一种大叶金腰SSR分子标记引物组合及应用

一种大叶金腰ssr分子标记引物组合及应用
技术领域
1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及大叶金腰叶绿体基因组ssr分子标记开发及应用。


背景技术：

2.金腰属chrysosplenium l.是虎耳草科多年生小草本，全属约70种，该属植物药效显著，长期以来被用于治疗各类疾病。其中大叶金腰(chrysosplenium macrophyllun oliv.)(虎皮草；马耳朵草；龙香草)为中国特有种，分布于湖北、湖南、江西、贵州、安徽、浙江、四川、云南、广东、广西、陕西、福建省，重庆市等。它是民间常用的中草药，具有清热解毒，生肌收敛作用，全株入药，味苦、涩、性寒，可用于治疗小儿惊风、肺和耳部疾病等。
3.ssr(simple sequence repeat，简单重复序列)由1～6个核苷酸组成的串联重复单元组成，广泛存在于真核生物的核基因组、叶绿体和线粒体基因组。因其具有数量丰富、多态性高、共显性、重复性好、操作简单等特点，已被广泛应用于种质资源与品种鉴定和遗传多样性分析。叶绿体基因组为单性遗传、几乎不发生基因重组、相对于核基因组更加保守。因此，基于叶绿体基因组信息开发的ssr标记，可以用于更高分类阶元的系统发育研究、种间及种内鉴定和遗传图谱及dna指纹图谱的构建。目前，大量叶绿体基因组信息已被测序，叶绿体ssr标记被开发应用。沙秀芬等利用10对cpssr引物和 13对mtssr引物分析了61丹参遗传多样性，并验证了引物在鼠尾草属植物种间的通用性。李思巧等利用开发的2对cpssr引物可以将花椒、竹叶花椒和日本花椒进行区分。张静珍等采用叶绿体ssr标记，对64份山药种质资源进行遗传多样性分析，并使用2 对cpssr引物成功构建了山药的dna指纹图谱。娄文睿等初步开发了山核桃属cpssr 标记，并筛选到了6对多态性引物，可用于山核桃属不同物种间的区分。
4.目前，关于大叶金腰的研究报道非常少，黄稳等采用srap标记技术对金腰属，包括大叶金腰在内的24个物种36份材料进行遗传多态性和聚类分析，并构建了38份金腰的dna指纹图谱。而关于大叶金腰的相关分析还未见报道。


技术实现要素：

5.为了弥补本领域中大叶金腰ssr分子标记的空缺，本发明基于大叶金腰叶绿体基因组开发了cpssr分子标记，并筛选出五组多态性cpssr分子标记引物，上述大叶金腰 ssr分子标记引物组合能够对大叶金腰遗传多样性进行分析，为大叶金腰不同居群材料鉴定、遗传进化分析提供可靠的标记资源。
6.实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
7.一种大叶金腰ssr分子标记引物组合，所述ssr分子标记包括cpssr2、cpssr5、 cpssr11、cpssr12、cpssr23五组，其核苷酸序列如seq id no.11～15所示；
8.所述引物组合包括：
9.扩增分子标记cpssr2的引物，正向及反向引物如seq id no.1～2所示；
10.扩增分子标记cpssr5的引物，正向及反向引物如seq id no.3～4所示；
11.扩增分子标记cpssr11的引物，正向及反向引物如seq id no.5～6所示；
12.扩增分子标记cpssr12的引物，正向及反向引物如seq id no.7～8所示；
13.扩增分子标记cpssr23的引物，正向及反向引物如seq id no.9～10所示。
14.所述大叶金腰ssr分子标记引物组合能够应用于大叶金腰种群遗传多样性分析中，具体步骤如下：
15.(1)基因组dna提取：采用改良ctab法提取大叶金腰高质量总基因组dna， dna质量和浓度采用紫外分光光度核酸测定仪测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测确认；
16.(2)pcr反应体系：对应配制五组，每一组反应体系总体积为10μl，包含2
×
t5 super pcr mix(page)5μl、10μmol
·
l-1
正反向引物各0.4μl，总基因组dna1μl， ddh2o 3.2μl；
17.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存；
18.(3)电泳检测：采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为 1
×
tbe，90w恒压电泳1.5～2.0h，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；
19.(4)数据分析：根据电泳图像，采用人工读带的方法，将图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”，并将数据输入excel建立原始“01”数据矩阵；
20.利用ntsys软件计算遗传相似系数，并采用非加权配对算术平均法upgma进行遗传相似性聚类分析；
21.运用gendive version3.06软件，计算等位基因数na、有效等位基因数ne、观测杂合度ho和期望杂合度he等多样性指标。
22.所述大叶金腰ssr分子标记引物组合的获取方法，获取方法包括以下步骤：
23.(1)大叶金腰叶绿体基因组序列获取及cpssr位点鉴别
24.从genbank公共数据库中下载大叶金腰叶绿体基因组序列mk973001，利用misa perl脚本软件搜索叶绿体基因组中分布的ssr位点，获得初筛cpssr分子标记的核苷酸序列；检索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置10、6、5、5、5和5次；
25.(2)cpssr引物设计
26.利用primer 3软件对上步骤中初筛cpssr分子标记的核苷酸序列进行引物设计，引物设计原则为：gc含量40～60％，退火温度57～60℃，引物长度18～23bp，预计扩增产物长度100～300bp；获得初筛cpssr引物的核苷酸序列；
27.(3)cpssr引物二次筛选
28.先采用改良ctab法提取大叶金腰高质量总基因组dna，然后以此为模板，对上步骤中的初筛cpssr引物均构建pcr反应体系，进行pcr反应，pcr扩增结束后，采用凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；选取其中稳定性好、多态性高、清晰度高的电泳条带所对应的引物，即得到所述的大叶金腰 ssr分子标记引物组合。
29.由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
30.(1)本发明利用大叶金腰叶绿体基因组序列开发的ssr标记，填补了大叶金腰ssr 分子标记的空缺。
31.(2)本发明利用开发的cpssr多态性标记引物分析评价了大叶金腰群体间的多态性。
32.(3)本发明为后续学者筛选更多的大叶金腰ssr位点提供了思路。为开展大叶金腰不同居群材料鉴定、群体进化分析等提供可靠的标记资源。
附图说明
33.图1为实施例1中分子标记cpssr11的引物的电泳图；
34.图2为实施例1中分子标记cpssr12的引物的电泳图；
35.图3为cpssr12引物对45份大叶金腰样品的扩增后的电泳结果图；
36.图4为利用五对cpssr多态性引物构建的45份大叶金腰upgma聚类图谱。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加明白，下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
38.实施例1大叶金腰cpssr的位点鉴别及引物设计、筛选
39.(1)大叶金腰叶绿体基因组下载及cpssr位点鉴别
40.从genbank公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中以fasta格式下载大叶金腰叶绿体基因组序列(mk973001)，利用misa perl脚本软件搜索叶绿体基因组中分布的ssr位点，检索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置10、6、5、5、5和5次。通过cpssr位点筛选，从叶绿体基因组序列中共检测到30个ssr位点(见表1)，其中单碱基重复有23 个(a碱基6个，c碱基1个，t碱基17个)，双碱基重复有6个(at重复1个，ta 重复5个)。t和a碱基重复约占ssr位点数的66.00％，这说大叶金腰叶绿体基因组中的ssr主要以t和a的单碱基重复为主。
41.表1 大叶金腰cpssr位点信息统计
[0042][0043]
(2)cpssr引物设计
[0044]
利用primer 3软件进行cpssr引物设计，引物设计原则为：gc含量40-60％，退火温度57-60℃，引物长度18-23bp，预计扩增产物长度100-300bp。根据cpssr位点共设计30对cpssr引物，引物序列详见表2。引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。
[0045]
表2 大叶金腰cpssr标记的引物信息
[0046]
[0047]
[0048][0049]
(3)多态性引物筛选
[0050]
采用12份大叶金腰材料的dna为模板。cp-ssr反应体系总体积为10μl，包含2
×
t5 super pcr mix(page)5μl、正反向引物(10μmol
·
l-1)各0.4μl，基因组dna 1μl，ddh2o 3.2μl。pcr反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存，所用引物见表2。pcr扩增结束后，采用4％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为1
×
tbe， 90w恒压电泳1.5～2.0h，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像。结果发现30对引物都可以在12份大叶金腰中扩增出条
带，其中有5对引物在12份大叶金腰样品中扩增出稳定性好、多态性高，清晰度高的电泳条带，引物编号分别为cpssr2、cpssr5、 cpssr11、cpssr12、cpssr23(表2加粗显示)。电泳图参照图1和图2，图1为cpssr11 引物的电泳图，图2为cpssr12引物的电泳图，出于篇幅考虑，本发明中未将全部的电泳图在附图中展示。图1和图2中，m：maker；1-12：12份大叶金腰。
[0051]
实施例2 5对多态性cpssr引物在大叶金腰种群遗传多样性研究中的应用
[0052]
(1)基因组dna提取：
[0053]
采集不同地方的大叶金腰样品，共45份，详细信息见表3，采用改良ctab法提取叶片组织的基因组dna，dna质量和浓度采用紫外分光光度核酸测定仪测定，并用 1％的琼脂糖凝胶电泳检测确认，dna浓度统一稀释至80ng/μl，放置-20℃冰箱保存备用。
[0054]
表3 大叶金腰样品采集地点信息
[0055][0056][0057]
(2)cp-ssr反应体系：cp-ssr反应体系总体积为10μl，包含2
×
t5super pcr mix (page)5μl、正反向引物(10μmol
·
l-1
)各0.4μl，基因组dna 1μl，ddh2o 3.2μl。 pcr反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共 35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存，所用引物为5对多态性引物(见表2中加粗)。(3)电泳检测：采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为1
×ꢀ
tbe，90w恒压电泳1.5～2.0h，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像。图3为 cpssr12引物对45份大叶金腰样品的扩增后的，出于篇幅考虑，本发明中未将全部的电泳图在附图中展示。
[0058]
(4)数据分析：根据电泳图像，采用人工读带的方法，将图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”，并将数据输入excel建立原始“01”数据矩阵。利用ntsys软件计算遗传相似系数，并采用非加权配对算术平均法(upgma)进行遗传相似性聚类分析。
运用gendive version3.06软件，计算等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)和期望杂合度(he)等多样性指标。计算结果见表4。
[0059]
表4 引物多态性信息分析表
[0060][0061]
表中：na：等位基因；ne：有效等位基因数；ho：观察杂合度；he：期望杂合度
[0062]
由表4可以看出，5对引物的等位基的变化范围在3～6之间，平均数为4.4，有效等位基因数(ne)在1.015～1.195之间，平均值为1.079，观测杂合度(ho)介于0～0.267，平均值为0.061，期望杂合度(he)在0.034～0.254之间，平均值为0.172。
[0063]
利用5对多态性cpssr引物对45份大叶金腰资源进行聚类分析，upgma结果显示(如图4所示)，45份大叶金腰在遗传相似系数为0.8时可以分为5个类群，第i类群包含18个样品，主要来自于织金县、南江县、宣恩县、英山县、通山县和临安市，第ii类群包含19个样品，主要来自于洪雅县、桂东县、宜丰县、利川市、竹溪县、磐安县和武冈市。第iii类群只包含来源于建宁县的样品，第iv和第v类都是来源于巴东县。研究表明聚类分析可以将相同来源的原生种归为一类，说明这5对引物可以用于大叶金腰资源遗传多样性分析和亲缘关系的研究。
[0064]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。