苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法

1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法。


背景技术：

2.酵母因其遗传背景清楚、生长快速等特点，在生物工程研究领域具有重要的研究和应用价值，对其dna(基因组或质粒)进行提取酵母研究过程中的必要步骤之一。
3.酵母菌的细胞壁组成复杂，按结构划分，酵母细胞壁可分为3层，内层为葡聚糖层，中间层主要由蛋白质组成，外层为甘露聚糖层，层与层之间可部分镶嵌；按化学组成划分，甘露聚糖约占酵母细胞壁干重的30％，β-葡聚糖约占30％，糖蛋白和几丁质约占20％，蛋白质、类脂、无机盐等其他成分约占20％。最内层的β-葡聚糖属结构多糖，与原生质体膜相连，构成了酵母细胞壁的主要成分。
4.由于酵母菌细胞壁厚、结构复杂，在对其核酸(基因组、质粒和rna)和胞内蛋白进行提取时，往往需要使用蜗牛酶(snailase)对其细胞壁进行前处理，才能达到较好的破壁效果(范寰,廖伟.一种酵母菌的原生质体制备方法[p].天津：cn101712934a,2010-05-26.)。蜗牛酶的成分复杂(含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶)，价格高，实验周期长(一般蜗牛消化酶处理时间在3～12小时以上)，此外，在提取时会使用β-巯基乙醇(一种无色透明，有刺激性气味的高毒物质)，给操作者带来极大安全隐患。
[0005]
比如，公开号为cn103194440a的发明申请公开了一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法，包括采用lyticase破壁、蛋白酶k与rnase除去组蛋白和rna、氯仿抽提、沉淀、溶解。本发明从影响酿酒酵母基因组提取的质和量入手，将破壁和去除蛋白、rna的过程分开，分别采用不同的缓冲液及添加还原剂来保证破壁的效率和除去杂质的效果。
[0006]
也有通过将多种方法结合在一起来提高酵母dna提取效率的，比如公开号为cn105586333a的发明公开了一种用于核酸扩增的酵母样真菌总dna快速提取方法，所述方法将冻融法、化学裂解法、机械破壁法巧妙整合，在10到20分钟内完成dna提取。


技术实现要素：

[0007]
针对以上问题，开发出一种成本低，安全性高，实验周期短的提取酵母菌基因组前处理方法，对于酵母菌研究来说具有重要的现实意义和极高的应用前景。
[0008]
本发明首先提供了苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用。
[0009]
本发明又提供了一种用于酵母菌核酸提取的试剂盒，包括：
[0010]
(1)有效成分为苯乳酸的酵母菌裂解液；
[0011]
(2)用于从裂解后的酵母菌中提取核酸的提取试剂和/或提取耗材。
[0012]
其中，用于从裂解后的酵母菌中提取核酸的提取试剂和/或提取耗材为吸附柱法、磁珠法或有机溶剂沉淀法提取基因组所用的提取试剂和/或提取耗材。
[0013]
本发明还提供了一种用于酵母菌核酸提取的方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)收集培养的酵母菌后，使用苯乳酸对菌体进行破壁处理；
[0015]
(2)苯乳酸破壁处理完后，将产物进行核酸的获取、纯化和回收。
[0016]
优选的，步骤(1)中苯乳酸使用浓度为不少于5mg/l。更优选的，步骤(1)中苯乳酸使用浓度为5～500mg/l。进一步优选的，步骤(1)中苯乳酸使用浓度为100～150mg/l。最优选的，步骤(1)中苯乳酸使用浓度为100mg/l。
[0017]
优选的，步骤(1)中苯乳酸处理时间为15min～5h。更优选的，步骤(1)中苯乳酸处理时间为0.5h～3h。更优选的，步骤(1)中苯乳酸处理时间为1h～3h。最优选的，步骤(1)中苯乳酸处理时间为1h。
[0018]
优选的，步骤(2)中核酸的获取、纯化和回收使用吸附柱法、磁珠法或有机溶剂沉淀法。
[0019]
本发明相对传统酵母核酸提取采用的蜗牛酶处理法来说，具有成本低、提取时间短，且不使用有毒的β-巯基乙醇，降低实验的危险性。同时苯乳酸较蜗牛酶来说，易于保存且不易失活。此外，本发明可以与蜗牛酶处理法的酵母核酸后续获取、纯化和回收(包括吸附柱法、磁珠法和有机溶剂沉淀法等)很好的兼容，不需额外开发后续处理步骤。
附图说明
[0020]
图1为实施例1中酵母菌基因组提取结果电泳图，泳道marker为dna分子量标准，泳道1、2、3分别为实施例1中1、2、3号样品。
[0021]
图2为实施例2中提取的酵母基因组进行分子克隆(pcr)电泳结果，泳道marker为dna分子量标准，泳道1、2分别为实施例2中1、2号样品。
[0022]
图3为实施例3中酵母菌基因组提取结果电泳图，泳道marker为dna分子量标准，泳道1、2、3、4、5、6分别为实施例3中1、2、3、4、5、6号样品。
[0023]
图4为实施例4中酵母菌基因组提取结果电泳图，泳道marker为dna分子量标准，泳道1、2、3分别为实施例4中1、2、3号样品。
[0024]
图5为实施例5中酵母菌基因组提取结果电泳图，泳道marker为dna分子量标准，泳道1、2、3、4分别为实施例5中1、2、3、4号样品。
具体实施方式
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实施例1
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实验材料：毕赤酵母x33、l-(3)-苯乳酸、异丙醇、β-巯基乙醇、蜗牛消化酶，其酵母基因组dna快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
[0027]
实验方法：(1)从平板上挑取酵母菌x33单菌落，接种ypd培养基，30℃，200rpm培养24h。分别移取三份0.5ml菌液加入1.5ml离心管中，编号为1、2、3号，室温10000g离心1min，弃上清，收集菌体，用加入1ml生理盐水重悬清洗菌体两次。(2)在1号离心管中加入600μlsnailase reaction、2.4μlβ-巯基乙醇和50μl溶解好的snailase；2号离心管中加入600μl的300mg/l浓度的苯乳酸和2.4μlβ-巯基乙醇；在3号离心管中加入600μl的300mg/l浓度的苯乳酸。将3组离心管置于37℃水浴3h后，室温10000g离心2min，弃上清。(3)分别将3组处理完的菌体，按照酵母基因组dna快速抽提试剂盒中核酸吸附柱法的处理步骤进行dna的获
取、纯化和回收，具体步骤按说明书进行。(4)采用1％琼脂糖凝胶对提取的基因组进行检验。
[0028]
实验结果如图1所示：1、2、3号样品均验证提取得到了高质量的酵母菌基因组，说明苯乳酸可以代替snailase在酵母菌基因组提取过程中的作用。对比2、3号样品可知，利用苯乳酸提取酵母菌基因组时，是否加入β-巯基乙醇对于酵母菌基因组提取效果基本没有影响。因此，可以利用苯乳酸来代替snailase在酵母基因组提取过程中破坏酵母菌细胞壁的作用，同时避免了加入β-巯基乙醇，增加了实验的安全性。
[0029]
实施例2
[0030]
实验试剂：快速高保真dna聚合酶fastpfu(北京全式金生物有限公司)。
[0031]
实验方法：将利用snailase(提取过程中使用了β-巯基乙醇)处理过后提取得到的酵母菌基因组编号1，利用苯乳酸(提取过程中未使用β-巯基乙醇)处理过后提取得到的酵母菌基因组编号2(具体提取方法同实施例1)。利用pcr技术，分别扩增1、2号酵母菌基因组，以进一步验证苯乳酸提取的基因组的质量。酵母菌基因片段扩增条件如下：扩增引物序列为，aoxi-f：ggcaaatggcattcagacatcct；aoxi-r：gactggttccaattgacaagct。反应体系如表1。pcr克隆程序：95℃变性5min；以94℃变性1min、55℃退火45s，72℃延伸40s反应循环35次后，72℃延伸5min，再冷却至4℃。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证。
[0032]
表1 pcr扩增反应体系
[0033][0034][0035]
实验结果如图2所示：1、2号酵母菌基因组经pcr基因克隆后均成功克隆出酵母菌基因组，且大小为1.8kb左右，说明经苯乳酸处理后提取得到的酵母菌基因组与利用snailase处理后得到的酵母菌基因组一样可以进行常规的分子生物学操作。
[0036]
实施例3
[0037]
实验材料：毕赤酵母x33、l-(3)-苯乳酸、异丙醇，ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
[0038]
实验方法：(1)从平板上挑取酵母菌x33单菌落，接种ypd培养基，30℃，200rpm培养24h。分别移取三份0.5ml菌液加入1.5ml离心管中，编号为1、2、3号，室温10000g离心1min，弃上清，收集菌体，加入1ml生理盐水重悬清洗菌体两次。(2)准备6组离心管，编号1-6，分别向其中加入浓度为500mg/l、300mg/l、150mg/l、100mg/l、50mg/l、10mg/l的苯乳酸600μl。将
6组离心管置于37℃水浴3h后，室温10000g离心2min，弃上清。(3)分别将6组处理完的菌体，按照ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒中核酸吸附柱法的处理步骤进行dna的获取、纯化和回收，具体步骤按说明书进行。(4)采用1％琼脂糖凝胶对提取的基因组进行检验。
[0039]
实验结果如图3所示：6组样品均验证提取得到了较高质量的酵母菌基因组，说明从10mg/l至500mg/l的苯乳酸浓度，均可以对酵母菌起到破坏细胞壁的作用。因此，可以利用较低的苯乳酸浓度来代替snailase在酵母基因组提取过程中破坏酵母菌细胞壁的作用，节约了酵母菌基因组提取的实验成本。
[0040]
实施例4
[0041]
实验材料：毕赤酵母x33、l-(3)-苯乳酸、异丙醇，ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
[0042]
实验方法：(1)从平板上挑取酵母菌x33单菌落，接种ypd培养基，30℃，200rpm培养24h。分别移取三份0.5ml菌液加入1.5ml离心管中，编号为1、2、3号，室温10000g离心1min，弃上清，收集菌体，加入1ml生理盐水重悬清洗菌体两次。(2)准备3组离心管，编号1-3，向3组离心管中加入浓度为300mg/l的苯乳酸600μl。将3组离心管分别置于37℃水浴3h、1h、0.5h后，室温10000g离心2min，弃上清。(3)分别将3组处理完的菌体，按照ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒中核酸吸附柱法的处理步骤进行dna的获取、纯化和回收，具体步骤按说明书进行。(4)采用1％琼脂糖凝胶对提取的基因组进行检验。
[0043]
实验结果如图4所示：3组样品均验证提取得到了较高质量的酵母菌基因组，说明从经300mg/l的苯乳酸处理0.5-3h，均可以对酵母菌起到破坏细胞壁的作用。因此，相较于提取酵母菌基因组的常规方法(如蜗牛酶法)，利用苯乳酸可以降低提取过程所需要的时间，节约了酵母菌基因组提取的时间成本。
[0044]
实施例5
[0045]
实验材料：毕赤酵母x33、l-(3)-苯乳酸、异丙醇，ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
[0046]
实验方法：(1)从平板上挑取酵母菌x33单菌落，接种ypd培养基，30℃，200rpm培养24h。分别移取三份0.5ml菌液加入1.5ml离心管中，编号为1-4号，室温10000g离心1min，弃上清，收集菌体，加入1ml生理盐水重悬清洗菌体两次。(2)向4组离心管中分别加入浓度为5、5、10、10mg/l的苯乳酸600μl。将4组离心管置于37℃分别水浴15min、1h、15min、1h后，室温10000g离心2min，弃上清。(3)分别将4组处理完的菌体，按照ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒中核酸吸附柱法的处理步骤进行dna的获取、纯化和回收(未使用rnase)，具体步骤按说明书进行。(4)采用1％琼脂糖凝胶对提取的基因组进行检验。
[0047]
实验结果如图5所示：4组样品均验证提取得到了较高质量的酵母菌基因组，说明经5mg/l的苯乳酸处理15min，即可以对酵母菌起到破坏细胞壁的作用。因此，相较于提取酵母菌基因组的常规方法(如蜗牛酶法)，利用低浓度的苯乳酸即可提取得到基因组，且极大缩短了提取过程所需要的时间，节约了酵母菌基因组提取的时间成本。