一种荚膜多糖及其抗生素纳米颗粒的合成方法及应用

1.本发明涉及一种荚膜多糖及其抗生素纳米颗粒的合成方法及应用，属于纳米材料和纳米医学技术领域。


背景技术：

2.目前，由微生物感染引起的疾病对人类健康造成了极大的危害。并且随着微生物抗药性的增强，相关疾病的防治难度也越来越大。生物膜是难以消除的持续性微生物污染源，并且可能降低细菌对某些抗生素等药物的敏感性，导致相关疾病难以治愈。抗生素常用来杀死或抑制各种病原微生物，但抗生素的使用可能导致耐药细菌的广泛出现(ciofu,rojo-molinero,macia,&oliver,2017)。因此，减少抗生素用量，减少感染部位细菌的增殖，对于感染性疾病的治疗非常重要。
3.在这些抗生素中，氨基糖苷类抗生素以其广谱活性、快速抑菌作用、良好的化学和药代动力学特性而受到广泛关注。阿米卡星(am)是最常用的氨基糖苷类抗生素之一，适用于对抗革兰氏阴性菌的感染(meyer,1975)。已广泛用于治疗对其他抗生素耐药的各种感染。但是细菌为了生存和繁殖会调节自身代谢以适应环境条件，从而产生耐药性。并且单独使用抗生素消除生物膜的效果往往不佳，通常需要手术治疗的干预。开发新的抗生素药物已经不能够满足目前的需求，急需开发一些降低抗生素工作浓度以及对抗生物膜的策略。
4.随着纳米技术的蓬勃发展，抗菌剂和纳米颗粒的组合可以防止细菌耐药性的产生，一些脂质体、高分子纳米颗粒已经被开发出来降低抗生素用量并能够用于抑制生物膜的形成(abass,afroz,sourabh,javed,&ameer,2018)。虽然纳米材料能够降低抗生素工作浓度，但是目前开发出来的抗生素载体的粒径普遍较大(fatima,iqbal,panda,samim,talegaonkar,&ahmad,2018)，一些金属纳米颗粒还会对微生物本身以及人类细胞产生毒性，生物相容性差(liao,li,&tjong,2019)。微生物荚膜多糖作为一种纳米材料，具有较小的粒径尺寸，并且来源于微生物，安全无毒对人体无害。因而是一种具有发展前景的纳米颗粒。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明通过共价交联，将阿米卡星(am)与荚膜多糖交联在一起，获得共价交联物cps-am。cps-am纳米颗粒对革兰氏阴性菌均表现出了很好的抗菌效果，具有优良生物安全性和高效抗菌性能，并且能够抑制生物膜的生长并去除预先形成的生物膜。以解决现有一些抗菌材料细胞毒性大、生物安全性差、抗菌效果不佳及高浓度抗生素使用产生耐药性等问题。该方法有望在开发降低抗生素用量的新型抗菌剂方面得到广泛应用。本发明具体技术方案如下：
6.一种荚膜多糖，由菌株号为lcc-605的植物乳杆菌发酵培养液经超声醇沉得到，命名为cps-605。
7.一种上述荚膜多糖的制造方法，发酵温度为31℃，时间为18h；所述超声醇沉的超
声功率为40w，时间为30min，间隔时间为5s。
8.一种荚膜多糖-抗生素纳米颗粒的合成方法，包括以下步骤：
9.(1)将cps-605配成1-4mg/ml的水溶液，并调节其ph＞10，
10.(2)将溴化钠与tempo试剂溶于水中，与上述配好的cps-605水溶液混合后，加入8.5ml次氯酸钠，于4℃，100-1000rpm条件下反应30min-1h，
11.(3)将上述氧化后的cps-605、edc
·
hcl、nhs溶于去离子水中室温、100-1000rpm条件下反应1-3h，然后向其中加入氨基抗生素和/或多肽类抗菌物质，室温100-1000rpm下反应过夜。
12.进一步的：所述氨基抗生素和/或多肽类抗菌物质为链霉素、卡那霉素、多粘菌素b以及细菌素中的一种或者几种。
13.进一步的：所述氨基抗生素和/或多肽类抗菌物质为阿米卡星。
14.进一步的：所述tempo试剂与cps-605比为1:(1-5)。
15.进一步的：所述tempo试剂与cps-605比为1:4。
16.进一步的：所述氧化后的cps-605与阿米卡星质量比为1:(0.1-1)。
17.进一步的：所述氧化后的cps-605与阿米卡星质量比为1:0.78。
18.一种荚膜多糖-抗生素纳米颗粒的应用，将上述任一方法合成的荚膜多糖-抗生素纳米颗粒应用于抗菌抗生物膜方面。
19.有益效果：
20.1.本发明获得的荚膜多糖来源于微生物，微生物生长周期快、原料廉价易得、产物产量高，并且生产不受地理、气候、季节等自然条件限制。
21.2.本发明获得的荚膜多糖是天然产生的，未经任何化学合成，制备过程简单，且避免了化学合成过程中加工助剂的潜在残留，且其主要成分多糖，安全无毒对人体无害。
22.3、cps-am纳米颗粒比游离am具有更好的抗菌效果。cps-am纳米颗粒杀死100％大肠杆菌和绿脓杆菌的浓度分别为100μg/ml和30μg/ml，远远低于相应的游离am杀菌浓度。
23.4、cps-am纳米颗粒能够抑制大肠杆菌生物膜，并对大肠杆菌成熟生物膜有明显的清除作用。
24.5、cps-am的细胞毒性低、反应时间短，反应温度仅常温即可，因此，该方法有望在绿色合成抗菌纳米颗粒方面得到广泛应用。
附图说明
25.图1为实施例中植物乳杆菌lcc-605产生的荚膜多糖电子显微镜下示意图，
26.图2为实施例中植物乳杆菌lcc-605产生的荚膜多糖粒径统计结果示意图，
27.图3为实施例中制备的cps-am纳米颗粒的电子显微镜下示意图，
28.图4为实施例中制备的cps-am纳米颗粒的粒径统计结果示意图，
29.图5为实施例中cps和cps-am的电位结果示意图，
30.图6为实施例中cps-am抗大肠杆菌实验结果示意图，
31.图7为实施例中cps-am抗绿脓杆菌实验结果示意图，
32.图8为实施例中cps-am短时间内抗大肠杆菌实验结果示意图，
33.图9为实施例中cps-am短时间内抗绿脓杆菌实验结果示意图，
34.图10为实施例中大肠杆菌经cps-am作用后被破坏情况示意图，
35.图11为实施例中绿脓杆菌经cps-am作用后被破坏情况示意图，
36.图12a为实施例中cps-am纳米颗粒处理过的大肠杆菌生物膜培养24h激光共聚焦观察3d图，激发波长为488nm，所用cps-am为200μg/ml，
37.图12b为实施例中cps-am纳米颗粒处理过的大肠杆菌生物膜培养24h激光共聚焦观察3d图，激发波长为488nm，所用cps-am为0μg/ml，
38.图13为实施例中生长24h后的大肠杆菌生物膜经0μg/ml cps-am纳米颗粒处理24h的扫电图，
39.图14为实施例中生长24h后的大肠杆菌生物膜经200μg/ml cps-am纳米颗粒处理24h的扫电图，
40.图15a为实施例中生长24h后的大肠杆菌生物膜经cps-am纳米颗粒处理24h的激光共聚焦观察3d图，所用cps-am为0μg/ml，
41.图15a-1为图15a的灰度图，
42.图15b为实施例中生长24h后的大肠杆菌生物膜经cps-am纳米颗粒处理24h的激光共聚焦观察3d图，所用cps-am为300μg/ml，
43.图15b-1为图15b的灰度图，
44.图16为实施例中制备的cps-am纳米颗粒对动物细胞的毒活性评价示意图，
45.图17为实施例中制备的cps-am纳米颗粒溶血性实验示意图。
具体实施方式
46.下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
47.实验预处理
48.菌株活化方法：将保藏于-80℃冰箱的大肠杆菌和绿脓杆菌菌株按3％的接种量接种到10ml lb肉汤培养基中，于37℃培养12h活化菌株。
49.活菌数的测定方法：活菌数的测定采用稀释涂平板法进行，具体如下：用移液枪吸取0.1ml样品液于无菌的的离心管中用无菌生理盐水稀释成稀释度为10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，10-7
，10-8
，10-9
，10-10
，10-11
，10-12
。选择稀释度为10-4
至10-12
涂布于lb培养基，每个稀释度做三个重复，置于31℃的恒温箱中培养24h后计数。
50.实施例
51.cps-605的提取
52.荚膜多糖提取采用醇沉法进行，具体如下：在液体mrs或乳清中发酵18h的发酵液经离心(14000
×
g，4℃，30min)收集菌体，将获得的菌体用0.85％nacl洗涤两次，重悬于0.85％nacl中进行超声处理(40w，4℃，30min，间隔5s)，离心(15000
×
g，4℃，15min)收集上清液，向收集的上清液中加入终浓度为4％的tca(三氯乙酸)放于4℃冰箱过夜处理，离心(14000
×
g，4℃，30min)去除蛋白，在上清液中加入3倍体积的无水乙醇，放于4℃冰箱醇沉过夜，离心(14000
×
g，4℃，30min)收集沉淀，沉淀用14000da的透析袋于4℃条件下流动透析72h，冻干得到荚膜多糖(cps-605)。
53.cps-am纳米颗粒的合成
54.将20mg cps-605分散在5ml去离子水中并用0.1m的naoh将溶液ph值调节至大于10。然后将cps-605分散液与5mg tempo、0.1g nabr、8.5ml naclo混合并在室温下搅拌1h。将所得溶液用去离子水透析(mw＝3kda)24h以去除残留的小分子，从而获得氧化的cps-605。
55.将透析后获得的氧化cps-605与1ml edc-hcl溶液(56μg/ml)混合，在室温下搅拌10min，加入1ml nhs溶液(34μg/ml)并在室温90rpm转速下孵育1h。添加15.6mg阿米卡星，并将混合物在室温下磁力搅拌24h。将所得溶液用去离子水透析(mw＝3kda)24h以去除残留的阿米卡星，从而获得荚膜多糖-阿米卡星纳米颗粒。
56.下面对本实施例合成的cps-605以及cps-am纳米颗粒进行性能测试实验
57.cps-605和cps-am的形貌观察
58.将上述实施例中获得的cps-605和cps-am纳米颗粒分散在去离子水中，制备成1mg/ml的分散液，并分别取10μl分散液滴在硅片上进行场发射扫描电子显微镜观察，形成的cps-605和cps-am纳米颗粒为球形结构，如图1和图3所示。同时进行粒径分布统计，结果表明该荚膜多糖颗粒粒径在65.7nm左右，该荚膜多糖-阿米卡星纳米颗粒粒径在49.9nm左右，如图2和图4所示。
59.cps、cps-am带电情况
60.cps、cps-am纳米颗粒的zeta电位采用zetasizer 3000(malvern instruments,nano zs,united kingdom)进行分析，结果如图5所示。
61.cps-am的最低抑菌浓度(mic)
62.用lb肉汤将cps-am稀释至合适的浓度范围，将细菌培养物在lb培养基中稀释至600nm波长处的光密度(od
600
)为0.05，并在每个离心管中加入等量的细菌悬液。将离心管置于37℃的振荡培养箱中培养24h，测量每个离心管中悬浮液的od
600
值。结果表明，cps-am纳米颗粒对大肠杆菌的最低抑菌浓度为100μg/ml对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为30μg/ml。
63.cps-am的抗菌性能
64.将活化的细菌稀释至od
600
为0.05。将不同浓度的阿米卡星和cps-am纳米颗粒分别添加到细菌悬浮液中，37℃培养24h后测定活菌数。结果表明cps-am显示出优秀的抗菌活性，并能够减少阿米卡星的用量。大肠杆菌存活率如图6(虚线圆圈代表没有细菌存活)所示，8.8μg/ml的cps-am可以杀灭100％的大肠杆菌，但对于单独的阿米卡星，浓度为26.4μg/ml时仍有大肠杆菌存活。对于绿脓杆菌结果如图7所示，仅需要2.8μg/ml的cps-am就可杀灭99％的细菌，远低于使用单独的阿米卡星。
65.cps-am的快速杀菌能力
66.将活化的细菌稀释至od
600
为0.05。将不同浓度的cps-am添加到细菌悬浮液中，于37℃分别培养0、10、20、30和60min后测定活菌数。cps-am显示出显著的快速杀菌活性。如图8所示。大肠杆菌在300μg/ml的cps-am暴露10min，99.9％的细菌被杀死。而当时间达到30min和60min时，仅100μg/ml的cps-am就可以完全抑制所有大肠杆菌。cps-am对绿脓杆菌也有快速杀菌活性，如图9所示，100μg/ml的cps-am在20min就可以消灭99％以上的绿脓杆菌。总之，cps-am在处理后10min内就可以消灭99.99％的大肠杆菌和铜绿假单胞菌。
67.cps-am对生物膜的抑制能力
68.将活化的大肠杆菌在lb肉汤中稀释至od
600
为0.1。将100μl的菌液转移到无菌玻璃培养皿中，加入不同浓度的cps-am(0，200μg/ml)，在37℃条件下静置培养72h后取样，从培养皿中倒出肉汤后，用无菌生理盐水轻轻冲洗3次，以去除未附着的细胞和培养基成分。洗涤后的生物膜用live/dead baclight细菌活力试剂盒染色。将培养皿在37℃避光孵育20min。随后，用去用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。
69.结果如图12a和12b所示，cps-am具有抑制生物膜的形成的能力。200μg/ml的cps-am处理后的大肠杆菌生物膜生物量显著降低。图12a和12b中，x、y、z三个数轴上的单位均为μm。在200μg/ml cps-am中生长72小时的生物膜只有7μm左右，如图12a所示；在相同条件下，在不添加cps-am的培养基中生长的生物膜为20μm，如图12b所示。并且，经cps-am处理后的生物膜中存在明显的死细胞，如图10和图11所示。
70.cps-am对生物膜的去除能力
71.将活化的大肠杆菌在lb肉汤中稀释至od
600
为0.1。将100μl的菌液转移到无菌玻璃培养皿中，并在37℃条件下静置培养24h。随后，去除培养基并加入100μl不同浓度的cps-am nps(0，300μg/ml)cps-am nps，并在在37℃下静置培养24h。如前述方法激光共聚焦扫描显微镜图像对生物膜形貌进行观察。并在处理24h后拍摄生物膜的扫描电子显微镜图像。如图13所示，未加入cps-am的样品能够观察到质密的生物膜，而加入300μg/ml cps-am如图14所示，处理后生物膜逐渐松散减少。虽然不能清楚地观察到细菌细胞的破坏，但可以发现细菌处于自由状态，不能形成致密的生物膜。如图15a，共聚焦图像显示未经处理的生物膜几乎全部为绿色，而加入300μg/ml cps-am如图15b所示，处理后的生物膜死亡逐渐增多。
72.cps-am nps安全性评价
73.为了评估cps-am的生物安全性，对cps-am纳米颗粒进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)测定以及溶血测定，具体步骤如下。
74.mtt测定方法为：将hp细胞以1
×
105个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37℃和5％co2下孵育24h。之后，将培养基更换为含有不同浓度cps-am的新鲜dmem培养基，并在相同条件下再培养24h。将10μl mtt溶液(5mg/ml)添加到每个孔中。再孵育4h后，弃去溶液，加入150μl dmso。使用酶标仪记录570nm处的吸光度。
75.溶血测定方法为：将小鼠全血以2500rpm离心5min，洗涤3次以去除残留血清，然后悬浮在pbs缓冲液中。收集的红细胞分别用不同浓度的cps-am处理。在37℃孵育1h后，将混合物以4000rpm的转速离心5min。用pbs和超纯水孵育的红细胞分别作为阴性对照和阳性对照。使用以下等式计算溶血百分比：
76.溶血％＝(样品吸光度阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度阴性对照吸光度)
×
100％
77.结果如图16所示，cps-am具有良好的生物相容性。cps-am在300μg/ml时对at ii细胞几乎没有细胞毒性，高于其对大肠杆菌(200μg/ml)和绿脓杆菌(100μg/ml)的工作浓度。cps-am对红细胞的溶血活性也可以忽略不计，如图17所示，用300μg/mlcps-am处理几乎没有观察到溶血现象。
78.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
79.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。