两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒的制作方法

两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状rna标志物的应用及诊断试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状rna标志物的应用及诊断试剂盒。


背景技术：

2.在世卫组织2020年的统计中，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,npc)虽然不是患病率和致死率排名前几位，但全球将近一半的新发病例数和死亡病例数在我国，这需要我国医学研究者引起重视。早发现早治疗是鼻咽癌预后的关键因素。现有的npc检测方法有eb病毒抗体检测、dna定量、影像学检查和病理组织活检。eb病毒抗体和dna定量检测有安全、简便、快速、成本低和易推广等优点，但灵敏度和特异度较低，漏诊率高，对于早期npc诊断临床多采用两种及多种检测相结合；影像学检查直观，但不适用于早期检测且费用高；病理组织活检是npc诊断的金标准，但有创且因取材问题依旧容易导致漏诊，难以发现早期npc。因此，更为有效的npc早期诊断标志物有待深入研究。


技术实现要素：

3.本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状rna标志物的应用及诊断试剂盒，有利于快速简便诊断早期鼻咽癌，降低癌症死亡率。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5.发明人对鼻咽癌患者血清及组织进行高通量测序和基因芯片检测，通过对比分析对照组、早期鼻咽癌和晚期鼻咽癌血清与组织中环状rna表达情况，从中筛选出在早期鼻咽癌血清和组织中均存在特异表达的标志物hsa_circ_0006220和hsa_circ_0001666，经过反复筛选，设计成本发明的引物对，以f为上游引物，r为下游引物，所形成的产物必须跨过剪接位点以确保环状结构。
6.环状rna hsa_circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断标志物在制备快速鉴别早期鼻咽癌的产品中的应用，所述环状rna hsa_circ_0006220具有如seq id no：1所示的序列，所述环状hsa_circ_0001666具有如seq id no：2所示的序列。
7.本发明中，对于环状rna hsa_circ_0006220的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0006220的pcr引物对和内参基因β-actin特异性引物，所述pcr引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示：tctgtttgcatctaccctgct，下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示：cacactcctccttggtcttgg；所述内参基因β-actin引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。
8.本发明中，对于环状rnahsa_circ_0001666的应用，所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0001666的pcr引物对和内参基因β-actin特异性引物，所述pcr引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示：ctgcctagctgtcaaggagtgg，下游引物的核苷酸序列如seq id no：8所示：tccgggaaaggatctggaatg；所述内参基因β-actin引物对中，上游引物的
核苷酸序列如seq id no：5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。
9.本发明中，优选地，所述的产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。
10.本发明中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0006220或hsa_circ_0001666的方法包括以下步骤：
11.1)从待测血清样品中提取rna，得到rna样品；
12.2)向提取出的rna样品先去除基因组dna反应后加入反转录酶，将rna反转录成cdna；
13.3)向步骤2)所得cdna中加入pcr引物对f/r和饱和荧光染料，在特定条件下进行pcr扩增反应，得到扩增产物；
14.4)对步骤3)所得扩增产物通过熔解曲线分析确定扩增产物的特性排除引物二聚体，每个样本设置3个复孔，设置固定阈值记录ct值，取3次pcr结果计算平均ct值，采用相对定量法计算各样本的表达水平。
15.上述定量检测方法中，优选地，所述步骤2)中逆转录体系如下：primescript rt enzyme mix i 1.0μl，rt primer mix 1.0μl，5
×
primescript buffer 2for real time 4.0μl，rnase free dh2o 4.0μl；逆转录反应程序为：37℃15min，85℃5sec。
16.上述定量检测方法中，优选地，所述步骤3)中pcr扩增反应体系如下：tb geen premix ex taq
tmⅱ(ti rnaseh plus)10μl,cdna模板2μl，10μm上下游引物各0.8μl，ddh2o6μl,rox 0.4μl；pcr扩增反应的程序为：95℃预变性30sec,95℃5sec,60℃34sec,共40个循环，在60℃时采集荧光信号。
17.快速鉴定早期鼻咽癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0006220的pcr引物对和/或定量检测hsa_circ_0001666的pcr引物对。
18.上述试剂盒中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0006220的pcr引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示：tctgtttgcatctaccctgct，下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示：cacactcctccttggtcttgg。
19.上述试剂盒中，优选地，所述定量检测hsa_circ_0001666的pcr引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示：ctgcctagctgtcaaggagtgg，下游引物的核苷酸序列如seq id no：8所示：tccgggaaaggatctggaatg。
20.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
21.1、本发明结合qrt-pcr与液体活检技术，筛选早期鼻咽癌患者血清中差异表达的circrnas，通过反复筛选，最后找到两个有差异的特异基因位点，通过qrt-pcr扩增得到血清中circrnas的表达量。
22.2、本发明qrt-pcr操作简单，全程只需2h，极大地缩短了分析时间，荧光饱和染料廉价易得，试验方法特异性好、重复性好、可以准确、快速、高通量地运用于早期鼻咽癌的筛查，为快速临床诊断提供依据。
附图说明
23.图1为本发明提供的hsa_circ_0006220在健康人和鼻咽癌患者血清中的扩增曲线对数图；
24.图2为本发明提供的hsa_circ_0001666在健康人和鼻咽癌患者血清中的扩增曲线
对数图；
25.图3为本发明提供的hsa_circ_0006220熔解曲线；
26.图4为本发明提供的hsa_circ_0001666熔解曲线；
27.图5为本发明提供的hsa_circ_0006220诊断早期鼻咽癌患者的roc曲线；
28.图6为本发明提供的hsa_circ_0001666诊断早期鼻咽癌患者的roc曲线。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通过市售获得。
30.本发明根据血清基因芯片和组织测序结果确定候选诊断标志物hsa_circ_0006220及hsa_circ_0001666，环状rna hsa_circ_0006220具有如seq id no：1所示的序列，环状hsa_circ_0001666具有如seq id no：2所示的序列。
31.本发明通过反复筛选，选出特异性强的引物及探针，其核苷酸序列如下所示：
32.hsa_circ_0006220f:tctgtttgcatctaccctgct(seq id no：3)
33.r:cacactcctccttggtcttgg(seq id no：4)
34.β-actin(human)f:tcaccaactgggacgacatg(seq id no：5)
35.r:gtcaccggagtccatcacgat(seq id no：6)
36.hsa_circ_0001666f:ctgcctagctgtcaaggagtgg(seq id no：7)
37.r:tccgggaaaggatctggaatg(seq id no：8)
38.发明人通过反复筛选设计的以上引物对，以f为上游引物，r为下游引物，引物包含鼻咽癌患者血清中差异表达的特异基因位点，对其他基因无扩增性。有利于临床上对早期鼻咽癌的特异性筛查。
39.实施例1
40.快速鉴别早期鼻咽癌的试剂盒，通过检测hsa_circ_0006220的表达量来鉴别早期鼻咽癌，包括：
41.定量检测hsa_circ_0006220的pcr引物对，上游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示：tctgtttgcatctaccctgct，下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示：cacactcctccttggtcttgg。
42.β-actin(human)内参特异性引物对，上游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示：tcaccaactgggacgacatg，下游引物的核苷酸序列如seq id no：6所示：gtcaccggagtccatcacgat。
43.实施例2
44.快速鉴别早期鼻咽癌的试剂盒，通过检测hsa_circ_0001666的表达量来鉴别早期鼻咽癌，包括：
45.定量检测hsa_circ_0001666的pcr引物对所述pcr引物对中，上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示：ctgcctagctgtcaaggagtgg，下游引物的核苷酸序列如seq id no：8
所示：tccgggaaaggatctggaatg。
46.β-actin(human)内参特异性引物对，上游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示：tcaccaactgggacgacatg，下游引物的核苷酸序列如seq id no：6所示：gtcaccggagtccatcacgat。
47.实施例3
48.快速鉴别早期鼻咽癌的试剂盒，同时包括实施例1和实施例2的试剂盒。
49.实施例4目的环状rna表达量的检测
50.1)从待测血清样品中提取rna，得到rna样品
51.a.从-80℃冰箱取出血清于4℃冰箱解冻，待血清融化成液体后放置在低温离心机中离心，离心条件12000g，4℃，10min。用移液器小心吸取250μl血清至无dnase/rnase的1.5ml ep管中，放冰盒中待用。
52.b.每250μl血清加入750μl trizol ls，用移液枪吹打混匀，再额外加入20μl冰乙酸，颠倒混合，室温静置5min彻底分离核蛋白复合物。
53.c.每750μl trizol ls中加入200μl氯仿，盖好样品盖，双手大力摇管20s，室温孵育2-3min。然后将ep管低温离心，离心条件12000g，4℃,15min，离心后混合物分为红色酚-氯仿相、中间相和上层无色水相，小心转移含rna的水相于另一个干净的ep管中(吸取400μl-500μl水相，避免吸到其他相)。
54.d.每400μl-500μl水相加入500μl异丙醇(异丙醇在实验开始时可放4℃冰箱中预冷待用)，由于血清rna较少，可在此步骤加入3-5μl糖原，增加核酸提取产出。盖好样品盖，混匀后将其存放在4℃冰箱中静置30min-60min。静置结束后，12000g，4℃,离心10min，试管底部可见白色rna沉淀，弃上清。
55.e.按750μl trizol ls加入1ml 75％乙醇(无水乙醇与depc水按3:1比例，现配现用)洗涤沉淀，轻柔颠倒混匀待沉淀漂浮起来，7500g，4℃，离心5min。弃上清后，再用迷你离心机离心数秒，移液器吸出残留液体。
56.f.风干rna沉淀，每管加入10μl depc水吹打溶解核酸沉淀，放冰上助融备用(若不继续实验，可将rna放-80℃冰箱中保存)。
57.2)向提取出的rna样品先去除基因组dna反应，然后加入反转录酶，将rna反转录成cdna；逆转录体系如下：primescript rt enzyme mix i 1.0μl，rt primer mix 1.0μl，5
×
primescript buffer 2(for real time)4.0μl，rnase free dh2o 4.0μl。
58.逆转录反应程序：37℃15min，85℃5sec。
59.3)向步骤2)所得cdna中加入pcr引物对f/r和饱和荧光染料，β-actin为内参，在特定条件下进行pcr扩增反应，得到扩增产物；pcr扩增反应体系如下：tb geen premix ex taq
tmⅱ(ti rnaseh plus)10μl,cdna模板2μl，10μm上下游引物各0.8μl，ddh2o 6μl,rox 0.4μl；
60.pcr扩增反应的程序为：95℃预变性30sec,95℃5sec,60℃34sec,共40个循环，在60℃时采集荧光信号。
61.4)表达水平的计算
62.对步骤3)所得扩增产物，通过熔解曲线分析确定扩增产物的特性，排除引物二聚体，每个样本设置3个复孔，设置固定阈值记录ct值，取3次pcr结果计算平均ct值，采用相对
定量法计算各样本的表达水平。采用相对定量法，计算环状rna的表达量f，公式如下：
63.f＝2-δδct
64.式中，
△△
ct＝(待测样本中目的环状rna的ct的平均值-待测样本中内参的ct的平均值)-(对照样本中目的环状rna的ct的平均值-对照样本中内参的ct的平均值)。
65.本实施例选取早期鼻咽癌患者35例，临床诊断无任何异常的正常人25例，2018年9月～2021年4月于柳州市人民医院、广西医科大学第一附属医院、柳州市中医医院确诊治疗，临床资料从病历获得。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。取受试人员外周血3ml，于-80℃冷藏保存。
66.采用实施例1和实施例2的试剂盒，分别按照实施例4中步骤1)～步骤4)对35例患者、和正常人血液样本进行分析，每个血液样本均分别检测分析hsa_circ_0006220及hsa_circ_0001666的表达量，检测结果参见图1-5：
67.从图1和2可以看出，hsa_circ_0006220及hsa_circ_0001666在早期npc患者血清中表达水平显著高于健康对照组，且扩增和熔解曲线良好(见图3和图4)，无非特异性产物。经比较，血清中hsa_circ_0006220和hsa_circ_0001666的表达水平在早期npc患者和健康对照人群中具有显著差异(p＜0.0001)，早期npc患者血清中两种circrnas的表达水平显著高于健康对照人群，且具有统计学差异，提示hsa_circ_0006220及hsa_circ_0001666的表达与早期鼻咽癌有显著关联。
68.通过绘制roc曲线，发现hsa_circ_0006220对于早期鼻咽癌病人的敏感度为62.5％(95％ci为38.64％～81.52％)，特异性为97.3％(95％ci为86.18％～99.86％)，见图4。hsa_circ_0001666对于早期鼻咽癌病人的敏感度为86.67％(95％ci为62.12％～97.63％)，特异性为87.5％(95％ci为73.89％～94.54％)，见图5。
69.本发明的试剂盒在使用时，抽取受试者外周血2ml，按照实施例4的方法进行处理，利用本发明的试剂盒进行pcr反应。检测结果受试者hsa_circ_0006220和hsa_circ_0001666的表达水平。hsa_circ_0006220的cut-off值为1.578，hsa_circ_0001666的cut-off值为1.313，当大于cut-off值时发明人判定为早期鼻咽癌患者。
70.上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。