一种重组III型胶原蛋白及其制备方法与流程

一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法
技术领域
1.本技术属于生物技术领域，具体地，本技术涉及一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25%~30%，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。因其具有良好的生物相容性、可生物降解性、低免疫原性以及生物活性（例如，可促进细胞增殖、分化、迁移，用于修复和止血），被广泛应用于化妆品、食品、医药、组织工程等领域。
3.目前主流的胶原蛋白制备方法包括动物源提取法和基因工程法两大类，动物源胶原蛋白的提取主要通过酸法和酶法进行产业化制备，成本相对更低，但存在动物源疾病感染、异源胶原蛋白可能导致免疫排斥或过敏反应、产能限制等问题。基因工程技术生产重组胶原蛋白组分单一、安全性高、生产过程可控。鉴于胶原蛋白具有广阔的应用前景，特别是在高端医用材料、保健品等领域对优质胶原蛋白的大量需求，利用基因工程技术重组表达胶原蛋白成为一个极具意义的研究方向。
4.基因工程涉及大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因作物等不同表达体系，哺乳动物细胞、昆虫细胞等表达体系成本高、周期长，难以满足产业化需求，相比之下，微生物发酵生产重组胶原蛋白成本低、周期短、培养较容易，更易于商业化生产。
5.细菌表达系统普遍存在诸如：产生的致热原致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白以包涵体形式表达，致使产物纯化困难；原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点，采用巴氏毕赤酵母（pichia pastoris）表达系统，可避免这些缺点，并能对翻译的蛋白质进行一定的翻译后修饰(包括二硫键形成和糖基化等)，有力支撑蛋白质生物学功能的实现。以巴氏毕赤酵母建立表达系统具有微生物表达系统可高密度发酵生产、培养成本低、蛋白表达水平高等规模化工业生产的优点，且其可分泌于胞外，避免了菌体裂解过程带来的杂质蛋白，同时，其细胞壁成分中不含内毒素、肽聚糖。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述问题，本技术利用基因工程技术重组表达一种新的iii型胶原蛋白，其可避免病毒隐患以及排异反应，且分子量确定，生产过程条件温和，利于保持蛋白的生物活性。同时，本技术提供了该重组iii型胶原蛋白的制备方法。
7.具体来说，本技术涉及以下方面：1.一种重组iii型胶原蛋白，其特征在于，所述重组iii型胶原蛋白为如下a1）-a3）中的任一种：a1）seq id no. 1、seq id no. 2或seq id no. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2）将a1）所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或
添加得到的与所述重组iii型胶原蛋白相关的蛋白质；a3）与a1）或a2）具有85％以上同一性且与所述重组iii型胶原蛋白相关的蛋白质。
8.2. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码项1所述的重组iii型胶原蛋白。
9.3. 根据项2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下c1）或c2）中的任一种：c1）核苷酸序列为seq id no. 4、seq id no. 5或seq id no. 6的dna分子；c2）将seq id no. 4、seq id no. 5或seq id no. 6所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1）所示的dna分子具有85％以上的同一性，且具有相同功能的dna分子。
10.4. 一种载体，其中，所述载体包含项3所述的核酸分子。
11.5. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含项1所述的胶原蛋白或项2所述的核酸分子或项4所述的载体。
12.6. 根据项5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
13.7. 根据项6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。
14.8. 一种制备项1所述的重组iii型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用项5-7中任一项所述的宿主细胞表达所述重组iii型胶原蛋白，然后进行分离纯化得到。
15.9. 根据项1所述的重组iii型胶原蛋白，或根据项2或3所述的核酸分子编码的重组iii型胶原蛋白，或由根据项5-7中任一项所述的宿主细胞产生的重组iii型胶原蛋白在制备食品、化妆品、保健品或药械产品中的应用。
16.10. 一种组合物，其特征在于，所述组合物包括根据项1所述的重组iii型胶原蛋白，或根据项2或3所述的核酸分子编码的重组iii型胶原蛋白，或由根据项5-7中任一项所述的宿主细胞产生的重组胶原蛋白。
17.11. 根据项10的组合物，其用作食品、化妆品、保健品或药械产品。
18.本技术为尽可能提高巴氏毕赤酵母的表达水平，采用以下策略：1)将编码重组iii型胶原蛋白的各种氨基酸的密码子完全优化为巴氏毕赤酵母的偏好密码子以利于重组iii型胶原蛋白的表达；2）对高密度发酵条件及工艺进行优化，发掘其高表达潜力。
19.有益效果本技术将重组iii型胶原蛋白的活性氨基酸序列进行拼接，并根据巴氏毕赤酵母表达异源蛋白的密码子偏好性对相应的碱基序列进行密码子优化。通过菌株筛选及参数优化后，发酵液上清总蛋白浓度较优化前提高50%。
20.本技术采用的巴氏毕赤酵母表达系统，不含有内毒素，生产成本低，蛋白表达量较高。其生产的重组iii型胶原蛋白的氨基酸组成与天然胶原蛋白α1链一致，应用于人体不会产生免疫排斥，可以广泛应用于食品、化妆品、保健品和药械产品领域，并进行工业化大规模生产。与市售的胶原蛋白产品相比，其细胞增值、迁移等功效更好。
附图说明
21.图1是实施例2 中重组表达载体ppic9k-col的质粒图谱。
22.图2是实施例5 中重组iii型胶原蛋白发酵上清液sds-page电泳图。
23.图3是实施例6中胶原蛋白促细胞增殖的结果图。不同字母“a”、“b”、“c”、“d”代表数据间具有显著性差异，p《0.05。
24.图4是实施例7中胶原蛋白细胞迁移的结果图。
25.图5是实施例7中胶原蛋白细胞迁移率的结果图。不同字母“a”、“b”、“c”、“d”、“e”代表数据间具有显著性差异，p《0.05。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例来详细说明本技术。应理解，以下实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。
27.尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
28.本文描述或引用的技术和程序是本领域技术人员通常熟知的且经常使用的常规方法。
29.本技术一方面提供了一种重组iii型胶原蛋白。
30.在一个具体的实施方案中，所述重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no. 1所示。
31.在一个具体的实施方案中，所述重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no. 2所示。
32.在一个具体的实施方案中，所述重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no. 3所示。
33.在上述具体实施方案中，重组蛋白是指利用重组dna或重组rna技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子，而获得的蛋白质。体外重组蛋白的表达系统主要包括以下几种: 1.原核细胞表达系统，例如大肠杆菌；真核细胞表达系统，如酵母；哺乳动物细胞表达系统，例如细胞cho，hek293；及昆虫细胞表达系统。氨基酸序列是指氨基酸相互连接形成肽链（或多肽）的顺序。根据氨基酸的结构和它们连接在一起的方式，氨基酸序列只能按照一个方向读取，并且以特定形式形成肽。所有氨基酸都具有一个常规结构，包含一个碳，和分别位于两侧的一个氨基nh3及羧基cooh。一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基之间形成肽键，形成氨基酸序列。重组胶原蛋白是指通过基因重组技术制备的胶原蛋白，其中通常将编码胶原蛋白的dna或rna插入合适的表达载体中，转化进入宿主细胞中表达的胶原蛋白分子。将dna或rna通过同源重组或本领域公知的其它方式插入宿主染色体，并因此用于转化宿主细胞以产生蛋白质。人体胶原蛋白根据组织部位、生理功能、分子结构不同而分为28种以上胶原蛋白，研究多的为i型、ii型和iii型胶原蛋白。其中i 型胶原和 iii 型胶原是皮肤中含量最多的2种胶原成分。i型胶原呈条束状，支撑皮肤结构，保持皮肤韧性；而iii型胶原更像是细密的网状，散布在i型周围，紧紧网住真皮细胞与水分，决定着皮肤的弹性
和嫩滑度。i型和iii型胶原蛋白主要存在皮肤、肌腱、韧带、血管等结缔组织，构成细胞外基质网状结构，起到支撑器官、保护机体的作用，还与细胞附着、细胞迁移有关。市售胶原蛋白99%是从猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮、鱼鳞等动物组织中提取的动物源胶原蛋白，对比人胶原蛋白在基因序列上存在根本性差异，属于非同源物质。进入人体后会被皮肤的免疫层所阻隔，无法深入到肌底层、真皮层。上述重组iii型胶原蛋白的基因序列与人iii型胶原蛋白基因序列高度一致，组织相容性好。
34.本技术另一方面提供了一种核酸分子。
35.在一个具体的实施方案中，所述核酸分子编码重组iii型胶原蛋白。所述核酸分子的序列如seq id no. 4所示。
36.在一个具体的实施方案中，所述核酸分子编码重组iii型胶原蛋白。所述核酸分子的序列如seq id no. 5所示。
37.在一个具体的实施方案中，所述核酸分子编码重组iii型胶原蛋白。所述核酸分子的序列如seq id no. 6所示。
38.在上述具体实施方案中，核酸分子是脱氧核糖核酸（dna）和核糖核酸（rna）的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核苷酸序列指的是 dna或rna中碱基的排列顺序。核酸分子含有cdna，在一些情况下，可以修饰核酸分子以用于本技术载体中，如用于密码子优化。在一些情况下，出于克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。核酸分子可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应（pcr）扩增获得。
39.本技术另一方面提供了一种载体，所述载体包含上述的核酸分子。
40.在一个具体的实施方案中，载体是指在基因工程重组dna技术中将dna片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的dna分子。在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分:遗传标记基因，复制区，目的基因。除常用的大肠杆菌质粒载体外，还发展了许多人工构建的其它适用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端（例如环状）的核酸分子；包含dna，rna或两者的核酸分子；以及本领域已知的其它多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外dna片段的环状双链dna环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体）。其它载体（例如，非游离型哺乳动物载体）在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导目的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。所述载体为重组表达载体ppic9k-col1、ppic9k-col2、ppic9k-col3。
41.本技术另一方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述载体。
42.在一个具体的实施方案中，宿主细胞是指任何细胞类型，其易受包含本技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等。“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程发生突变与亲本细胞不完全相同。宿主细胞可以是在本技术的重组人
源化胶原蛋白生产中有用的任何细胞。为了产生重组胶原蛋白，可以将编码重组胶原蛋白的核酸分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。可以使用常规技术（例如，通过使用能够与编码重组胶原蛋白的基因特异性结合的寡核苷酸探针）容易地分离和测序这种核酸。所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。对于载体导入宿主细胞中的方法是公知的，例如使用电转化将载体导入宿主细胞中，所述方法还可以是转染、微注射技术、基因枪技术、脂质体介导法等。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种。优选地，所述原核细胞为大肠杆菌；优选地，所述真核细胞为巴氏毕赤酵母。
43.本技术另一方面提供了一种制备重组iii型胶原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：利用上述的宿主细胞表达所述重组iii型胶原蛋白，然后进行分离纯化得到。
44.在一个具体的实施方案中，所述利用宿主细胞表达指的是将宿主细胞进行培养，培养基和培养条件对于本领域技术人员来说是公知的。对于表达方式，本技术不作任何限制，其可以根据需要进行确认，例如表达方式为诱导表达。所述分离纯化的方法包括盐析法、超滤法、亲和层析法、凝胶过滤层析法、色谱层析法、酸碱沉淀法和膜分离法，优选为超滤法。
45.本技术另一方面提供了上述重组iii型胶原蛋白，或上述核酸分子编码的重组iii型胶原蛋白，或上述宿主细胞产生的重组iii型胶原蛋白在制备食品、化妆品、保健品或药械产品中的应用。
46.本技术另一方面提供了一种组合物。所述组合物包括上述的重组iii型胶原蛋白，或上述的核酸分子编码的重组iii型胶原蛋白，或上述的宿主细胞产生的重组胶原蛋白。
47.在一个具体的实施方案中，组合物用作食品、化妆品、保健品或药械产品。
48.本说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且落入所附权利要求的范围内。
49.实施例1：重组iii型胶原蛋白的序列设计利用ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站获取天然人iii型胶原蛋白α1链蛋白（参考序列号np_000081），根据优选人iii型胶原蛋白成熟肽的有效序列，进行功能片段组合及等电点，蛋白稳定性等理化性质优化，设计出3条iii型胶原蛋白序列col1、col2、col3，具体序列详见序列表中的seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3。
50.实施例2：重组iii型胶原蛋白的基因合成按照巴氏毕赤酵母表达异源蛋白的密码子偏好性，设计并人工全基因合成3条iii型胶原蛋白的核苷酸序列并亚克隆至ppic9k质粒上，具体序列详见序列表中的seq id no. 4、seq id no. 5、seq id no. 6。全基因合成由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成，重组质粒载体命名为ppic9k-col1、ppic9k-col2、ppic9k-col3（图1）。
51.实施例3：巴氏毕赤酵母电转化首先对ppic9k-col1、ppic9k-col2、ppic9k-col3重组质粒进行sac i（购于thermo fisher公司）线性化，反应体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应2 h，终止反应前，先取出5 μl，在质量百分浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测是否酶切完全。之后，用dna纯化试剂盒对线性化的ppic9k-col1、ppic9k-col2、ppic9k-col3质粒进行回收。
52.分别将5 μg经sac i内切酶线性化的ppic9k-col1、ppic9k-col2、ppic9k-col3质粒，与100 μl巴氏毕赤酵母感受态细胞混匀，转至电极间距0.2 cm的冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1 ml冰预冷的1 m的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布于md（minimal dextrase；1 l md含有ynb 13.4 g，生物素 0.2 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 20 g）培养基平板，30℃倒置培养2～3天，待md培养基平板上长出菌落。
53.实施例4：多拷贝插入重组子的筛选将md培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到g418浓度分别为0.5 g/l、1 g/l、2 g/l的ypd（酵母浸出粉胨葡萄糖；1 l中含有酵母提取物 10 g，胰蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 20 g）培养基平板上，30℃培养，通过高浓度抗生素培养筛选来获得转化子。毕赤酵母转化子若能在含高浓度g418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了巴氏毕赤酵母体内并通过同源重组整合至其染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组巴氏毕赤酵母工程菌种。
54.实施例5：重组iii型胶原蛋白的发酵将筛选到的转化子接种于50 ml ypd培养基中，30℃，200 rpm，振荡培养24 h，作为一级种子转接于280 ml ypd培养基中，30℃，200 rpm，培养24 h，作为二级种子转接入装有3.5 l的主发酵基础盐（1 l中含甘油40 g、k2so
4 18.2 g、h3po
4 26.7 ml、caso4·
2h2o 0.93 g、mgso
4 14.9 g、koh 4.13 g混合制成）培养基的10 l罐发酵。发酵过程中，生长温度26℃，ph值为5.3，溶氧控制在20％左右，当溶氧陡然上升时，表明基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始速率为15 ml/l/h流加质量百分浓度为50%的甘油，在质量百分浓度为50％甘油中含10 ml/l微量元素ptm1 (1 l中含cuso4·
5h2o 6 g、nai 0.08 g、mnso4·
h2o 3 g、na2moo4·
h2o 0.2 g、h3bo
3 0.02 g、h2so
4 5 ml、cocl2·
6h2o 0.5 g、zncl
2 20 g、feso4·
7h2o 75 g、生物素0.2 g，混合制成)，溶氧维持在15％～20％。发酵液的湿菌重达到180-200 mg/ml时，停止补料，饥饿1 h，甘油耗尽，流加甲醇诱导发酵，甲醇中含10 ml/l ptm1微量元素，以速率为2 ml/l/h流加2～3 h，然后提高速率至10.9 ml/l/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于15％，诱导发酵96 h，发酵液上清电泳结果见图2，泳道m为蛋白marker，其余泳道分别为col1、col2和col3。
55.实施例6：重组iii型胶原蛋白促细胞增殖/细胞毒性实验取对数生长期balb/c3t3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）（购自中国科学院上海细胞
库），以1
×
105个/ml密度接种于96孔板，每孔100
ꢀµ
l，分为对照组和实验组。置于二氧化碳细胞培养箱，37℃、5% co2常规培养24 h。用无血清培养液（购自江苏凯基生物技术股份有限公司）配制三种重组iii型胶原蛋白样品（col1、col2、col3）溶液、鱼胶原和市售重组胶原，每种溶液浓度为400 μg/ml，并将溶液用0.22
ꢀµ
m滤膜过滤除菌。balb/c3t3细胞常规培养24 h后，弃去旧培养液，加入100 μl无血清培养液或100 μl重组iii型胶原蛋白样品溶液，对照组为加入等量无血清培养液，实验组为加入100 μl重组iii型胶原蛋白样品溶液，每组3个平行样。继续培养24 h后，弃去培养液，每孔加入100 μl用无血清培养液稀释10倍的cck-8（购自生工生物工程(上海)股份有限公司中），放入细胞培养箱中继续孵育2 h。采用cck-8法检测细胞相对增殖率，于450 nm波长处用酶标仪测定吸光度。计算细胞相对增殖率（rgr）%=实验组吸光度值/正常对照组吸光度值
×
100%。
56.如图3所示，本实施例中，重组iii型胶原蛋白col1、col2、col3、鱼胶原以及市售重组胶原作用于balb/c3t3细胞24 h，在胶原蛋白浓度为400 μg/ml时，col1、col3、鱼胶原和市售重组胶原的促细胞相对增值率均显著高于对照组，分别提高了20.7%、24.3%、11.2%以及19.7%。此外，col1的促细胞相对增值率显著高于鱼胶原，col3的促细胞相对增值率显著高于鱼胶原和市售重组胶原。col2的促细胞增殖能力与对照组无显著性差异。
57.实施例7：划痕法检测重组胶原蛋白细胞迁移活性取处于对数生长期的hacat细胞（购自中国科学院上海细胞库）作为样品，常规消化后以3
×
105个/ml的密度接种于24孔板中的ibidi小室。小室的左、右两孔各加入70 μl细胞悬液，小室外补充400 μl无血清培养液（购自江苏凯基生物技术股份有限公司）。放置于37℃、5% 的 co2培养箱培养24 h。取出ibidi小室，拍照，弃去培养液，加入1 ml配制好的400 μg/ml重组iii型胶原蛋白col1、col2、col3、鱼胶原和市售重组胶原的溶液，对照组加入1 ml的无血清培养液。继续培养24 h后观察并拍照。使用image j软件（https://imagej.nih.gov/ij）对细胞迁移的图片进行处理，分析细胞划痕区域的愈合率。获得初始划痕面积和无细胞空白区域面积数据，计算迁移率，细胞迁移率（%）=（1-划痕区域面积/初始划痕区域面积）
×
100%。
58.体外细胞迁移实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，直接反映了细胞与胞外基质及基质影响下细胞之间的相互作用。细胞迁移活性是更有效表征胶原蛋白生物学活性的指标，迁移率越高，速度越快，说明胶原蛋白的生物学活性越佳。结果如图4所示，24 h拍摄的细胞迁移实际对比图 (两黑色线内为初始及细胞迁移后划痕伤口区域)及图5所示的计算出的细胞相对迁移率比较可知，col1、col2、col3迁移率均显著高于对照组，其中细胞迁移率col3为对照组的3.6倍，col1为对照组的3.04倍，col2为对照组的2.49倍，因此，col1、col2、col3均具有较强的细胞迁移活性。与鱼胶原和市售重组胶原相比，col3和col1的细胞相对迁移率均显著高于鱼胶原和市售胶原。
59.序列表：