基于rnai干扰核盘菌oah基因的重组载体及其构建方法与应用
技术领域：
：1.本发明涉及植物基因工程
技术领域：
：，尤其涉及一种基于rnai干扰核盘菌oah基因的重组载体及其构建方法与应用。
背景技术：
：：2.核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)是制约油菜生产的最主要病害。核盘菌治病范围十分广泛，可寄生75个科278个科属400多种植物，每年在世界范围内造成巨大的经济损失(bolandg.，hallr.indexofplanthostsofsclerotiniasclerotiorum[j].canjplantpathol，1994,16:93-108)。核盘菌引起的菌核病不仅会导致油菜减产，还会使油菜籽的品质下降(张晓娟，张羽,胡胜武.油菜菌核病抗性机理及抗病遗传育种研究进展,分子植物育种，2016,14(3):704-711)。目前防治核盘菌的方法主要依靠化学防治法和抗病品种选育，但是化学防治方法存在较多的不足，比如防治效果不高，花期喷药困难，容易造成农药残留，易造成环境污染，时间一长，容易造成核盘菌产生耐药性，从而导致杀菌剂防治效果下降(秦虎强,陈芳颖,付鼎程.油菜菌核病菌对10种杀菌剂的敏感性及不同药剂田间防效[j].西北农林科技大学学报自然科学版,2011,39(7):117-122)。由此，常规防治核盘菌的方法不足以满足油菜产量需求，利用分子育种技术培育抗核盘菌品种油菜成为提高油菜产量的重要策略。[0003]核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌(hegedusd.d,rimmers.r.sclerotiniasclerotiorum:when“tobeornottobe”apathogen[j].fernsmicrobiologyletters,2005,251(2):177-184)。核盘菌致病机理复杂，目前的研究主要认为核盘菌通过分泌植物细胞壁降解酶(plantcellwalldegradingenzymes,pcwdes)降解寄主细胞壁，分泌草酸(oxalicacid,oa)来协助其侵染植物,另外一些效应因子(effector)也参与核盘菌与寄主之间的互作。草酰乙酸水解酶(oah)是产生草酸的关键性酶(jaroszwilkolazkaa.,gaddgm.oxalateproductionbywood-rottingfungigrowingintoxicmetal-amendedmedium[j].chemosphere，2003,52(3)：541-547)。在草酸合成的最后一步中，该酶能够将草酰乙酸水解，直接形成草酸(duttonmv,evansc.s.oxalateproductionbyfungi:itsroleinpathogenicityandecologyinthesoilenvironment[j].canadianjournalofmicrobiology,1996,42(9)：881-895)，是真菌中特有的酶。在真菌的草酸代谢研究中，草酰乙酸水解酶也是研究的必要性酶。[0004]godoy等利用紫外诱变核盘菌子囊孢子，获得了草酸缺乏突变体，该突变体致病力降低，证实草酸在核盘菌侵染中起到重要作用(godoyg.,steadmanj.r.,dickmanm.b,damr.useofmutantstodemonstratetheroleofoxalicacidinpathogenicityofsclerotiniasclerotiorumonphaseolusvulgaris[j].physiologicalandmolecularplantpathology,1990,37(3):179-191)。xu等使用两种独立的诱变技术产生了核盘菌的草酸缺失突变株，该突变株可以积累富马酸，但对环境的酸化能力降低，但其毒extracellularvesiclestofungalpathogentosilencevirulencegenes[j].science,2018,360(6393):1126-1129)。最近，有研究人员利用higs技术在烟草中表达核盘菌sschs的rnai结构，发现转基因t1代烟草的菌核病抗性显著增强(andradecm,tinocom.l.p.,riethaf,maiafco,fjl.host-inducedgenesilencinginthenecrotrophicfungalpathogensclerotiniasclerotiorum[j].plantpathology,2016,65(4):626-632.)。有研究者生产了表达针对map激酶基因(psfuz7)的rnai构建体的转基因小麦品系，并证明它们对锈菌基因pst具有明显的抗性(zhux.,qit.,yangq.,etal.host-inducedgenesilencingofthemapkkgenepsfuz7confersstableresistancetowheatstriperust[j].plantphysiol,2017,175(4):1853-1863.)2018年，在转基因小麦中又产生了针对蛋白激酶a(pscpk1)催化亚基基因的sirna，并在第四代小麦中观察到对真菌pst的抗性，并表明camp信号通路基因被下调(qit.,zhux.,tanc.,etal.host-inducedgenesilencingofanimportantpathogenicityfactorpscpk1inpucciniastriiformisf.sp.triticienhancesresistanceofwheattostriperust[j].plantbiotechnolj,2018,16(3):797-807.)。[0006]综上所述，rnai干扰核盘菌致病关键基因oah能够干扰核盘菌草酸的积累，从而降低核盘菌对甘蓝型油菜的毒害。但目前对利用rnai干扰核盘菌致病关键基因oah的研究尚不深入，其他真菌的oah基因功能报道很少，对其他作物的作用尚不清楚。技术实现要素：[0007]有鉴于此，本技术提供一种基于rnai干扰核盘菌oah基因的重组载体及其构建方法与应用，提高甘蓝型油菜对菌核病抗性。[0008]为达到上述技术目的，本技术采用以下技术方案：[0009]第一方面，本技术提供一种重组载体，其为pcambia1301-d35s-ssoah-nos，重组载体包含seqidno：1所示的核盘菌oah基因的干扰核苷酸序列。[0010]优选的，其构建过程如下：在载体pcambia1301的kpni与spei酶切位点处进行双酶切，将核盘菌的致病基因oah与link片段连接，获得的正向干涉片段和反向干涉片段与回收的pcambia1301线性载体质粒进行连接，即得重组载体。[0011]第二方面，本技术提供一种重组载体在抗油菜菌核病中的应用。[0012]优选的，重组载体用于构建ss.oah.rnai的转基因株系。[0013]优选的，重组载体用于干扰核盘菌草酸的积累。[0014]优选的，其应用方法包括：[0015]根据seqidno：1所示的核盘菌oah基因，构建重组载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos；[0016]将得到的重组载体转入微生物培养表达，以侵染法转化目标植物，获得抗性转基因株系。[0017]优选的，其应用方法包括：[0018]根据seqidno：1所示的核盘菌oah基因，构建重组载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos；[0019]将得到的重组载体转入农杆菌gv3101，以农杆菌侵染法转化甘蓝型油菜，采用pcr鉴定出转基因株系；[0020]通过qpcr鉴定ss.oah表达水平；[0021]培育ss.oah.rnai的转基因株系。[0022]第三方面，本技术提供一种提高油菜对菌核病抗性的方法，方法包括在油菜中导入核盘菌致病基因oah的干扰片段，其中，基因oah的核苷酸序列如seqidno.1所示。[0023]本技术的有益效果如下：[0024]1.虽然在油菜中已经克隆了多个核盘菌致病分泌蛋白，研究者对其进行了一些抗病功能研究，但目前在甘蓝型油菜利用rnai技术抗菌核病领域还鲜有报道，本发明利用rnai干扰核盘菌oah基因丰富了甘蓝型油菜采用rnai技术抗菌核病的研究；[0025]2.本发明中克隆得到的oah干扰载体，为其它作物抗病育种提供了新的遗传资源，为提高其它作物对菌核病抗性具有指导和借鉴作用；[0026]3.本发明构建的干扰载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos转化油菜后获得的ss.oah.rnai转基因株系，从oah的功能获得方面进行研究，为干扰核盘菌草酸积累提高甘蓝型油菜抗病功能研究提供了原材料，并具有重要意义；[0027]4.本发明通过对ss.oah.rnai转基因株系在抗菌核病方面的一系列研究，充分证明了核盘菌oah参与到了菌核病对植物的侵染中，并扮演着重要的角色。通过干扰核盘菌oah基因的表达能够降低草酸在植物体内的积累，提高植物对菌核病的抗性。对阐明沉默核盘菌oah基因的生物学功能有重要意义；[0028]5.转录后沉默核盘菌oah基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义；[0029]6.选育抗菌核病的油菜材料一直为油菜育种家所重视，rnai干扰核盘菌oah的开发和利用将有助于解决生产上油菜抗菌核病问题。由于目前生产上菌核病造成的油菜产量和品质损失巨大，使得选育抗病品种显得尤其重要，rnai干扰核盘菌oah技术将有助于培育高抗油菜品种，也为rnai干扰核盘菌oah基因在主要油料作物(油菜)抗菌核病方面的应用提供了理论与实践依据；为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料；在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。附图说明[0030]图1为本发明转化载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos的构建过程示意图；[0031]图2为农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系；[0032]图3为rnai干扰核盘菌致病基因oah转基因株系阳性苗鉴定；[0033]图4为ss.oah.rnai转基因株系对菌核病的离体叶片接菌抗性鉴定；[0034]图5为ss.oah.rnai转基因株系对菌核病的活体茎秆接菌抗性鉴定；[0035]图6为野生型和ss.oah.rnai转基因株系离体叶片接菌接种核盘菌后各个时期oah基因表达量分析；[0036]图7为野生型油菜和ss.oah.rnai转基因株系叶片萃取液培养核盘菌验证实验。具体实施方式[0037]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0038]本发明构建了一种具有rnai干扰功能、影响甘蓝型油菜对核盘菌的抗性的干扰载体。利用其干扰核盘菌草酸合成，从而提高甘蓝型油菜对菌核病抗性的方法，例如利用转基因对油菜进行遗传改良，提高油菜对菌核病菌的抗性，为油菜抗菌核病育种提供新的遗传资源。[0039]在本发明中，申请人发现用核盘菌甘蓝型油菜进行胁迫处理后，核盘菌分泌的致病分泌蛋白中oah基因的表达量显著上调，且遗传转化获得的ss.oah.rnai转基因材料对核盘菌抗性显著增强，这一结果在增强菌核病抗性和提高油菜籽产量上具有重要的应用前景。[0040]本技术中核盘菌oah基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示(序列1)，核盘菌oah基因编码的蛋白质序列，如seqidno：2所示(序列2)，本技术的序列序号从下文开始，以出现顺序开始编号，起始号序号为3，以下不再赘述。[0041]具体方案如下：[0042]本技术通过对已报道的核盘菌中oah基因功能侵染性进行分析，发现该基因在侵染植物过程中起关键作用(wuj.,zhaoq.,yangq.,liuh.,liq.,yix.,chengy.,guol.,fanc.,zhouy.corrigendum:comparativetranscriptomicanalysisuncoversthecomplexgeneticnetworkforresistancetosclerotiniasclerotioruminbrassicanapus[j].scirep,2017(2)21；7:42829.lyux.,shenc.,fuy.,xiej.,jiangd.,lig.,etal.asmallsecretedvirulence-relatedproteinisessentialforthenecrotrophicinteractionsofsclerotiniasclerotiorumwithitshostplants[j].plospathog,2016,12(2):e1005435.)，但在rnai干扰领域尚无深入研究。通过ncbi获得核盘菌oah基因核苷酸序列，分析其cds区域序列，运用生物软件primerpremier5设计引物，核盘菌oah核苷酸序列如seqidno：1。[0043]干扰载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos的构建方法如下：取pda培养基上20-22℃暗培养了36小时的核盘菌，提取rna(利用super总rna提取试剂盒，购自promega公司，美国)，利用反转录酶【iiqrtsupermixforqrna(+gdnawiper)试剂盒，购自vazyme公司，中国】将其反转录合成cdna，反应条件为：42℃2min，50℃15min，85℃5sec。以cdna为模板，选择合适的目的基因干扰序列，将oah干涉片段和中间link序列片段使用引物oah-sf(5’‑cggggtaccggatacggtggacctctcattg-3’)和oah-ovlapsr(5’‑gtgcacgcgtacgtaaggttgtggtgatgataggagtagcgc-3’)进行pcr扩增。pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃30sec，56℃30sec，68℃40sec，32个循环；68℃延伸5min，25℃1min。将正向干涉片段与中间link序列使用引物oah-asf(5’‑acgcgtcgacgtggtgatgataggagtagcgc-3’)和oah-asr(5’‑cggactagtggatacggtggacctctcattg-3’)通过pcr重叠延伸技术连接到一起，pcr重叠延伸反应程序与之前一致，延伸改为45sec。然后利用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。将干涉片段克隆至peasy-blunt载体并转化到大肠杆菌dh5α，挑选克隆子，做菌液pcr检测，pcr程序为：98℃预变性3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃延伸4min，25℃1min，得到阳性的正向干涉克隆载体(oah-s-l)和反向干涉克隆载体(oah-as)。[0044]进一步，申请人选择kpni与spei酶切位点双酶切pcambia1301载体质粒，胶回收线性载体质粒。kpni与sali酶切ri02s-w载体，sali与spei双酶切ri02as后均通过ta回收相应的外源片段，与回收的线性载体质粒利用t4dna连接酶进行连接。用连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞。挑取克隆子，做菌液pcr检测确定阳性克隆子。得到的pcr产物长度约700bp，菌液阳性检测引物dsf(5’‑tagccacccaagaaactgct-3)和dsr(5’‑attgatcagcctaaccaaac-3’)，从而获得干扰载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos。[0045]利用农杆菌介导遗传转化方法，通过侵染油菜下胚轴将构建好的干扰载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos转化到甘蓝型油菜westar的下胚轴中，直至得到分化成苗的材料(图2)。通过2×ctab法提取野生型甘蓝型油菜为对照与转基因油菜株系叶片基因组dna，以载体上的link序列引物link-ovlapf(5’‑aaccttacgtacgcgtgcac-3’)和link-salr(5’‑acgcgtcgaccactgaattgaattgtttaagg-3’)进行pcr扩增，筛选出37株为阳性植株，株系编号分别为6、7、8、9、11、12、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47阳性株系(部分pcr结果见图3)。[0046]对野生型甘蓝型油菜对照(wt)和ss.oah.rnai转基因株系(r18、r25、r36)分别进行苗期离体叶片和活体茎秆核盘菌菌块鉴定，一般接种后36小时(36hpi)发病最为显著。在发病显著时统计菌核病病情指数，具体方法参考吴健等的甘蓝型油菜菌核病抗性鉴定方法(wuj.,zhaoq.,yangq.,etal.comparativetranscriptomicanalysisuncoversthecomplexgeneticnetworkforresistancetosclerotiniasclerotioruminbrassicanapus[j].scientificreports,2016,6:19007)。病指统计结果表明，ss.oah.rnai转基因抗性株系在接菌36h发病最为显著的时期，病斑面积明显低于野生型，即非转基因油菜(简称wt)，见图4ss.oah.rnai转基因株系对菌核病的离体叶片接菌抗性鉴定结果，图4中的a图为wt与ss.oah.rnai转基因植株苗期叶片离体接菌36h后的发病表型；图4中的b图对应于图4中的a图中wt与ss.oah.rnai转基因株系叶片经核盘菌侵染36h后的病斑大小。wt和r25、r18、r36分别表示用野生型和ss.oah.rnai转基因株系接种核盘菌。结果显示：ss.oah.rnai转基因株系叶片的菌丝扩展面积明显小于野生型对照材料，说明rnai干扰核盘菌oah基因后，转基因植株叶片对菌核病的抗性增强。ss.oah.rnai转基因抗性株系活体茎秆接菌4d后，其病斑直径明显低于野生型，见图5为ss.oah.rnai转基因株系对菌核病的活体茎秆接菌抗性鉴定，图5中的a图为wt与ss.oah.rnai转基因植株成熟期活体茎秆接菌4d后的发病表型；图5中的b图对应于图5中的a图中wt与ss.oah.rnai转基因株系茎秆经核盘菌侵染4d后的病斑直径。wt和r18、r25、r36分别表示用野生型和ss.oah.rnai转基因株系接种核盘菌。结果显示：ss.oah.rnai转基因株系活体茎秆接菌4d后病斑直径明显小于野生型对照材料，说明rnai干扰核盘菌oah基因后，转基因植株茎秆对菌核病的抗性增强。以上说明ss.oah.rnai转基因油菜植株能够提高油菜对菌核病的抗性水平。[0047]在接种核盘菌菌块24h、36h、48h、60h、72h时，取wt和ss.oah.rnai转基因植株的病斑组织菌丝，提取二者的核盘菌菌丝rna并反转录成cdna，对ssoah基因进行表达量分析。结果表明，ss.oah.rnai转基因株系中oah基因的表达量低于wt，见图6野生型和ss.oah.rnai转基因株系离体叶片接种核盘菌后各个时期oah基因表达量分析，其中，wt和ss.oah.rnai转基因株系离体叶片接种核盘菌24h、36h、48h、60h、72h时取其病斑组织，检测其病斑部位菌丝体内oah表达量，结果显示，rnai干扰核盘菌oah基因后，影响了转基因油菜病斑部位中菌丝体内oah基因的表达，表明转基因材料可能是通过降低核盘菌菌丝体内oah的表达，从而影响核盘菌的草酸合成途径来抵御外来致病菌的入侵。进一步检测其对菌核病的抗性是否是由rnai干扰oah所导致的，萃取野生型和转基因油菜组织后制成pda培养基，观察接种核盘菌40h后菌丝扩展情况以及扩展面积，结果表明，转基因材料制成的pda菌丝扩展面积明显小于野生型，显著抑制了核盘菌的扩展；进一步在体式显微镜下观察核盘菌菌丝的扩展情况，发现转基因材料制成的pda培养基上面的菌丝生长状态与野生型相比，扩展长度较短，菌丝分支少，菌丝生长异常，见图7中的a图；为萃取野生型和转基因油菜组织提取液后制成的pda培养基，观察pda空白对照培养基、野生型制备的培养基、转基因株系制备的培养基，接种核盘菌菌丝40h菌丝扩展及生长情况以及扩展面积统计。附图标记说明：mock为未添加植物萃取液的pda培养基，为空白对照；36h：接种核盘菌菌丝块36h后菌丝扩展大小；48h:接种核盘菌菌丝块48h后菌丝扩展大小。结果发现，转基因材料(r18、r25、r36)提取液制成的pda培养基培养的核盘菌菌丝扩展面积明显小于野生型，分别减小了35.29％、21.98％、31.53％；且菌丝生长状态与野生型相比，扩展长度较短，菌丝细密且分支较少，菌丝生长异常，其中r18、r36株系培养的菌丝在生长过程中发生断裂，菌丝生长状态异常。将添加了转基因株系叶片萃取液的pda培养基上生长受阻的菌丝接种于野生型油菜进一步检测其致病性，与接种了野生型油菜培养的菌丝相比，接种了转基因材料的菌丝在侵染野生型油菜36h和48h后，病斑面积小于野生型，结果表明，干扰草酸合成影响了核盘菌菌丝的生长和扩展，进一步表明菌丝生长可能是由于转基因材料体内rnai的干扰了病原菌体内oa的合成，见图7中的b图，为将添加了wt与转基因株系萃取液的pda培养基培养的核盘菌菌丝块接种于野生型油菜叶片上，进一步观察其致病性。结果发现，与接种了野生型油菜提取液培养的核盘菌相比，接种了转基因材料提取液培养的核盘菌在侵染正常的野生型油菜36h与48h后，病斑面积与野生型相比均明显减小，以上结果表明：ss.oah.rnai转基因油菜能够限制核盘菌菌丝的生长和扩展，影响核盘菌的致病能力。进一步表明rna干扰草酸合成能够影响核盘菌菌丝的生长和扩展，限制核盘菌的致病能力。上述成果对于培育油菜抗病品系具有重要的意义。[0048]本技术中，通过分析核盘菌侵染油菜时分泌的致病效应蛋白表达量，筛选出致病性较强的oah基因，从核盘菌cdna中扩增出oah干扰片段，将该基因干扰序列连接至甘蓝型油菜westar中筛选出的序列中，并接种核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)，快速鉴定其在油菜菌核病抗性中的功能。[0049]本发明从核盘菌中分离克隆得到核盘菌关键致病蛋白oah核苷酸序列，将其作为干涉片段，靶向沉默核盘菌oah基因表达，该序列如seqidno：1所示。本发明对rnai干扰核盘菌oah基因的功能进行了验证。通过基因工程技术在沉默核盘菌oah基因表达，影响草酸合成积累，使转基因油菜叶片及茎秆接种菌核病后病斑面积减少，提高转基因油菜对核盘菌的抗性，对增强甘蓝型油菜对菌核病抗性具有重要的应用前景。[0050]以下通过具体实施例对本方案进行说明。[0051]实施例1[0052]rnai干扰载体的构建：取在pda培养基上20-22℃暗培养了36小时的核盘菌，采用fungaltotalrnaisolationkit真菌总rna提取试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，提取病斑部位核盘菌菌丝rna，rna提取完成后后用dnasei(购自promega公司试剂盒)处理，rna完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(etbr)电泳检测(5v/cm)。核酸浓度的测定在implennanophotometer-n50系列超微量紫外分光光度计(德国)上进行。rna260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0，浓度大于500ng/μl的rna用于下一步的分析。[0053]cdna的合成是利用iiqrtsupermixforqrna(+gdnawiper)试剂盒(购自vazyme公司，中国)进行的，以1μg总rna为模版，与4μl4×gdnawipermix，depc-water混匀，总体积16μl，42℃2min，放于冰上骤冷2-3min；再加入5×hiscriptiiqrtsupermixii4μl混匀，总体积为20μl；然后50℃15min，85℃5sec，每份cdna稀释到200μl后-20℃保存待用。[0054]根据ncbi上公布的核盘菌oah序列信息，选择合适的干涉片段如下：ggatacggtggacctctcattgttgacaaagccgtcaaggcctacatcagagccggtgttgctggattccatatcgaagatcaaattcaaaacaagcgttgtggccatcttgcaggcaagaaggttgtccctgaagaagagtactacatgagaattcgtgccgccaagggtgccaaagatgccatgaaatccgatattgtgttgattgcacgcacagatgcgctccaacaacttggttatgatgagtgcgtcaaacgtttgaaggttgctcgtgagcttggtgcagatgttggcttgctcgagggttacacttcaaaggagatggctgcaaagactgttaaggagttcgccccatggccaatacttttgaacatggtcgagaacggcgctactcctatcatcaccac。[0055]使用primerpremier5.0软件设计如下的干涉片段引物：设计干涉片段引物oah-sf(5’‑cggggtaccggatacggtggacctctcattg-3’)和oah-ovlapsr(5’‑gtgcacgcgtacgtaaggttgtggtgatgataggagtagcgc-3’)，利用transtaqhifidnapolymerase(全式金(北京)生物公司)扩增，和中间link序列片段进行扩增，pcr扩增程序为94℃预变性5min；94℃30sec，56℃30sec，68℃40sec，32个循环；68℃延伸5min，25℃1min。再将正向干涉片段与中间link序列使用引物oah-asf(5’‑acgcgtcgacgtggtgatgataggagtagcgc-3’)和oah-asr(5’‑cggactagtggatacggtggacctctcattg-3’)通过pcr重叠延伸技术连接到一起，pcr重叠延伸反应程序与之前一致，延伸改为45sec。然后利用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接与转化参照uniq-10柱式dna胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行操作。目的片段与t载体的连接体系为：4.5μl目的片段，0.5μlpmd-18t载体，5μlsolutionⅰ(宝生物工程(大连)有限公司)在16℃下连接过夜。[0056]通过热激发将连接产物转化，将干涉片段克隆至peasy-blunt载体并转化到大肠杆菌dh5α中，菌液涂于含100mg/lamp抗生素的lb固体平板上，约生长10-12h小时后，挑选单克隆，做菌液pcr检测，pcr程序为：98℃预变性3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃延伸4min，25℃1min，得到阳性的正向干涉克隆载体(oah-s-l)和反向干涉克隆载体(oah-as)。选择kpni与spei酶切位点双酶切pcambia1301载体质粒，胶回收线性载体质粒。kpni与sali酶切ri02s-w载体，sali与spei双酶切ri02as后均通过ta回收相应的外源片段，与回收的线性载体质粒利用t4dna连接酶连接产物，电转化到大肠杆菌感受态细胞中。挑取克隆子，做菌液pcr检测确定阳性克隆子。得到的pcr产物长度约700bp，菌液阳性检测引物dsf(5’‑tagccacccaagaaactgct-3)和dsr(5’‑attgatcagcctaaccaaac-3’)，从而获得干扰载体pcambia1301-d35s-ssoah-nos。干扰载体细菌抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素。[0057]实施例2[0058]ss.oah.rnai转基因油菜植株的获得：[0059](1)油菜的遗传转化[0060]如图2农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系所示，其中，图2中的a图为经0.1％升汞消毒后的甘蓝型油菜westar种子播于1/2ms培养基上发芽；图2中的b图为置于24℃暗培养5d左右长出的黄化下胚轴；图2中的c图为黄化下胚轴在无菌条件下切成0.8cm左右小段，置于含有转化载体的农杆菌gv3101中侵染；图2中的d图为侵染后下胚轴转入m1培养基中暗培养48h；图2中的e图为共培养后的外植体置于m2培养基中经16h光照/8h暗培养周期选择培养15-20d；图2中的f图为选择培养后的外植体置于m3培养基中经16h光照/8h暗培养周期选分化培养15d以上直至出芽；图2中的g图为分化培养出芽后的外植体置于新鲜m3培养基中经16h光照/8h暗培养周期选择分化培养15d以上直至分化成幼苗；图2中的h图为幼苗置于m4培养基上生根。[0061]通过常规的农杆菌下胚轴侵染法将重组质粒(即干扰载体)[0062]pcambia1301-d35s-ssoah-nos转入农杆菌gv3101,筛选并分化成苗，具体步骤如下：[0063]a.播种：用75％的酒精清洗野生甘蓝型油菜种子1min，再用0.1％的升汞溶液清洗种子5min，最后用无菌水清洗种子5次；用灭过菌的镊子把种子放入m0固体培养基(1962年配方的ms无机盐和微量元素4.404g/l,调ph至5.8-5.9，加琼脂7g/l，按照常规高压蒸汽灭菌法进行灭菌)中，将接种的种子在24℃下，暗培养5天。[0064]b.农杆菌的活化：播种3天后，取-80℃保存的农杆菌菌种gv3101在含有利福平(50mg/ml)、庆大霉素(50mg/ml)和卡那霉素(50mg/ml)的lb固体培养基上划线，28℃培养16h。挑单菌落于5ml含有利福平(50mg/ml)、庆大霉素(50mg/ml)和卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养20-24h，使农杆菌生长至对数期。取500ul培养好的菌液于50ml的lb液体培养基(含三种抗生素)扩大培养约12h。[0065]c.侵染菌液制备：把活化好的农杆菌液倒入2个50ml无菌离心管中，3500rpm离心15min，去上清，置于冰上，用1ml的dm液体培养基(murashigeandskoog,1962年配方的ms无机盐和微量元素4.404g/l,蔗糖30g/l,调培养基的ph至5.8-5.9,121℃灭菌20min，灭菌完成无菌操作台内加入2,4-d1mg/l,as100mmol/l,kt0.3mg/l)清洗菌液，离心，去上清，加入2-3ml的dm液体培养基重悬菌体，使侵染菌液od600约为0.6左右。[0066]d.侵染外植体：把步骤c中的侵染菌液置于冰上，同时，用解剖刀切好步骤a中暗培养甘蓝型油菜幼苗的下胚轴(每段下胚轴的长度为0.8-1.0cm为宜)，用无菌镊子把切好的下胚轴转入装有侵染菌液的平皿，视菌液浓度侵染15-30min(每隔3min摇晃一下)。[0067]e.共培养：将侵染完成的外植体转至装有滤纸的平皿(应提前灭菌处理)中，吸干外植体表面可见的侵染液，然后转入m1固体共培养基(murashigeandskoog,1962年配方的ms无机盐和微量元素4.404g/l,甘露醇18g/l,蔗糖30g/l,2,4-d2mg/l,kt0.3mg/l,调培养基的ph至5.8-5.9，加琼脂7g/l，灭菌后加入100mmol/las)中，24℃暗培养40-48h。[0068]f.筛选：将共培养完成的外植体转至m2固体选择培养基(murashigeandskoog,962年配方的ms无机盐和微量元素4.404g/l,甘露醇18g/l,蔗糖30g/l,2,4-d2mg/l,kt0.3mg/l,调培养基的ph至5.8-5.9，加琼脂7g/l)上，进行20天的筛选培养，条件为：24℃，16h光照/8h暗培养。[0069]g.分化培养：将筛选后的外植体转至m3固体分化培养基(murashigeandskoog,1962年配方的ms无机盐和微量元素4.404g/l,葡萄糖10g/l,木糖0.25g/l,酵母浸出(液)膏(mes)0.6g/l,调培养基的ph至5.8-5.9，加琼脂7g/l，灭菌后加入玉米素(zt)2mg/l,iaa0.1mg/l,(中文名称)tmt250mg/l,kan25mg/l)上，开始分化培养，每隔15-20天继代一次，直到分化出芽(培养条件与步骤f中筛选条件一致)。[0070]h.生根培养：等到分化出芽的幼苗上能发现明显生长点后，用解剖刀贴着愈伤组织和芽相接的位置，小心翼翼地把幼苗切下(操作过程中一定要小心不能伤害到生长点)，然后把幼苗转移至m4固体培养基(murashigeandskoog,1962年配方的ms无机盐和微量元素2.202g，sucrose10g/l,iba0.5mg/l,调培养基的ph至5.8-5.9，加琼脂7g/l，灭菌后加入tmt250mg/l,kan25mg/l)中生根。[0071](2)转基因植株的鉴定[0072]a.甘蓝型油菜叶片基因组dna的提取[0073]采用常规ctab法进行dna的提取。具体步骤为：取长度为1～2cm的幼嫩甘蓝型油菜叶片，放置于提前预冷的研钵中，途中加2～3次液氮研磨至细微的浆状后，转移到1.5ml离心管中，加入700μl2×ctab溶液，70℃温育30min，间隔6min轻柔摇晃一次，70℃温育30min间隔10min轻柔摇晃一次。冷却至室温，再加入700μl体积比为25:24:1的tris饱和酚:氯仿:异戊醇，反复颠倒混匀后轻轻摇动40次左右。在3100rpm，室温离心15min。吸取上清约500μl，加入等体积的24:1的氯仿:异戊醇。摇匀后在3100rpm，室温离心15min。弃上清加入冰冻的-20℃无水乙醇1ml在-20℃冰浴30min后，12000rpm，室温离心10min。用75％的酒精泡洗并反复吹打沉淀3min去盐。倒掉酒精，风干后每个样品加30-50μlddh2o溶解。抽提的甘蓝型油菜基因组dna，用nanodrop微量核酸检测仪检测浓度。[0074]b.阳性转基因植株检测[0075]取转化植株幼嫩叶片，采用ctab法进行dna的提取，用pcr扩增载体上的link片段，所用的引物为:link-ovlapf(5’‑aaccttacgtacgcgtgcac-3’)和link-salr(5’‑acgcgtcgaccactgaattgaattgtttaagg-3’)对照为非转基因的野生型植株(wt)。[0076]检测结果表明(见图3)，6、7、8、9、11、12、13、14、15、17、18、19、20、21这7个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带(750bp)，而野生型对照则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有外源干扰基因dna片段。[0077]实施例3[0078]ss.oah.rnai转基因油菜抗菌核病的评价：[0079](1)ss.oah.rnai转基因株系对核盘菌的免疫反应[0080]对油菜幼苗(四叶一心期时)倒二叶进行接种核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)，核盘菌菌株由华中农业大学生命科学学院实验室保存，经实验室活化的离体接种处理，取野生型转基因阳性株系的倒二叶，叶片剪下置于透明的方形盒中，每个转基因植株叶片与非转基因对照并排置于一个盒中，叶片下铺几层滤纸片和湿纱布，取新鲜制备的4-6mm菌丝块，有菌丝的面朝下，接种于叶片中部稍稍偏离主脉的位置，每叶接种两个菌丝块。盖上盖子保湿，然后置22℃黑暗培养。从接种0h到72h持续对叶片进行观察，发现核盘菌病斑在ss.oah.rnai转基因株系中的生长面积要比非转基因株系中小很多，损伤组织的面积也要小，以接菌后36h抗性差异最为显著(图4中的a图)；相比于野生型，转基因油菜叶片菌核病病斑显著减少(图4中的b图)。因此，干扰oah基因表达能有效增强油菜叶片对菌核病的抗性。[0081](2)接菌后油菜叶片病斑部位核盘菌菌丝rna的提取[0082]利用fungaltotalrnaisolationkit真菌总rna提取试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，抽提步骤(1)中核盘菌处理36h后叶片的总rna。并利用iiqrtsupermixforqrna(+gdnawiper)试剂盒(购自vazyme公司，中国)将rna反转录成cdna[0083](3)qpcr检测靶基因表达情况[0084]qpcr使用greenrealtimepcrmastermix-plus-试剂盒，使用primerpremier5.0软件该基因的编码区设计特异性引物，并应用primer-blast(ncbi)在基因数据库进行引物特异性比对分析，以验证引物的特异性。[0085]ss.oah基因的qpcr引物为：[0086]q-ssoah-f：gcacaagagatgggattccg[0087]q-ssoah-r：taaacaccatcggcgaaagc[0088]qpcr反应体系为20μl：含有sybrmix10μl，正反向引物(10μmol/l)各0.8μl，模板2μl和depc处理过的无菌水。扩增条件为：95℃，30sec；95℃5sec，60℃30sec，72℃27sec，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。用引物对q-ssoah-f、q-ssoah-r基因进行特异性的pcr扩增。同时用引物对ssactin-f2/r2对核盘菌ssactin基因的特异扩增作为内参，以作为内对照进行相对定量分析。检测上述抗病相关基因在核盘菌诱导36h后油菜叶片中的表达变化。[0089]结果显示，与wt相比，转基因油菜株系叶片病斑的菌丝体内oah基因的表达量均发生下降。r25株系病斑上菌丝体内的oah基因表达量在接菌60h时显著降低；r18株系在接菌36h时，靶基因表达量显著下降，接菌48h时表达量开始上调，72h时达到峰值；r36株系在接菌24h时，核盘菌菌丝体内oah的表达量达到峰值，之后开始逐渐下降，接菌60h时，oah的表达量下调显著(见图5)。以上结果表明：ss.oah.rnai转基因株系降低了核盘菌菌丝内oah基因的表达。[0090](4)体外抗真菌检测[0091]同步骤(1)中的核盘菌离体接种方法，取新鲜叶片5g用液氮研磨成粉末，加入30ml提取buffer混匀，室温10,000×g离心10min。然后吸取上清于干净的50ml离心管中，4℃保存备用。以50％(v/v)的比例加入pda培养基中。将核盘菌菌块接种于萃取了wt和转基因材料液体的pda培养基上，23℃暗培养40h，计算其菌丝扩展面积，体式显微镜下观察空白对照培养基、添加了野生型(wt)和转基因材料萃取液的培养基的菌丝的生长状态和扩展情况。进一步将其培养的核盘菌菌丝块接种于野生型甘蓝型油菜上，观察统计接菌36h和48h后的病斑情况。结果显示：转基因材料制成的pda菌丝扩展面积明显小于野生型，且菌丝生长状态与野生型相比，扩展长度较短，菌丝分支少，菌丝生长异常。[0092]与接种了野生型油菜提取液培养的菌丝相比，接种了转基因材料提取液培养的核盘菌菌丝在侵染野生型油菜36h和48h后，病斑面积小于野生型。表明：干扰草酸合成影响了核盘菌菌丝的生长和扩展，进一步表明菌丝生长是由于转基因材料体内rnai的干扰了影响了病原菌体内oa的合成。[0093]以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。[0094]所涉及到的序列表如下所示：[0095][0096][0097][0098][0099][0100][0101][0102][0103][0104][0105][0106]当前第1页12当前第1页12