程度。通过这种方法，纳米探针可以用于临床鉴别浸润性导管癌的恶性程度。
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实施例6肿瘤分级诊断的潜在临床应用
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通过检测活检组织切片中的发光强度，来评估纳米探针作为一种方便、快速的探针来确定肿瘤分级的可行性。其中，纳米探针检测肿瘤组织标本的操作流程流程图如图31所示。
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浸润性导管癌标本正常及i-iii级组织he染色病理特征如图32所示。由图32可以看出，he染色结果显示，正常组织细胞排列紧密，呈淡红色，而且ⅰ级标本显示肿瘤边界清晰，对邻近正常组织没有明显侵袭。然而，随着肿瘤发展到ⅱ级和ⅲ级，因为大量相互交织的肿瘤，恶性肿瘤和健康组织间的边界变得模糊，最终消失。
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5μm as1411@rupep纳米探针对正常和不同肿瘤分级标本的成像结果如图33所示。由图33可以看出，纳米探针对不同级别的浸润性导管癌的成像能力有显著差异，恶性程度越高，磷光强度越强。
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不同样品中纳米探针的发射强度曲线如图34所示。由图34可以看出，在这些临床标本中，纳米探针在正常组织中发出极弱的红色信号，其标记线的强度约为0～60a.u.，而在ⅰ～ⅲ级组织中观察到相当强的红色磷光，其标记线的强度范围为110～260a.u.。
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为了进一步明确纳米探针通过磷光强度范围区分肿瘤分级的有效性和可靠性，还需要通过扩大标本数量和增加重复次数来验证。每组10例不同肿瘤分级的正常标本，分别进行3个重复等面积平均强度的统计分析，所得结果如图35所示，图35中，n＝10，*p《0.05，**p《0.01,ns-不显著。通过对每组5个标本进行3次重复的统计分析，发现纳米探针在正常组织中的等面积平均强度为7～21，在ⅰ级组织中为15～68，在ⅱ级组织中为54～134，在ⅲ级组织中为88～152。
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综上所述，本发明结合as1411优异的肿瘤靶向能力和钌配合物(rupep)强大的磷光发射能力，制备了一种as1411@rupep纳米探针，该探针可以作为一种方便快速的工具，通过靶向识别ncl来点亮和区分体内和体外的肿瘤细胞。此外，该纳米探针还可以指示乳腺癌患者病理切片中的肿瘤分级和分期，为临床乳腺癌诊断成像提供一种有效的途径。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。