一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法

一种用于抑制薇甘菊生长发育的rnai分子制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物防控相关领域，尤其涉及一种用于抑制薇甘菊生长发育的rnai分子制备方法。


背景技术：

2.薇甘菊，又称小花蔓泽兰或小花假泽兰，是菊科、假泽兰属多年生草质或木质藤本植物，薇甘菊作为一种入侵性杂草，生长速度快，其根系具有节节生根的能力，繁殖能力极强，薇甘菊的入侵对当地的农业和林业生产造成了巨大的经济损失；
3.中国专利：cn202210230108.4一种抑制薇甘菊快速生长的生物方法，薇甘菊柄锈菌对非靶标生物的安全性测定；薇甘菊柄锈菌侵染过程的确定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊生长表型的测定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊激素合成的测定；薇甘菊柄锈菌抑制薇甘菊光合作用的测定。本发明通过对薇甘菊叶片净光合速率、气孔导度的测量和卡尔文循环途径相关代谢物的含量分析，发现薇甘菊柄锈菌侵染后可显著降低叶片的光合速率和气孔导度并抑制卡尔文循环途径相关化合物的含量，其中，净光合速率下降了10.57％，气孔导度降低26.03％，卡尔文循环途径相关化合物的含量降低1.9至3.4倍。
4.根据现有技术和上述专利进行分析，得出存在问题为：都并非直接抑制薇甘菊根系发育，而是采用侵染过程来抑制其进行生长，虽说存在一定的抑制效果，但是从根本上来说抑制效果较弱。


技术实现要素：

5.因此，为了解决上述不足，本发明提供一种用于抑制薇甘菊生长发育的rnai分子制备方法。
6.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种用于抑制薇甘菊生长发育的rnai分子制备方法，方法步骤如下：
7.s1薇甘菊根系发育基因的筛选；
8.采用文献收集整理方法，筛选出模式物种拟南芥中已明确基因atexpa4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除atexpa4基因使主根生长缓慢，利用比较基因组学的方法，通过blastp比对，以e-value值《e-5
为标准，筛选出关键候选基因，通过同源比对，鉴定关键候选基因的特异序列；
9.己功能验证基因：atexpa4；具有功能：敲除atexpa4基因使主根生长缓慢；blastp比对后筛选出的基因：mm14g033446；identity：84.49；e-value：1.39e-160
；
10.s2目的基因的克隆；
11.s3dsrna的制备。
12.优选的，所述s2目的基因的克隆步骤如下：
13.s2.1总rna提取，cdna第一条链合成：
14.采用福际试剂盒方法提取薇甘菊叶片总rna，通过紫外分光光度计检测样品rna纯
度，cdna的合成参照yesen公司的试剂盒说明书进行。
15.s2.2基因的克隆；
16.根据筛选出基因mm14g033446的序列，利用引物设计软件primer premier 5设计扩增正向引物(f)和反向引物(r)，对目的片段进行扩增，扩增体系为：模板cdna 1μl，引物f 0.5μl，引物r 0.5μl，2
×
hieff robust master mix 12.5μl，ddh2o 10.5μl，离心混匀后在pcr仪上进行扩增，94℃预变性5min，94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸10s，循环34次；72℃终延伸7min后放4℃保存备用；
17.制作1.5％的琼脂凝胶50ml，将pcr产物在凝胶中上样，用bio-red电泳仪检测(110v，45min)，在紫外成像仪下观察结果，然后进行切胶回收，用dna胶纯化回收试剂盒进行产物回收，得到目的片段；
18.用pucm-t vector克隆试剂盒将目的片段与载体连接，反应体系为：插入片段3μl，pucm-t vector 1μl，10
×
ligation buffer 1μl，50％peg 40001μl，t4dna ligase 1μl，sterilized ddh2o 3μl，将反应液置于16℃金属浴孵育6h后置于冰上冷却，将100μl dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上解冻后，加入上述10μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30min，将混合液在42℃水浴中热激90s，再冰上冷却5min，为使载体上的抗性复苏，向反应液中加入900μl不含抗生素的lb液体培养基，于37℃，200rpm/min摇床震荡培养1h，取出后4000rpm离心3min，吸除750μl上清液，将剩余反应液吹打混匀后涂布于含amp的lb固体培养基上，倒置暗培养12h后挑取阳性单菌落，用m13通用引物进行菌液pcr验证，然后将菌液送公司测序验证，将测序正确的菌液利用试剂盒提质粒后置于-20℃冰箱存放。
19.优选的，所述s3dsrna的制备步骤如下：
20.s3.1pcr扩增；
21.在上述克隆步骤中扩增目的片段引物的5’端加上t7启动子序列作dsrna合成的扩增引物，合成特异引物，以筛选出的质粒为模板进行pcr扩增，反应体系为：质粒2μl，primerf 5μl，primer r 5μl，2
×
hieffcanace gold pcr mix 50μl，ddh2o 38μl，离心混匀后在pcr仪上进行扩增，98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，循环34次；72℃终延伸5min；
22.s3.2pcr产物纯化；
23.s3.2.1pcr产物加水补足至500μl，加入等体积(500μl)酚氯仿异戊醇(25:24:1)，轻摇混匀并静置15min，后12000rpm离心15min；
24.s3.2.2取上清于另一rnase-free离心管中，加入2-3倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3m naac(ph＝5.2)；
25.s3.2.3将上述混合液置于-20℃冰箱内1h或以上；
26.s3.2.4在4℃低温高速离心机中12000rpm离心10min；
27.s3.2.5弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇，在4℃条件下12000rpm离心5min；
28.s3.2.6重复s3.2.5；
29.s3.2.7吸去上清，使酒精完全挥发，根据沉淀量加rnase-free water稀释；
30.s3.2.8取1μl pcr纯化产物加9μl ddh2o进行稀释，混匀离心，吸取1μl用紫外分光光度计nanophoto meter p330测浓度并记录；
31.s3.3dsrna转录；
32.以上述纯化产物为模板，在pcr管中进行转录，反应体系为：10
×
transcription buffer 2μl，ntp mix 8μl，t7 enzyme mix 2μl，模板cdna 2μg，ddh2o up to 20μl，瞬时离心后放置于pcr仪中37℃孵育3h，然后进行双酶消化，在反应液中添加rnase-free h2o 17μl，dnase i 1μl，rnase t1 2μl，瞬时离心后放置于pcr仪中37℃孵育30min，电泳检测转录产物；
33.s3.4 dsrna纯化
34.s3.4.1若上步中电泳检测条带正确且单一，则将孵育后的体系转入1.5ml rnase-free离心管中并加60μl nuclease-free water至总体系为100μl；
35.s3.4.2在体系中加入10μl 5m ammonium acetate(醋酸铵)并将其涡旋混匀；
36.s3.4.3在离心管中加入3倍体积(330μl)100％无水乙醇，涡旋混匀；
37.s3.4.4将混合液放置于-20℃冰箱内30min或以上；
38.s3.4.5在4℃低温高速离心机内12000rpm离心15min以上，使dsrna得以沉淀；
39.s3.4.6弃上清，加入1ml 75％乙醇溶液，并重复s3.4.5；
40.s3.4.7弃上清，待乙醇挥发完后根据沉淀量加入15-30μl depc水溶解沉淀；
41.s3.4.8吸取1μl涡旋混匀后的dsrna溶液，添加9μl depc水进行10倍稀释，使用紫外分光光度计nanophoto meter p330检测其浓度；
42.s3.4.9剩余已纯化的dsrna放于-20℃保存。
43.本发明的有益效果：
44.本发明通过采用rna干扰技术，rna干扰是植物在长期进化过程中形成的一种重要防御机制，利用rnai技术去抑制其根系发育可有效的控制薇甘菊的扩散，为生物防治实践中通过rna干扰技术抑制薇甘菊生长发育能力的靶向防控技术研究提供理论依据；通过筛选出拟南芥中已明确基因atexpa4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除atexpa4基因使主根生长缓慢。利用blastp比对，以e-value值《e-5
为标准，筛选出基因mm14g033446作为靶标，并设计了相应的rnai分子。
附图说明
45.图1是本发明目的基因的克隆与测序凝胶电泳示意图；
46.图2-图3是本发明菌样a1示意图；
47.图4是本发明菌样a2示意图；
48.图5是本发明菌样a3示意图；
49.图6是本发明菌样a4示意图；
50.图7是本发明dsrna的制备凝胶电泳示意图；
51.图8-图12是本发明抑制薇甘菊根系发育的实验水培示意图及根生长表型测定结果；
52.图13-图14是本发明抑制薇甘菊根系基因expa4在不同时间的qrt-pcr结果图。
具体实施方式
53.为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例进行详细阐述。
54.本发明提供一种用于抑制薇甘菊生长发育的rnai分子制备方法，
55.薇甘菊根系发育基因的筛选：
56.采用文献收集整理方法，筛选出模式物种拟南芥中已明确基因atexpa4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除atexpa4基因使主根生长缓慢。利用比较基因组学的方法，通过blastp比对，以e-value值《e-5为标准，筛选出关键候选基因。如下表：
[0057][0058]
目的基因的克隆(克隆测序)：
[0059]
总rna提取，cdna第一条链合成：
[0060]
本实验通过采用福际试剂盒方法提取薇甘菊叶片总rna，通过紫外分光光度计检测样品rna纯度。cdna的合成参照yesen公司的试剂盒说明书进行。
[0061]
目的基因的克隆：
[0062]
根据筛选出基因mm14g033446的序列，利用引物设计软件primer premier 5设计扩增引物f和r(附录表1)。对目的片段进行扩增，扩增体系为：模板cdna 1μl，引物f 0.5μl，引物r 0.5μl，2
×
hieff robust master mix 12.5μl，ddh2o 10.5μl。离心混匀后在pcr仪上进行扩增，94℃预变性5min，94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸10s，循环34次；72℃终延伸7min后放4℃保存备用。
[0063]
制作1.5％的琼脂凝胶50ml，将pcr产物在凝胶中上样，用bio-red电泳仪检测(110v，45min)，在紫外成像仪下观察结果，然后进行切胶回收，用dna胶纯化回收试剂盒进行产物回收，得到目的片段。
[0064]
用pucm-t vector克隆试剂盒将目的片段与载体连接。反应体系为：
[0065]
插入片段3μl，pucm-t vector 1μl，10
×
ligation buffer 1μl，50％peg 40001μl，t4 dna ligase 1μl，sterilized ddh2o 3μl。将反应液置于16℃金属浴孵育6h后置于冰上冷却，将100μl dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上解冻后，加入上述10μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30min。将混合液在42℃水浴中热激90s，再冰上冷却5min。为使载体上的抗性复苏，向反应液中加入900μl不含抗生素的lb液体培养基，于37℃，200rpm/min摇床震荡培养1h。取出后4000rpm离心3min，吸除750μl上清液，将剩余反应液吹打混匀后涂布于含amp的lb固体培养基上，倒置暗培养12h后挑取阳性单菌落，用m13通用引物进行菌液pcr验证，然后将菌液送公司测序验证。将测序正确的菌液利用试剂盒提质粒后置于-20℃冰箱存放。
[0066]
pcr扩增：
[0067]
在上述克隆步骤中扩增目的片段引物的5’端加上t7启动子序列作为dsrna合成的扩增引物(附录表2)，合成特异引物。以筛选出的质粒为模板进行pcr扩增，反应体系为：质粒2μl，primer f 5μl，primer r 5μl，2
×
hieff canace gold pcr mix 50μl，ddh2o 38μl。离心混匀后在pcr仪上进行扩增，98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸
30s，循环34次；72℃终延伸5min；
[0068]
pcr产物纯化：
[0069]
(1)pcr产物加水补足至500μl，加入等体积(500μl)酚氯仿异戊醇(25:24:1)，轻摇混匀并静置15min，后12000rpm离心15min；
[0070]
(2)取上清于另一rnase-free离心管中，加入2-3倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3m naac(ph＝5.2)；
[0071]
(3)将上述混合液置于-20℃冰箱内1h或以上；
[0072]
(4)在4℃低温高速离心机中12000rpm离心10min；
[0073]
(5)弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇，在4℃条件下12000rpm离心5min；
[0074]
(6)重复步骤(5)；
[0075]
(7)吸去上清，使酒精完全挥发，根据沉淀量加rnase-free water稀释。
[0076]
(8)取1μl pcr纯化产物加9μl ddh2o进行稀释，混匀离心，吸取1μl用紫外分光光度计nanophoto meterp330测浓度并记录；
[0077]
dsrna转录：
[0078]
以上述纯化产物为模板，在pcr管中进行转录，反应体系为：10
×
transcription buffer 2μl，ntp mix 8μl，t7 enzyme mix 2μl，模板cdna 2μg，ddh2o up to 20μl。瞬时离心后放置于pcr仪中37℃孵育3h。然后进行双酶消化，在反应液中添加rnase-free h2o 17μl，dnase i 1μl，rnase t1 2μl，瞬时离心后放置于pcr仪中37℃孵育30min。电泳检测转录产物；
[0079]
dsrna纯化：
[0080]
(1)若上步中电泳检测条带正确且单一，则将孵育后的体系转入1.5ml rnase-free离心管中并加60μl nuclease-free water至总体系为100μl；
[0081]
(2)在体系中加入10μl 5m ammonium acetate(醋酸铵)并将其涡旋混匀；
[0082]
(3)在离心管中加入3倍体积(330μl)100％无水乙醇，涡旋混匀；
[0083]
(4)将混合液放置于-20℃冰箱内30min或以上；
[0084]
(5)在4℃低温高速离心机内12000rpm离心15min以上，使dsrna得以沉淀；
[0085]
(6)弃上清，加入1ml 75％乙醇溶液，并重复步骤(5)；
[0086]
(7)弃上清，待乙醇挥发完后根据沉淀量加入15-30μl depc水溶解沉淀；
[0087]
(8)吸取1μl涡旋混匀后的dsrna溶液，添加9μl depc水进行10倍稀释，使用紫外分光光度计nanophoto meterp330检测其浓度；
[0088]
(9)剩余已纯化的dsrna放于-20℃保存。
[0089]
抑制薇甘菊根系发育的实验
[0090]
水培实验(注射/浸泡根茎基部)：
[0091]
选取薇甘菊根系长势一致的植株，在薇甘菊距离根部最近的茎基部位注射/浸泡175ng/ul的dsrna，以未处理的植株作为阴性对照，利用水培法培养植株，将植株置于光周期l﹕d＝16h﹕8h，温度为25℃，相对湿度约为80％的温室中培养。处理后随时间观察并记录形态表型。提取根的总rna，采用qrt-pcr检测目的基因的表达水平。选择gapdh(agi：at1g13440)和ubq10(agi：at4g05320)作为qrt-pcr的内参。实验进行3次生物学重复，每个生物重复进行2次技术重复，用于qrt-pcr的引物序列见附录表3；
[0092]
利用激光共聚焦显微镜观察了注射/浸泡dsrna于根系条件下，dsrna能否进入到植物细胞的全过程。采用fluorescein rna labeling mix标记dsrna，其方法为：在dsrna合成体系中加入fluorescein rna labeling mix，使用t7rna聚合酶在聚合过程中将fluorescein rna labeling mix作为底物加入到新合成的dsrna来合成带fluorescein-12-utp标记dsrna，参照t7 rnai transcription kit试剂盒的说明书制备dsrna，电泳检测dsrna完整性。
[0093]
将制备好的荧光药物采用注射/浸泡的方式处理薇甘菊根系，置于水中培养，5天后激光共聚焦观察根组织并拍照。
[0094]
土培实验(喷洒叶片)：
[0095]
选取薇甘菊叶片长势一致的幼小植株，在薇甘菊叶片喷洒175ng/ul的dsrna，dsegfp和水作为3个处理，利用土培法培养植株，将植株置于光周期l﹕d＝16h﹕8h，温度为25℃，相对湿度约为80％的温室中培养。处理后随时间观察，提取叶片、茎、根的总rna，采用qrt-pcr检测目的基因的表达水平。选择gapdh(agi：at1g13440)和ubq10(agi：at4g05320)作为qrt-pcr的内参。实验进行3次生物重复，每个生物重复进行2次技术重复，用于qrt-pcr的引物序列见附录表3。
[0096]
统计分析：
[0097]
使用graphpad 8.0软件进行统计分析和作图，qpcr数据以平均数
±
标准误进行表示，mrna相对表达量采用单因素方差分析，并进行tukey氏检验。
[0098]
结果
[0099]
扩展蛋白家族expa基因筛选为薇甘菊的靶基因：
[0100]
扩展蛋白参与了多种植物的生长发育和逆境适应性响应，其中expa是研究最多的家族之一。通过筛选出拟南芥中已明确基因atexpa4具有与根系发育相关的功能，该基因的主要功能是敲除atexpa4基因使主根生长缓慢。利用blastp比对，以e-value值《e-5
为标准，筛选出基因mm14g033446作为靶标，并设计了相应的rnai分子；
[0101]
目的基因的克隆与测序：
[0102]
如图1凝胶电泳图所示；
[0103]
a)目的片段pcr扩增，maker为dl2000，扩增片段为511bp，条带大小正确；
[0104]
b)菌液pcr扩增，maker为dl2000，共点了4个样，条带大小正确。
[0105]
测序序列比对：(共4个菌样)
[0106]
如图2-图6所示，a1：核酸序列拼接后比对：发现有一个碱基突变，于是翻译成氨基酸进行比对)；氨基酸比对：(比对后发现还是有一个字母不一样)；
[0107]
通过比对发现，菌样a1、a2、a3、a4测序结果序列与原始序列(基因组测序序列)都有一处突变，r
→
s，猜测有可能基因组测序不正确。其中a2有2处突变，故排除，而a1、a3、a4比对后均一致，推测菌液测序结果a1、a3、a4正确，a2不正确。
[0108]
dsrna的制备：如图7凝胶电泳图所示，a)pcr扩增(t7)胶图，b)dsrna合成胶图。
[0109]
附录表1：pcr扩增引物序列
[0110]
引物名称序列mmexpa4-factgctcacgccaccttctacmmexpa4-rgactcatccattcggtccttg
[0111]
附录表2：dsrna引物序列
[0112][0113]
附录表3：qrt-pcr引物序列
[0114][0115][0116]
附录表4：筛选出的靶向基因
[0117][0118]
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。