RIPK1激酶靶点抑制剂及其医药用途

ripk1激酶靶点抑制剂及其医药用途
技术领域
1.本发明涉及药物化学领域，涉及ripk1激酶靶点抑制剂及其医药用途。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(alzheimer's disease，ad)是一种复杂的神经退行性疾病，临床表现为记忆力减退、认知障碍以及行为障碍。ad的主要病理特征包括神经元丢失、β-淀粉样蛋白(aβ)沉积和过度磷酸化tau蛋白诱导的神经原纤维缠结 (nft)，近年来大量研究证明这些可能是由神经元死亡和神经炎症所引发。
3.受体相互作用蛋白激酶1(ripk1)是一种存在于细胞死亡和炎症信号通路交叉点的丝氨酸/苏氨酸家族激酶。有重要研究表明，ad患者脑中的磷酸化 ripk1是异常表达的，当ripk1被抑制时，淀粉样蛋白减少，延缓神经炎症的发生发展，减轻记忆的缺失。另外，小胶质神经细胞会促进aβ的降解，而研究发现在阿尔茨海默症中，ripk1促进炎症和aβ聚集，促使小胶质细胞处于炎性激活状态而减弱aβ的降解作用。这些表明ripk1是治疗ad的一个非常重要的治疗靶点。
4.已报道的ripk1抑制剂骨架类型非常有限，涉及ad治疗领域的小分子更是少之又少，因此开发具有新型骨架、高激酶选择性的靶向ripk1的化合物是非常迫切和重要的一项任务，具有深远的意义和潜在的价值。这里我们公开了具有纳摩尔强效力的用于治疗ad等神经退行性疾病的新型ripk1抑制剂的开发及其在阿尔茨海默症治疗领域的应用。动物行为学实验表明我们公开的新型 ripk1抑制剂具有良好的抗ad效力，展现出了良好的临床应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新型的ripk1激酶靶点抑制剂，用于神经退行性疾病以及其他炎症相关疾病的有效治疗剂。
6.本发明的另一目的是提供该靶向ripk1激酶的新型抑制剂的应用。
7.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
8.一类靶向ripk1激酶的新型抑制剂，选自结构如通式(i)或通式(ii)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0009][0010]
其中，r1选自取代或未取代的芳香环；r2选自羟基或氨基；r3选自取代或未取代的芳香环；r4选自c
1-6
的脂肪烃或氢。
[0011]
作为本发明的一种优选，所述的一类靶向ripk1激酶的新型抑制剂选自结构如通式(i)所示的化合物，其中，r3为选自取代或未取代的苯环；r4为氢。
[0012]
作为本发明的一种优选，通式(i)所示的化合物中r4为氢，r3选自卤素、氰基、甲氧基、三氟甲基硫烷基、c1-5的烷基、c1-3的烯基、亚甲二氧基、三氟甲基、苯氧基单取代或多取代的苯基或者5,6,7,8-四氢-2-萘基苯基、4-(2-呋喃基)苯基、未取代的苯基。4、根据权利要求3所述的一类靶向ripk1激酶的新型抑制剂，其特征在于通式(i)所示的化合物中r4为氢，r3选自苯基、3,4-二甲基苯基、4-氰基苯基、3-氰基苯基、3,4-(亚甲二氧基)-苯基、5,6,7,8-四氢-2-萘基苯基、3,5-二甲基苯基、2,4-二氟苯基、4-甲氧基苯基、4-三氟甲基硫烷基-苯基、4-乙烯基苯基、4-(2-呋喃基)苯基、4-叔丁基苯基、4-三氟甲基苯基、2-氯苯基、2-甲基苯基、4-正丙基苯基、4-苯氧基苯基、4-甲氧基-2-甲基苯基、2-氟-4
‑ꢀ
甲氧基苯基。
[0013]
作为本发明的一种优选，所述的r1选自苯基、卤素或c1-2单取代或多取代的苯基，r2选自羟基或氨基；优选当r2选自羟基时，r1选自苯基或氯取代的苯基；当r2选自氨基时，r1选自苯基或氟、氯、甲基单取代或多取代的苯基。
[0014]
作为本发明的一种优选，当r2选自羟基时，r1选自苯基或4-氯苯基；当r2选自氨基时，r1选自3-氟-5-甲基苯基、3-氟-4-氯苯基、2-氟-3-氯苯基。
[0015]
本发明化合物选自以下任意一种：
[0016]
[0017]
[0018][0019]
作为本发明的一种优选，通式i-ii所示的化合物其药学上可接受的盐选自通式i-ii化合物与酸形成的酸加成盐，所述的酸选自：氯化氢、溴化氢、硫酸、碳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或阿魏酸。
[0020]
一种药物组合物，其中本发明所述的通式i-ii化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
[0021]
作为本发明的一种优选，所述的药物组合物被制备成片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、冻干粉针或针剂中的任意一种剂型。
[0022]
一种本发明所述的ripk1激酶靶点抑制剂的制备方法：
[0023]
路线1：目标化合物1-17的合成a.
[0024][0025]a试剂及反应条件:(a)取代芳香胺，丙酸,110℃,4-6h；(b)二氯亚砜,四氢呋喃, 回流,2h；(c)浓氨水,四氢呋喃,0℃,30min.
[0026]
路线2：目标化合物18-37的合成a.
[0027][0028]a试剂及反应条件:(a)3-氟-5-甲基苯胺,丙酸,110℃,4h；(b)取代芳香胺,三(二亚苄基丙酮)二钯,2-二环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯,碳酸铯,氮气保护,甲苯, 100℃,过夜反应；(c)氨-甲醇溶液(7m),甲氧基镁,甲醇,80℃,24h.
[0029]
路线3：目标化合物38-43的合成a.
[0030][0031]a试剂及反应条件:(a)一水合氢氧化锂,四氢呋喃/甲醇/水,室温反应,2h；(b)脂肪胺,2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯,n,n-二异丙基乙胺,二氯甲烷,室温反应,4h,42-89％；(c)羟胺钾溶液,甲醇,室温反应,3h, 67％.
[0032]
有益效果：
[0033]
本发明提供了一系列新型的激酶靶向抑制剂，本发明所公示化合物能够有效靶向ripk1激酶，可作为神经退行性疾病以及炎症相关疾病的有效治疗剂。
附图说明
[0034]
图1.化合物27对ripk1激酶以及bv2细胞坏死的浓度依赖性抑制曲线。
[0035]
图2.对痴呆小鼠的认知水平改善试验。
[0036]
a定位航行实验逃逸潜伏期折线图；b空间探索实验平台穿梭次数柱状图。
[0037]
图3.小鼠脑组织切片iba-1免疫荧光。
[0038]
具体实施案例与方法
[0039]
实施例1:2-(苯氨基)烟酸(1)的制备：
[0040]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和苯胺(0.558g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，110℃搅拌反应4-6h。反应完毕后降至室温，冷却至0℃，析出晶体并抽滤，依次用丙酸和水洗涤，烘干后得类白色晶体，产率46％。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.49(s,1h),8.54
–
8.10(m,2h),7.67(dd,j＝8.5,1.2hz,2h),7.36(dd,j＝8.5,7.3hz,2h),7.11
–
7.05(m,1h),6.91(dd,j＝7.7,5.0hz,1h),5.09(s,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ168.68,154.90,151.00,141.73,138.88,131.58,129.01,123.22,121.00,113.84,108.51.hrms(esi)calcdforc
12h10
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+
:215.0806；found:215.0807.
[0041]
实施例2:2-((4-氯苯基)氨基)烟酸(2)的制备：
[0042]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和4-氯苯胺(0.764g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物1。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.51(s,1h),8.38(dd,j＝4.9,2.0hz,1h),8.29(dd,j＝7.7,2.0hz,1h),7.75(d,j＝8.9hz,2h),7.38(d,j＝8.8hz,2h),6.92(dd,j＝7.7,4.9hz,1h),5.61(s,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ168.82,154.99,151.82,141.17,138.34,128.69,126.11,121.96,114.29,108.36.hrms(esi)calcdforc
12
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+
:249.0426；found:249.0426.
[0043]
实施例3:2-((3-氯苯基)氨基)烟酸(3)的制备：
[0044]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3-氯苯胺(0.764g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物1,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.57(s,1h),8.43(dd,j＝4.9,2.0hz,1h),8.30(dd,j＝7.7,2.0hz,1h),8.07(s,1h),7.49(ddd,j＝8.2,2.1,1.0hz,1h),7.34(t,j＝8.1hz,1h),7.07(ddd,j＝8.0,2.1,0.9hz,1h),6.94(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),6.20(s,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ168.85,154.99,152.08,141.01,133.19,130.38,121.97,119.35,118.63,114.61,108.49.hrms(esi)calcdforc
12
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+
:249.0426；found:249.0425.
[0045]
实施例4:2-(苯氨基)烟酰胺(4)的制备：
[0046]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和苯胺(0.558g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，110℃搅拌反应4-6h。反应完毕后降至室温，冷却至0℃，析出晶体并抽滤，依次用丙酸和水洗涤晶体。将相应晶体(0.214g，1.0mmol)溶于四氢呋喃(1ml)和氯化亚砜(5ml)中，回流反应2h，旋干后溶于1ml四氢呋喃，向0℃氨水中恒速缓慢滴加，继续反应30min。反应结束将体系倒入水中，并用乙酸乙酯(3*5ml)萃取，分离有机层，用na2so4干燥，过滤，浓缩并通过制备tlc纯化(pe:ea＝1:1)，得到黄色粉末，产率72％。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.17(s,1h),8.30(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.28(s,1h),8.14(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.70(s,1h),7.68(d,j＝7.4hz,2h),7.29(dd,j＝8.5,7.2hz,2h),7.02
–
6.92(m,1h),6.83(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
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12h12
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+
:214.0975；found:214.0974.
[0047]
实施例5:2-((4-氯苯基)氨基)烟酰胺(5)的制备：
[0048]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和4-氯苯胺(0.764g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.27(s,1h),8.32(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.30(s,1h),8.16(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.75
–
7.71(m,3h),7.33(dd,j＝
8.9hz,2h),6.87(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.93,154.63,150.80,139.20,137.60,128.52,124.84,120.78,113.76,110.52.hrms(esi)calcdforc
12h11
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+
:245.0587；found:245.0587.
[0049]
实施例6:2-((3-氯苯基)氨基)烟酰胺(6)的制备：
[0050]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3-氯苯胺(0.764g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.36(s,1h),8.37(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.33(s,1h),8.18(dd,j＝7.8,1.9hz,1h),8.10(t,j＝2.1hz,1h),7.77(s,1h),7.40(ddd,j＝8.3,2.2,0.9hz,1h),7.30(t,j＝8.1hz,1h),7.00(ddd,j＝7.9,2.1,0.9hz,1h),6.91(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
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12h11
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+
:247.0586；found:247.0585.
[0051]
实施例7:2-((2,4-二氟苯基)氨基)烟酰胺(7)的制备：
[0052]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和2，4-二氟苯胺(0.774g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.26(d,j＝2.5hz,1h),8.50(td,j＝9.3,6.2hz,1h),8.31(dd,j＝4.8,1.8hz,2h),8.18(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.72(s,1h),7.30(ddd,j＝11.7,8.9,2.9hz,1h),7.05(ddt,j＝11.1,8.8,2.2hz,1h),6.89(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.87,157.17,157.09,155.57,155.49,154.68,153.41,153.33,151.79,151.71,150.83,137.59,125.20,125.18,125.13,125.11,122.24,122.23,122.19,122.17,113.94,110.69,103.78,103.62,103.60,103.44.hrms(esi)calcdforc
12h11
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+
:250.0786；found:250.0787.
[0053]
实施例8:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(8)的制备：
[0054]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3-氟-5-甲基苯胺(0.751g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.34(s,1h),8.36(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.32(s,1h),8.17(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.84
–
7.71(m,2h),7.00(d,j＝1.4hz,1h),6.89(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),6.60(ddd,j＝9.6,2.6,1.3hz,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.92,163.21,161.63,154.64,150.84,141.70,141.62,140.11,140.05,137.61,115.38,113.90,110.66,108.42,108.28,103.03,102.85,21.05,21.04.hrms(esi)calcdforc
13h13
fn3o[m+h]
+
:246.1037；found:246.1038.
[0055]
实施例9:2-((3,4-二甲基苯基)氨基)烟酰胺(9)的制备
[0056]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3，4-二甲基苯胺(0.727g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.02(s,1h),8.28(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.24(s,1h),8.11(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.66(s,1h),7.48(dd,j＝8.2,2.4hz,1h),7.35(d,j＝2.4hz,1h),7.04(d,j＝8.1hz,1h),6.78(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),2.20(s,3h),2.16(s,3h).
13
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13h13
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+
:242.1288；found:242.1288.
[0057]
实施例10:2-((3-溴苯基)氨基)烟酰胺(10)的制备
[0058]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3-溴苯胺(1.032g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.35(s,1h),8.37(dd,j＝4.8,
1.8hz,1h),8.33(s,1h),8.22(t,j＝2.0hz,1h),8.18(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.77(s,1h),7.46(ddd,j＝8.2,2.1,1.0hz,1h),7.24(t,j＝8.0hz,1h),7.13(ddd,j＝7.9,2.0,0.9hz,1h),6.90(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.88,154.51,150.82,141.87,137.66,130.62,123.90,121.74,121.15,118.11,114.11,110.77.hrms(esi)calcdforc
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+
:292.0080；found:292.0081.
[0059]
实施例11:2-((4-(三氟甲基)苯基)氨基)烟酰胺(11)的制备：
[0060]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和4-三氟甲基苯胺(0.967g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.56(s,1h),8.38(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.37(s,1h),8.21(dd,j＝7.8,1.9hz,1h),7.92(d,j＝8.5hz,2h),7.82(s,1h),7.63(d,j＝8.5hz,2h),6.96(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
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13h11
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+
:282.0849；found:282.0850.
[0061]
实施例12:2-((4-异丙基苯基)氨基)烟酰胺(12)的制备：
[0062]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和4-异丙基苯胺(0.811g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.05(s,1h),8.27(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.25(s,1h),8.11(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.66(s,1h),7.56(d,j＝8.5hz,2h),7.16(d,j＝8.5hz,2h),6.79(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),2.84(p,j＝6.9hz,1h),1.19(d,j＝6.9hz,6h).
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:256.1444；found:256.1446.
[0063]
实施例13:2-((4-氯-3-氟苯基)氨基)烟酰胺(13)的制备：
[0064]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和3-氟-4-氯苯胺(0.873g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.45(s,1h),8.38(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.35(s,1h),8.19(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),8.13(dd,j＝12.6,2.5hz,1h),7.79(s,1h),7.44(t,j＝8.7hz,1h),7.32(ddd,j＝8.8,2.5,1.0hz,1h),6.93(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
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clfn3o[m+h]
+
:266.0491；found:266.0492.
[0065]
实施例14:2-((3-氯-2-氟苯基)氨基)烟酰胺(14)的制备：
[0066]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和2-氟-3-氯苯胺(0.873g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.57(d,j＝2.8hz,1h),8.65
–
8.50(m,1h),8.37(dd,j＝4.8,1.8hz,2h),8.22(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.80(s,1h),7.17(td,j＝8.2,1.3hz,1h),7.13(td,j＝8.2,6.7,1.7hz,1h),6.95(dd,j＝7.8,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.80,154.36,150.81,148.87,147.25,137.67,130.18,130.12,124.97,124.94,121.88,119.56,119.24,119.14,114.58,111.23.hrms(esi)calcdforc
12h10
clfn3o[m+h]
+
:266.0491；found:266.0491.
[0067]
实施例15:2-((2,3,4-三氟苯基)氨基)烟酰胺(15)的制备：
[0068]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和2，3，4-三氟苯胺(0.883g，6.0mmol)溶解于丙酸
(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.41(d,j＝2.1hz,1h),8.35(s,1h),8.33(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.32
–
8.27(m,1h),8.21(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.79(s,1h),7.27(td,j＝10.4,8.6,2.2hz,1h),6.94(dd,j＝7.7,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.79,154.53,150.82,145.67,145.61,144.08,144.01,142.72,141.16,141.10,139.99,139.88,139.79,138.36,138.26,138.16,137.65,126.56,126.54,126.51,126.49,115.58,115.54,114.51,111.49,111.46,111.37,111.35,110.93.hrms(esi)calcdforc
12
h9f3n3o[m+h]
+
:268.0692；found:268.0691.
[0069]
实施例16:2-((5-氯-2-氟苯基)氨基)烟酰胺(16)的制备：
[0070]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和5-氯-2-氟苯胺(0.873g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.68(d,j＝3.2hz,1h),8.81(dd,j＝7.3,2.7hz,1h),8.43(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.37(s,1h),8.23(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.80(s,1h),7.29(dd,j＝11.3,8.6hz,1h),7.00(dt,j＝4.6,2.3hz,1h),6.98(dd,j＝7.8,4.8hz,1h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.73,154.16,151.59,150.81,149.99,137.74,129.98,129.90,128.14,128.12,120.51,120.46,119.39,119.37,116.08,115.94,114.74,111.37.hrms(esi)calcdforc
12h11
clfn3o[m+h]
+
:266.0491；found:266.0491.
[0071]
实施例17:2-(对甲苯氨基)烟酰胺(17)的制备：
[0072]
将原料a(1.010g，5.0mmol)和4-甲基苯胺(0.643g，6.0mmol)溶解于丙酸(5ml)中，其余操作步骤同化合物4,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.07(s,1h),8.28(dd,j＝4.8,1.8hz,1h),8.25(s,1h),8.12(dd,j＝7.7,1.9hz,1h),7.67(s,1h),7.55(d,j＝8.4hz,2h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),6.79(dd,j＝7.7,4.8hz,1h),2.25(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ170.11,155.07,150.94,137.72,137.48,130.43,129.13,119.56,112.96,109.99,20.41.hrms(esi)calcdforc
13h14
n3o[m+h]
+
:228.1131；found:228.1131.
[0073]
实施例18:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-(苯基氨基)烟酰胺(18)的制备：
[0074]
原料b(2.505g,10mmol)与3-氟-5-甲基苯胺(1.501g,12mmol)溶于丙酸中，110℃反应4h，冷却析晶，用丙酸和水洗涤后烘干，得中间体c，产率58％。将中间体c(678.32mg,2mmol)、苯胺(223.51mg,2.4mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(18.31mg,0.02mmol)、2-二环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(19.07mg,0.04mmol)、碳酸铯(1303.28mg,4mmol)溶于甲苯(10ml)中，氮气保护下100℃过夜反应，tlc监测反应结束后，将反应液用硅藻土过滤后，以快速色谱柱(pe:etoac＝1:1)纯化,得黄色固体18d，产率95％。将化合物18d(70.28mg,0.2mmol)溶于甲醇(3ml)中，加入氨-甲醇溶液(7minmeoh,2mmol)和甲醇镁(17.27mg,0.2mmol)，于密闭安瓿瓶中80℃反应24h。将反应液倒入水中，并用乙酸乙酯(3*5ml)萃取，分离有机层，用na2so4干燥，过滤，浓缩并通过制备tlc纯化(pe:ea＝1:1)，得到黄色粉末，产率84％。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.95(s,1h),8.33(s,1h),8.20(d,j＝2.6hz,1h),8.02(d,j＝2.7hz,1h),7.98(s,1h),7.79
–
7.68(m,2h),7.19(dd,j＝8.6,7.3hz,2h),6.95(d,j＝2.0hz,1h),6.91(s,1h),6.90(d,j＝1.2hz,1h),6.74(tt,j＝7.3,1.1hz,1h),6.54(dt,j＝9.6,1.7hz,1h),2.28(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.79,163.34,161.75,149.70,145.11,143.36,142.24,142.15,140.03,139.97,130.81,130.07,129.29,118.60,114.70,114.69,114.46,111.48,107.69,107.55,102.11,101.93,21.09,21.07.hrms
(esi)calcdforc
19h18
fn4o[m+h]
+
:337.1459；found:337.1460.
[0075]
实施例19:5-((3,4-二甲基苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(19)的制备：
[0076]
将实施例18中的苯胺替换为3，4-二甲基苯胺(290.84mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.86(s,1h),8.30(s,1h),8.16(d,j＝2.7hz,1h),7.93(d,j＝2.7hz,1h),7.77
–
7.67(m,3h),6.99
–
6.89(m,2h),6.73(d,j＝2.4hz,1h),6.68(dd,j＝8.1,2.4hz,1h),6.53(d,j＝9.6hz,0h),2.28(s,3h),2.15(s,3h),2.12(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.88,163.35,161.77,149.11,142.60,142.36,142.28,142.26,140.00,139.93,136.82,131.78,130.18,129.06,126.49,116.71,114.57,114.55,112.63,111.66,107.52,107.38,101.94,101.76,21.09,21.08,19.70,18.55.hrms(esi)calcdforc
21h22
fn4o[m+h]
+
:365.1772；found:365.1773.
[0077]
实施例20:5-((4-氰基苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(20)的制备：
[0078]
将实施例18中的苯胺替换为4-氰基苯胺(283.53mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.20(s,1h),8.74(s,1h),8.35(s,1h),8.26(d,j＝2.5hz,1h),8.11(d,j＝2.6hz,1h),7.81
–
7.73(m,2h),7.56(d,j＝8.7hz,2h),6.99(s,1h),6.90(d,j＝8.8hz,2h),6.59(d,j＝9.7hz,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.46,163.28,161.69,151.37,149.89,145.99,141.82,141.74,140.14,140.07,133.78,132.81,127.93,120.12,115.11,113.50,111.14,108.23,108.09,102.63,102.45,98.43,21.06.hrms(esi)calcdforc
20h17
fn5o[m+h]
+
:362.1412；found:362.1413.
[0079]
实施例21:5-((3-氰基苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(21)的制备：
[0080]
将实施例18中的苯胺替换为3-氰基苯胺(283.53mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.14(s,1h),8.37(s,1h),8.23(d,j＝2.6hz,1h),8.06(d,j＝2.6hz,1h),7.76(dt,j＝12.0,2.3hz,2h),7.36(dd,j＝9.2,7.4hz,1h),7.18
–
7.09(m,3h),6.98(d,j＝1.9hz,1h),6.57(ddd,j＝9.5,2.7,1.4hz,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.58,163.30,161.71,150.88,146.49,145.11,141.97,141.89,140.09,140.03,131.75,130.57,128.95,121.49,119.20,118.68,116.04,114.97,112.04,111.26,108.04,107.90,102.46,102.28,21.08,21.06.hrms(esi)calcdforc
20h17
fn5o[m+h]
+
:362.1412；found:362.1411.
[0081]
实施例22:5-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(22)的制备：
[0082]
将实施例18中的苯胺替换为3，4-(亚甲二氧基)苯胺(329.13mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.84(s,1h),8.31(s,1h),8.12(d,j＝2.6hz,1h),7.89(d,j＝2.7hz,1h),7.77(s,1h),7.71(dt,j＝12.6,2.4hz,2h),6.93(s,1h),6.77(d,j＝8.3hz,1h),6.60(d,j＝2.2hz,1h),6.52(dt,j＝9.5,1.7hz,1h),6.39(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),5.92(s,2h),2.27(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.87,163.35,161.77,149.06,147.90,142.36,142.28,141.94,140.43,139.99,139.93,132.17,128.41,114.54,111.67,108.68,107.83, 101.91,101.74,100.56,98.43,21.09.hrms
nmr(151mhz,dmso)δ169.94, 163.36,161.78,153.04,148.59,142.47,142.38,140.99,139.97,139.91,137.78, 132.75,127.45,117.48,114.73,114.43,111.82,107.37,107.23,101.77,101.59,55.27, 21.09.hrms(esi)calcd for c
20h19
fn4o2[m+h]
+
:367.1565；found:367.1567.
[0091]
实施例27:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-((4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)烟酰胺(27)的制备：
[0092]
将实施例18中的苯胺替换为4-三氟甲硫基苯胺(463.65mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ11.16(s,1h),8.53(s, 1h),8.34(s,1h),8.24(d,j＝2.6hz,1h),8.11(d,j＝2.6hz,1h),7.78(s,1h),7.76 (t,j＝2.3hz,1h),7.47(d,j＝8.6hz,2h),6.98(s,1h),6.92(d,j＝8.7hz,2h), 6.58(dt,j＝9.5,1.7hz,1h),2.29(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ169.53, 163.29,161.70,151.05,148.89,145.60,141.91,141.83,140.11,140.04,138.20, 132.43,130.73,128.61,115.02,114.38,111.16,108.56,108.11,107.97,102.51, 102.33,21.06.hrms(esi)calcd for c
20h17
f4n4os[m+h]
+
:437.1054；found: 437.1053.
[0093]
实施例28:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-((4-乙烯基苯基)氨基)烟酰胺(28)的制备：
[0094]
将实施例18中的苯胺替换为4-乙烯基苯胺(286.00mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.98(s,1h),8.33(s,1h), 8.20(d,j＝2.6hz,1h),8.14(s,1h),8.02(d,j＝2.7hz,1h),7.80
–
7.70(m,2h), 7.30(d,j＝8.5hz,2h),6.96(s,1h),6.88(d,j＝8.6hz,2h),6.61(dd,j＝17.6, 10.9hz,1h),6.55(d,j＝10.1hz,1h),5.58(dd,j＝17.6,1.2hz,1h),5.02(dd,j＝ 10.8,1.2hz,1h),2.28(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ169.74,163.33, 161.74,149.85,144.96,143.57,142.17,142.09,140.05,139.98,136.47,130.43, 130.22,127.80,127.35,114.74,114.27,111.42,110.04,107.76,107.62,102.17, 101.99,21.08.hrms(esi)calcd for c
21h20
fn4o[m+h]
+
:363.1616；found: 363.1616.
[0095]
实施例29:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-((4-(呋喃-2-基)苯基)氨基)烟酰胺(29) 的制备：
[0096]
将实施例18中的苯胺替换为4-(2-呋喃基)苯胺(382.05mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ11.01(s,1h),8.34(s, 1h),8.23(d,j＝2.6hz,1h),8.19(s,1h),8.05(d,j＝2.7hz,1h),7.76(s,1h),7.74 (s,1h),7.63(dd,j＝1.8,0.8hz,1h),7.53(d,j＝8.7hz,2h),6.96(s,1h),6.94(d, j＝8.7hz,2h),6.67(dd,j＝3.3,0.8hz,1h),6.55(d,j＝9.8hz,1h),6.52(dd,j＝ 3.4,1.8hz,1h),2.29(s,3h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ169.73,163.33,161.75, 153.76,149.97,144.66,143.78,142.16,142.08,141.52,140.06,139.99,130.44, 130.26,124.87,121.19,114.77,114.43,111.86,111.41,107.80,107.65,102.91, 102.21,102.03,21.09,21.08.hrms(esi)calcd for c
23h20
fn4o2[m+h]
+
:403.1565； found:403.1564.
[0097]
实施例30:5-((4-(叔丁基)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(30)的制备：
[0098]
将实施例18中的苯胺替换为4-叔丁基苯胺(358.17mg,2.4mmol)，其余操作步骤同
化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.90(s,1h),8.31(s,1h),8.16(d,j＝2.7hz,1h),7.99(d,j＝2.7hz,1h),7.89(s,1h),7.73(dt,j＝12.5,2.3hz,1h),7.71(s,1h),7.22(d,j＝8.6hz,2h),6.94(s,1h),6.87(d,j＝8.6hz,2h),6.53(d,j＝9.5hz,1h),2.28(s,3h),1.24(s,9h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.84,163.35,161.76,149.25,142.49,142.33,142.27,142.25,141.09,140.00,139.93,131.46,129.04,125.89,114.58,111.52,107.55,107.41,101.97,101.79,33.71,31.38,21.08.hrms(esi)calcdforc
23h26
fn4o[m+h]
+
:393.2085；found:393.2085.
[0099]
实施例31:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-((4-(三氟甲基)苯基)氨基)烟酰胺(31)的制备：
[0100]
将实施例18中的苯胺替换为4-三氟甲基苯胺(386.70mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.16(s,1h),8.52(s,1h),8.34(s,1h),8.25(d,j＝2.6hz,1h),8.11(d,j＝2.6hz,1h),7.81
–
7.74(m,2h),7.48(d,j＝8.5hz,2h),6.98(s,1h),6.95(d,j＝8.5hz,2h),6.58(d,j＝9.7hz,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.53,163.29,161.71,151.00,149.15,145.48,141.93,141.85,140.10,140.04,132.25,128.76,126.64,126.61,125.95,124.16,117.84,117.63,115.01,115.00,113.24,111.18,108.09,107.95,102.49,102.32,21.07,21.06.hrms(esi)calcdforc
20h17
f4n4o[m+h]
+
:405.1333；found:405.1335.
[0101]
实施例32:5-((2-氯苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(32)的制备：
[0102]
将实施例18中的苯胺替换为2-氯苯胺(306.17mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.15(s,1h),8.29(s,1h),8.25(d,j＝2.6hz,1h),8.08(d,j＝2.6hz,1h),7.77(dt,j＝12.3,2.3hz,1h),7.74(s,1h),7.53(s,1h),7.37(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),7.13(ddd,j＝8.5,7.3,1.5hz,1h),6.98(s,1h),6.87(dd,j＝8.2,1.4hz,1h),6.80
–
6.75(m,1h),6.57(d,j＝9.7hz,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.59,163.30,161.71,150.93,146.14,142.27,142.00,141.92,140.09,140.03,133.06,129.75,129.34,128.03,119.76,119.51,114.96,114.95,114.51,111.11,108.02,107.88,102.44,102.26,21.08,21.07.hrms(esi)calcdforc
19h17
clfn4o[m+h]
+
:371.1069；found:371.1071.
[0103]
实施例33:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-(邻甲苯氨基)烟酰胺(33)的制备：
[0104]
将实施例18中的苯胺替换为2-甲基苯胺(257.17mg,2.4mmol)，其余操作步骤同化合物18,1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ10.94(s,1h),8.27(s,1h),8.15(d,j＝2.6hz,1h),7.95(d,j＝2.7hz,1h),7.74(d,j＝12.3hz,1h),7.69(s,1h),7.14(s,1h),7.12(s,1h),7.03(t,j＝7.7hz,1h),6.95(s,1h),6.85(d,j＝8.0hz,1h),6.75(t,j＝7.3hz,1h),6.54(d,j＝9.5hz,1h),2.28(s,3h),2.24(s,3h).
13
cnmr(126mhz,dmso)δ169.79,163.48,161.58,149.60,143.50,143.35,142.30,142.20,140.00,139.92,131.64,130.68,130.61,126.67,125.53,119.58,114.64,114.32,111.51,107.63,107.45,102.07,101.85,21.05,17.93.hrms(esi)calcdforc
20h20
fn4o[m+h]
+
:351.1616；found:351.1618.
[0105]
实施例34:2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-5-((4-丙基苯基)氨基)烟酰胺(34)的制备：
[m+h]
+
:385.1471；found:385.1473.
[0113]
实施例38:5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-n-甲基烟酰胺(38)的制备：
[0114]
将中间体27d(902.88mg,2mmol)溶于四氢呋喃/甲醇/水(4:4:1,10ml)体系中,加入一水合氢氧化锂(419.60mg,10mmol),室温下反应2h。反应液浓缩后加水5ml，并用稀盐酸调至ph＝4，析出固体。过滤，烘干，得中间体27e，黄色固体，产率95％。将中间体27e(109.35mg,0.25mmol)溶于二氯甲烷(5ml)，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(142.59mg,0.375mmol)和n,n-二异丙基乙胺(96.93mg,0.75mmol),室温下搅拌15min，随后加入甲胺盐酸盐(20.26mg,0.3mmol),室温下继续反应3h。tlc监测反应结束后，将反应体系倒入水中，并用乙酸乙酯(3*5ml)萃取，分离有机层，用na2so4干燥，过滤，浓缩并通过制备tlc纯化(pe:ea＝2:1)，得到黄色固体，产率89％。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.00(s,1h),8.81(d,j＝4.6hz,1h),8.54(s,1h),8.23(d,j＝2.6hz,1h),8.05(d,j＝2.7hz,1h),7.76(dt,j＝12.2,2.2hz,1h),7.48(d,j＝8.7hz,2h),6.57(dt,j＝9.7,1.8hz,1h),2.79(d,j＝4.5hz,3h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ167.45,163.30,161.71,150.55,148.79,145.11,141.95,141.87,140.11,140.04,138.22,131.43,128.73,114.94,114.45,111.83,108.04,107.90,102.36,102.18,26.33,21.07.hrms(esi)calcdforc
21h18
f4n4os[m+h]
+
:451.1210；found:451.1210.
[0115]
实施例39:n-乙基-5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(39)的制备：
[0116]
将实施例38中的甲胺盐酸盐替换为乙胺盐酸盐(24.46mg,0.3mmol)，其余操作步骤同化合物38,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.77(s,1h),8.26(s,1h),8.05(d,j＝2.7hz,1h),7.76(d,j＝2.8hz,1h),7.72
–
7.63(m,2h),7.51(s,1h),7.08(t,j＝9.9hz,1h),6.93(s,1h),6.89(dd,j＝13.0,2.8hz,1h),6.70(dd,j＝8.8,2.5hz,1h),6.51(d,j＝9.6hz,1h),3.73(s,3h),2.27(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ169.88,163.35,161.76,154.88,154.30,154.23,153.27,148.64,142.46,142.38,140.46,139.95,139.89,132.77,127.07,124.75,124.67,120.41,120.39,114.42,111.70,110.14,110.12,107.36,107.22,102.73,102.58,101.77,101.59,55.63,21.07.hrms(esi)calcdforc
20h19
f2n4o2[m+h]
+
:465.1327；found:465.1327.hrms(esi)calcdforc
22h20
f4n4os[m+h]
+
:465.1365；found:465.1367.
[0117]
实施例40:n-环丙基-5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(40)的制备：
[0118]
将实施例38中的甲胺盐酸盐替换为环丙胺盐酸盐(28.07mg,0.3mmol)，其余操作步骤同化合物38,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.99(s,1h),8.79(d,j＝4.1hz,1h),8.50(s,1h),8.25(d,j＝2.6hz,1h),8.05(d,j＝2.6hz,1h),7.77(dd,j＝12.2,2.2hz,1h),7.48(d,j＝8.7hz,2h),7.03(s,1h),6.91(d,j＝8.7hz,2h),6.68
–
6.48(m,1h),3.01
–
2.84(m,1h),2.30(s,3h),0.73(s,1h),0.60(dd,j＝4.2,2.4hz,2h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ168.42,163.28,161.69,150.59,148.97,145.41,138.19,132.11,128.56,114.32,111.66,108.56,108.08,107.94,102.42,102.24,23.16,21.05,5.63.hrms(esi)calcdforc
23h20
f4n4os[m+h]
+
:477.1367；found:477.1367.
[0119]
实施例41:n-环丁基-5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(41)的制备：
[0120]
将实施例38中的甲胺盐酸盐替换为环丁胺盐酸盐(32.27mg,0.3mmol)，其余操作步骤同化合物38,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.95(s,1h),8.95(d,j＝7.1hz,1h),8.51(s,1h),8.26(d,j＝2.6hz,1h),8.13(d,j＝2.6hz,1h),7.76(dt,j＝12.1,2.3hz,1h),7.48(d,j＝8.6hz,2h),7.00(s,1h),6.92(d,j＝8.8hz,2h),6.63
–
6.52(m,1h),4.42(q,j＝8.0hz,1h),2.26
–
2.22(m,1h),2.07(td,j＝9.5,2.7hz,2h),1.70(dtd,j＝10.5,6.4,3.2hz,2h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ166.08,163.27,161.68,150.80,149.06,145.45,141.87,141.79,140.09,140.02,138.21,132.30,128.56,115.00,114.29,111.69,108.55,108.09,107.95,102.44,102.26,44.69,29.74,21.03,14.83.hrms(esi)calcdforc
24h22
f4n4os[m+h]
+
:491.1523；found:491.1523.
[0121]
实施例42:n-环戊基-5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)烟酰胺(42)的制备：
[0122]
将实施例38中的甲胺盐酸盐替换为环戊胺盐酸盐(36.48mg,0.3mmol)，其余操作步骤同化合物38,1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ10.92(s,1h),8.65(d,j＝7.0hz,1h),8.50(s,1h),8.26(d,j＝2.6hz,1h),8.09(d,j＝2.6hz,1h),7.83
–
7.69(m,1h),7.48(d,j＝8.7hz,2h),7.00(s,1h),6.92(d,j＝8.8hz,2h),6.58(ddd,j＝9.5,2.6,1.3hz,1h),4.25(q,j＝7.0hz,1h),2.29(s,3h),1.96
–
1.86(m,1h),1.68(t,j＝3.0hz,1h),1.61
–
1.48(m,4h).
13
cnmr(151mhz,dmso-d6)δ166.67,163.28,161.70,150.64,149.07,145.17,141.88(d,j＝12.4hz),140.05(d,j＝9.9hz),138.20,132.44,130.71,128.57,114.94,114.28,112.21,108.53,107.96(d,j＝21.4hz),102.28(d,j＝26.9hz),51.13,31.91,23.67,21.03.hrms(esi)calcdforc
25h24
f4n4os[m+h]
+
:505.1680；found:505.1680.
[0123]
实施例43:5-((2-氟-4-((三氟甲基)硫代)苯基)氨基)-2-((3-氟-5-甲基苯基)氨基)-n-羟基烟酰胺(43)的制备：
[0124]
将中间体27d(225.72mg,0.5mmol))溶于甲醇(5ml)中,并向其中滴加游离的羟胺溶液(165mg,5mmol),反应结束后用稀盐酸调至ph＝4,析出固体，过滤，用水洗涤并烘干，得黄色固体，产率67％。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ11.55(s,1h),10.47(s,1h),9.47
–
9.21(m,1h),8.58(s,1h),8.23(d,j＝2.6hz,1h),7.86(d,j＝2.7hz,1h),7.76
–
7.67(m,1h),7.48(d,j＝8.7hz,2h),6.99(s,3h),6.97(s,1h),6.68
–
6.49(m,1h),2.29(s,3h).
13
cnmr(151mhz,dmso)δ164.70,163.30,161.72,149.91,148.31,144.32,141.92,141.84,140.16,140.10,138.18,130.73,130.02,128.99,114.81,114.69,110.58,108.90,108.10,107.95,102.31,102.13,21.09.hrms(esi)calcdforc
20h16
f4n4o2s[m+h]
+
:453.1004；found:453.1003.
[0125]
实施例44:ripk1片段长激酶和bv2细胞程序性坏死的抑制活性检测
[0126]
ripk1(#va7591)片段长人源激酶购自promega。分析液成分包括25mmhepes(ph7.2)、20mmmgcl2、12.5mmmncl2、5mmegta、2mmedta、12.5mmβ-甘油磷酸和2mmdtt(临使用前添加)。将1μlripk1与2μl不同浓度的化合物或dmso在测定缓冲液中于24℃孵育15min。然后加入2μlatp/mbp混合物(终浓度分别为25μm和5μm)以触发激酶反应，在37℃孵育90min。5μl的激酶反应液加入5μladp-glo
tm
试剂淬灭。再孵育60min后，加入10μlkinase
detection试剂，并在24℃下孵育30min。使用moleculardevices多功能酶标仪的lum模块进行读数，计算抑制率(％)。
[0127]
小鼠小胶质细胞bv2细胞(购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司)在含有4mm l-谷氨酰胺、4500mg/l葡萄糖、1mm丙酮酸钠(hyclone)、10％热灭活胎牛血清和1％glutamaxtm(gibco)的培养基中生长。培养环境37℃， co2含量5％。在实验过程中，将bv2细胞以4
×
103个细胞/孔接种在96孔板中24h。接下来，将培养基更换为新鲜的不含fbs的dmem，含有200ng/mllps，或不添加，细胞再孵育23h。然后将bv2细胞与指定浓度的化合物或 dmso一起孵育1h，再加入25μm zvad-fmk孵育24h。通过celltiter aqueous non-radioactive cell proliferation(mts)assay(promega)检测细胞活力。
[0128]
使用prism graphpad 8.0软件使用具有归一化剂量反应拟合的非线性回归计算ic
50
和ec
50
值。所有实验均独立进行至少3次。
[0129]
表1.化合物1-17的bv2细胞程序性坏死抑制ec
50
值a[0130]
[0131][0132]aec
50
值,数据表示为三个独立实验的平均值
±
sd.
[0133]
表2.化合物18-37的酶抑制率(1μm)以及bv2细胞程序性坏死抑制ec
50
值a[0134]
[0135][0136]a酶抑制率以及ec
50
值,数据表示为三个独立实验的平均值
±
sd.
[0137]
我们评估了目标化合物的bv2坏死抑制活性(表1、2)。表1表明，通式(ii) 系列的化合物对bv2细胞的程序性坏死有良好的抑制效力。我们进一步设计并合成了通式(i)系列化合物(表2)，发现大部分化合物在ripk1激酶和bv2细胞上均表现出了纳摩尔级别的效力(例如化合物18，25，27)。进一步的构效关系研究表明酰胺上的取代会引来化合物对细胞的毒性，因此停止对酰胺部分的进一步优化改造。最终化合物27表现出最佳抑制效力，ic
50
值达到了84nm,bv2 抗坏死ec
50
值达到了40nm(图1)。
[0138]
实施例45:化合物在app/ps1双转基因痴呆小鼠体内的认知改善活性评价。
[0139]
雄性app/ps1鼠及其同窝对照(5月龄)购自江苏艾菱菲生物科技有限公司。将小鼠按体重分为5组(每组6只小鼠)：正常对照组、sham组、阳性药nec-1s 组(10mg/kg)、化合物27低剂量组(2mg/kg)、化合物27高剂量组(10mg/kg)。将化合物溶解于由1％dmso、9％tween 80以及90％生理盐水所组成的混合体系中。连续腹腔注射给药四周，一周三至四次。每2天监测一次体重及体温。给药后进行五天的定位航行实验并在第六天撤除平台，进行空间探
索实验。实验完成后处死小鼠，取脑组织作进一步的病理切片考察。单因素方差分析和dunnett的多重比较检验用于确定治疗组和对照组与sham组之间认知水平等相关指标的统计学显着性差异：(*)p《0.05，和(**)p《0.01。
[0140]
购买app/ps1双转基因痴呆小鼠以评价化合物27的认知水平改善功效。根据药物剂量和类型分为五组小鼠(每组6只小鼠)：正常对照组、sham组、阳性药nec-1s组(10mg/kg)、化合物27低剂量组(2mg/kg)、化合物27高剂量组(10 mg/kg)。连续腹腔注射给药四周，一周四次。每天监测体重及体温。给药后morris 水迷宫实验，主要包括为期五天的定位航行实验以及第六天撤除平台进行的空间探索实验。实验完成后处死小鼠，取脑组织作进一步的病理切片考察。
[0141]
如图2所示，正常对照组和给药组的逃逸潜伏期有显著下降，而app/ps1小鼠的逃逸潜伏期也出现了轻微下降。最优化合物27只需低剂量(2mg/kg)给药即可生效，而自第2天起，高剂量治疗(10mg/kg)甚至带来比对照组和nec-1s 组小鼠更好的认知水平(图2a)。与模型组相比，化合物27给药组的平台穿梭次数显著增加(图2b)，证明了化合物27优良的的认知改善效果。
[0142]
iba-1是一种在小胶质细胞中特异性表达的钙结合蛋白，其上调反映了小胶质细胞的激活。我们的免疫荧光结果表明(图3)，在与认知和行为高度相关的内侧前额叶皮层(mpfc)区域，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的iba-1表达水平异常升高，而化合物27的干预治疗使iba-1的表达恢复到正常水平。表明化合物27同时具备了优秀的抗炎效果。