一种茄病镰刀菌及其应用

1.本发明涉及植物病原菌防治技术领域，特别是涉及一种茄病镰刀菌及其应用。


背景技术：

2.柑橘，作为一种重要的农业经济作物，其安全生产有着十分重要的意义。危害柑橘的病原菌种类繁多，柑橘黑点病菌是其中之一。柑橘黑点病严重影响柑橘的品质，给果农造成重大经济损失。柑橘黑点病一般发生在柑橘的幼果、新梢和嫩叶发，在病部表面产生无数的褐色、黑褐色散生或密集成片的硬胶质小粒点，严重影响柑橘外观品质，严重降低果实品质，导致巨大的经济损失。此外，柑橘黑点病菌还可以在植物组织残体上进行腐生生长，并大量形成子实体，其中果园内带有病菌的死亡枝干是柑橘黑点病主要的侵染来源。
3.生物防治是指利用生物及其代谢产物防治植物病虫害方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群密度，即生物群防治生物群。与传统的防治技术相比，生物防治技术具有不污染环境、对人和其他生物安全、产品无残留、易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，在有害生物综合防治中发挥着越来越重要的作用。到目前为止，真菌、细菌、放线菌、酵母菌都可用于生物防治。利用细菌防治有害微生物是开发和利用微生物资源的重要研究领域之一，亦是最具有潜力、应用前景最为广阔的有效途径之一。细菌防治优势主要有以下几点：一是繁殖速度快、培养成本低廉；二是对病原菌的作用方式较广，如细菌素、抗生素、胞外裂解酶、脂肽类等多种形式；三是有些细菌具有防病、促生的双重作用。
4.公开号为cn109221152a的专利申请公开了一种含有活性成分氟唑菌酰胺和噻菌铜的氟唑菌酰胺和噻菌铜的杀菌农药组合物，其二者的重量比为1∶49～49∶1。将该组合物制备成各种农药制剂，可用于防治果树、林木、蔬菜、粮食作物等农林作物的各种细菌和真菌性病害。
5.文献“陈国庆等，防治柑橘黑点病药剂的离体和田间筛选，《浙江大学学报(农业与生命科学版)》，2010年04期”公开了在实验室条件下3种麦角甾醇合成抑制剂类杀菌剂(戊唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐)和代森锰锌对黑点病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果。结果表明：4种药剂抑制黑点病菌菌丝生长的有效中浓度(ec50)依次为0.250、0.497、0.113和1.800μg/ml；抑制孢子萌发的ec50依次为72.893、42.746、20.701和0.970μg/ml。药剂田间防效试验表明：代森锰锌可湿性粉剂600倍稀释液使用5次和3次对黑点病的防治效果分别达79.1％和63.6％，明显优于同样次数和推荐剂量的杀菌剂戊唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐。因此，可以认为在这4种药剂中代森锰锌是防治柑橘黑点病的最佳药剂。
6.在实际生产过程中，大多使用传统农药防治。据文献报道，农药利用率一般为10％，约90％的农药残留在环境中，造成环境的污染。此外农药残留也会对人畜产生危害。因此筛选有益真菌进行生物防治，是提高柑橘安全生产的重要方法。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种茄病镰刀菌及其应用，本技术菌株zjg2022fs分离自浙江省杭州市浙江大学紫金港校区(北纬30.312106度，东经120.097711度)的土壤中。通过序列比较，zjg2022fs菌株与茄病镰刀菌(fusarium solani)序列最接近，此结果与形态鉴定结果相同，表明我们分离到的zjg2022fs菌株是茄病镰刀菌(fusarium solani)。
8.本发明提供了一种茄病镰刀菌，命名为茄病镰刀菌(fusarium solani)，株号zjg2022fs，保藏号为cctcc no：m 2022717。
9.本发明还提供了所述的茄病镰刀菌在抑制柑橘黑点病菌(phoma citricarpn mcalp.)生长中的应用。
10.本发明还提供了所述的茄病镰刀菌在防治芸香科植物柑橘黑点病菌(phoma citricarpn mcalp.)感染中的应用。
11.凡是能够感染柑橘黑点病菌的植株均能够使用。除所述柑橘外，芸香科其他植物例如橙子、柚子等均可应用。优选的，所述芸香科植物为柑、桔、柚、柠檬或橙。
12.本发明还提供了一种柑橘黑点病菌抑制剂，活性成分包含上述的茄病镰刀菌。
13.本发明还提供了所述柑橘黑点病菌抑制剂的制备方法，将所述的茄病镰刀菌接种到发酵培养基中培养后，去除菌体的发酵液即为柑橘黑点病菌抑制剂。
14.优选的，培养温度为25℃，培养时间为6天。
15.本发明还提供了一种柑橘黑点病菌的防治方法，使用所述的茄病镰刀菌或所述的柑橘黑点病菌抑制剂喷施在植株上。可以是用于预防，也可以是用于对已经感染了柑橘黑点病菌的植株进行治疗。
16.本发明的有益效果：
17.本发明提供的茄病镰刀菌zjg2022fs，在平板对峙试验中对柑橘黑点病菌菌丝生长抑制率可达57％，在发酵液试验中对柑橘黑点病菌的抑制效果高达92.59％，说明菌株zjg2022fs可以有效抑制柑橘黑点病菌的生长，可用于制备新型、高效、广谱生防菌剂，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。
附图说明
18.图1为茄病镰刀菌zjg2022fs在cm培养基上生长6天的菌落形态图；其中，a为培养皿的正面图，b为培养皿的背面图。
19.图2为茄病镰刀菌zjg2022fs的大型分生孢子和小型分生孢子图；其中，a为大型分生孢子图，b为大型分生孢子图；标尺为20μm。
20.图3为茄病镰刀菌zjg2022fs对柑橘黑点病菌的抑制情况检测结果图；其中，a为茄病镰刀菌zjg2022fs对柑橘黑点病菌的抑制情况图，b为control check(ck)柑橘黑点病菌的生长状况。
21.图4a为茄病镰刀菌zjg2022fs发酵液对黑点病菌的抑制效果检测图及折线图；其中，a为茄病镰刀菌zjg2022fs发酵液对黑点病菌的抑制效果检测图，b为茄病镰刀菌zjg2022fs发酵液对黑点病菌的抑制效果折线图。
具体实施方式
22.实施例1：菌种分离
23.(1)从浙江省杭州市浙江大学紫金港校区采集土壤样品，采用选择性培养基稀释平板法分离，过程如下：取1.5ml离心管5个，用记号笔标上10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
，用移液器吸取0.9ml无菌水，加至每个离心管中；
24.(2)称取样品1g，放入装有9ml无菌水的具塞试管中，振荡10min，即为10-1
的土壤稀释液；
25.(3)10-1
土壤稀释液振荡后静止2min，用移液器吸取0.1ml悬液加至装有0.9ml无菌水的离心管中，依次稀释制成10-2
，10-3
、10-4
、10-5
、10-6
稀释液；
26.(4)将灭菌后冷却至50-60℃的cm培养基(培养基中加入链霉素、氨苄青霉素分别使之达到30μg/l，以抑制细菌生长)倒至培养皿中，每皿20ml；待培养基冷却成平板后用移液器分别吸取10-6
、10-5
、10-4
、10-3
稀释液0.1ml悬液，加到平板中，再用无菌涂布棒将各稀释液涂布均匀，每浓度重复3皿；
27.(5)将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，25℃培养3-5d后挑取单菌落的菌丝于新的平板上。
28.表1 cm培养基所用试剂及用量(1l)
29.所用试剂用量d型葡萄糖(d-glucose)10g蛋白胨(peptone 140)2g酪蛋白提取物(casamino acid)1g酵母浸膏(yeast extract)1g硝酸钠(nano3)6g磷酸二氢钾(kh2po4)1.52g氯化钾(kcl)0.52g七水硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.52g维他命溶液(1000
×
vitamin solution)1ml微量元素(1000
×
trace elements)1ml
30.以上试剂按照相应的量称好后定容到相应的体积，其中，维他命溶液的配方如表2所示，微量元素的配方如表3所示。用naoh将ph调制6.5，固体培养基每升加入15g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌15min。
31.表2 1000
×
vitamin solution(100ml)
32.所用试剂重量/克数生物素(biotin)0.01g维生素b(pyridoxin)0.01g硫胺素(riboflavin)0.01g核黄素(thiamine)0.01g烟酸(nicotinic acid)0.01g对氨基苯甲酸(p-aminobenzonic acid)0.01g
33.以上试剂加蒸馏水溶解后定容至100ml，4℃冰箱储存。
34.表3 1000
×
trace elements(100ml)
35.所用试剂重量/克数五水钼酸钠(na2moo4·
5h2o)0.15g五水硫酸铜(cuso4·
5h2o)0.16g六水氯化钴(cocl2·
6h2o)0.17g四水氯化锰(mncl2·
4h2o)0.5g七水硫酸亚铁(feso4·
7h2o)0.5g硼酸(h3bo3)1.1g七水硫酸锌(znso4·
7h2o)2.2g乙二胺四乙酸四钠(na4edta)5g
36.以上试剂加蒸馏水溶解后定容至100ml，4℃冰箱避光储存。
37.yg培养基：10g葡萄糖，5g酵母提取物，15g琼脂，1000ml蒸馏水。
38.从浙江省杭州市浙江大学紫金港校区(北纬30.312106度，东经120.097711度)土壤中分离到一株菌株，命名为zjg2022fs。
39.实施例2：菌种形态鉴定
40.cm培养基的菌落形态和孢子特征进行归类。
41.菌株zjg2022fs在cm培养基上气生菌丝茂密、略有发散；在25℃、16小时光照/8小时黑暗条件交替下培养，菌丝平均生长速度为每天11.58-11.75mm，7.66-7.77d后可长满直径为90mm的平板。菌丝呈圆形扩散，正面基本为白色(图1a)，背面为淡黄色(图1b)。显微镜下可见分生孢子：大型分生孢子多为镰刀形，其顶端渐尖且稍弯曲，具有3～6个分隔，大小为(18.0～32.0)μm
×
(3.0～5.0)μm(图2a)；小型分生孢子多为卵形，多数为单细胞，其次以1个分隔较为常见，大小为(7.0～10.0)μm
×
(2.1～3.0)μm(图2b)。
42.综合菌落形态特征、大型分生孢子和小型分生孢子的形态特征，结合分子生物学学鉴定结果，将菌株zjg2022fs鉴定为茄病镰刀菌。
43.实施例3：分子鉴定
44.(1)dna提取
45.1)在cm平板上25℃培养zjg2022fs菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有500μl提取缓冲液和适量石英砂的1.5ml离心管中；
46.提取缓冲液的配方为：10mm乙二胺四乙酸，100mm tris-盐酸，1m氯化钾；
47.2)将离心管放置在mp-24均质破碎仪中，65hz震荡2min，以破碎菌丝组织；
48.3)离心机12000rpm，10min，移液枪吸取400μl上清并注入崭新的离心管；
49.4)添加与上清等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，为了更好的沉淀dna，将离心管放入4℃冰箱中，低温沉淀10min；
50.5)离心机12000rpm离心10min，把上清倒掉，保留沉淀；
51.6)加入70％乙醇(v/v)800μl，用以溶解杂质，轻轻混匀后12000rpm离心2min；
52.7)弃掉上清，将离心管倒扣放置在吸水纸上，以挥发掉多余的乙醇，白色沉淀就是所要提取的基因组dna，加入50μl无菌水，在室温条件下溶解15min，溶解结束后将基因组放置在-20℃冰箱中保存。
53.(2)真菌核糖体its rdna基因的pcr扩增
54.its引物：上游引物its1序列为：5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
，下游引物its4序列为：5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
；
55.pcr扩增在25μl反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各1μl，green taq mix 12.5μl，模版dna 1μl，ddh2o 9.5μl。
56.pcr扩增反应在朗基mg96g型pcr仪上进行。反应条件：94℃预变性4min，然后35个循环包括：94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸1min；最后72℃后延伸10min。
57.(3)基因的测序和序列分析
58.目的dna片段送至杭州有康生物技术有限公司进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如seq id no.1所示的dna片段序列，即真菌核糖体its rdna基因的pcr扩增产物。
59.在ncbi网站上，将测得zjg2022fs菌株的its的核苷酸序列用blast在genbank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。通过序列比较，zjg2022fs菌株与茄病镰刀菌(fusarium solani)序列最接近，此结果与形态鉴定结果相同，表明我们分离到的zjg2022fs菌株是茄病镰刀菌(fusarium solani)。将该新筛选到的菌株命名为茄病镰刀菌(fusarium solani)，株号为zjg2022fs，于2022年5月25日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2022717。
60.实施例4：zjg2022fs菌株对柑橘黑点病菌的抑制作用
61.将zjg2022fs菌株与柑橘黑点病菌(柑橘黑点病菌菌株由浙江大学王洪凯老师惠赠)进行对峙培养：在直径为90mm的cm平板上，将柑橘黑点病菌与zjg2022fs菌株分别接种到平板两侧，两个菌株相距5cm。zjg2022fs菌株与柑橘黑点病菌在cm平板上对峙培养6d后，柑橘黑点病菌菌落前缘在靠近zjg2022fs菌株的方向的生长受到抑制，菌丝呈明显抑制状态(图3a)，经测定计算，菌丝生长抑制率可达57％(生长抑制率＝(ck柑橘黑点病菌半径-对峙培养柑橘黑点病菌半径)/ck柑橘黑点病菌半径)。
62.实施例5：zjg2022fs菌株对柑橘黑点病菌的抑制作用检测
63.zjg2022fs菌株接种于100ml cm培养基/250ml锥形瓶，25℃150rpm，培养3d，离心取上清液即为发酵液，过滤除菌后按比例添加到yg培养基中，制成发酵液-yg平板，接种柑橘黑点病菌，4天观察抑菌效果。将柑橘黑点病菌分别接种在不含发酵液、含5％、10％、20％、30％发酵液(v/m)的yg培养基上培养4天，并分别以含5％、10％、20％、30％无菌水(v/m)的yg培养基作为对照，各组中不同浓度设置三个重复。如图4a所示，含有发酵液浓度越高，对柑橘黑点病菌的抑制效果越明显，而对照组对柑橘黑点病菌的没有抑制效果。抑制效果如图4b折线图所示，在添加5％发酵液时，抑制效果已经高达52％。当添加30％发酵液时，抑制效果基本高达92.59％。