多肽及其用途的制作方法

1.本发明属于合成生物技术领域，并且具体涉及胶原蛋白多肽，可用于组织填充与增容的人体结构性材料。


背景技术：

2.由于遗传因素、营养情况、年龄因素等，有些人会出现颞部凹陷、鼻基底凹陷、下颏短小退缩、鼻梁低平等面部结构性缺陷；也有部分女性会出现乳房发育不良或下垂萎缩等问题，严重影响美感。随着人们生活水平的不断提高和思想观念的开放，越来越多的人开始关注美容整形。目前可通过填充手术来改善女性的容貌和身材，以获得挺翘优美的鼻形、平整光滑的面部和饱满圆润的乳房。现在阶段的填充手术，主要可分为假体植入手术、自体组织移植手术、注射填充手术。
3.因为硅胶具有较好的组织相容性，没有致癌、致突变、致畸等问题，抗撕力、硬度、弹性回缩力等各方面都比较令人满意，所以早期的隆乳手术和隆鼻术往往采用硅胶假体作为植入物。这具有操作简单，外形美观，效果立竿见影等优点。然而，硅胶假体因表面存在静电，容易吸附一些尘屑或者纤毛，易导致伤口产生感染；也会在术后产生一些并发症。例如：隆乳切口瘢痕明显、乳沟过宽、抬举困难、假体破裂、渗漏、包膜挛缩等并发症，且发生假体挛缩、破裂的概率随着假体植入时间的延长而增大；隆鼻则容易出现假体透光、组织相容性差、材料坚硬、植入后触感差、容易移位等问题，且引发鼻部肿胀、鼻尖皮炎以及皮下张力过大等并发症，无法支撑鼻背。
4.随着整形技术的发展，自体组织移植在美容外科中发挥了日益重要的作用。其中自体脂肪隆胸、隆鼻、面中部填充是将自身脂肪较丰厚部位的脂肪颗粒移植到所需部位。自体脂肪移植通常采用注射方式，疼痛感较小且手术创伤较小、耗时短，手术区域瘢痕不明显，术后恢复快；其填充物来源于自身，具有生物相容性，移植后无免疫排斥反应，且不会影响其本身的乳房或鼻部功能；具有优异的融合性，不易发生移位；术后并发症少；同时又可瘦身塑形。但是传统的脂肪采集技术和注射技术存在着高吸收率、低存活率等不足，一次性移植过量也会引起乳房结节等并发症，所以常需要多次脂肪移植才能达到预期效果。除了自体脂肪外，自体软骨也可以作为隆鼻和面中部填充的原料，具有与自体脂肪相似的优势，但是其会产生自体扭曲变形，从而对后续的填充效果产生较大的影响。
5.注射填充是指将人工化学物质通过注射填充到乳房或面部缺陷部位的手术方式。其中人造脂肪是最常用的注射填充材料，其化学成分是亲水性聚丙烯胺水凝胶，常被用于隆乳术中，但是在后续的长期应用中发现其具有许多并发症和不良反应。该水凝胶在生产过程中会带有有毒重金属，易通过皮肤黏膜被人体吸收和累积，从而引起中毒；且对细胞和肾脏也有不同程度的毒副作用。注射后会引起乳房内硬块或硬结、疼痛、双侧乳房不对称、感染、哺乳期乳腺炎、无菌性炎症、乳房破溃穿孔、注射物移位、上肢活动受限等并发症，有些患者数种并发症共存。
6.随着现代技术的发展，重组胶原蛋白已经可以通过基因工程技术生产，但是目前
市面上的胶原蛋白主要是通过人源胶原蛋白的序列进行突变得到，属于类胶原蛋白，仍具有一定的免疫原性；且仍需要与交联剂混合制备得到凝胶产品，才可实现其生物力学性能，完成组织的增容和填充。但是往往交联剂的使用会导致具有低免疫原性且无毒性的胶原蛋白产生未观察到的副作用和异物反应。因此，本领域亟需发明一种不具有外源基因序列、无免疫原性、高生物相容性、可自主交联的人源化胶原蛋白，并作为人体结构性材料用于组织填充和增容。


技术实现要素：

7.本发明人对人源化胶原蛋白进行长期的研究，并且在中国专利申请cn201210482543.2和cn201811438582.6中发现了多种iii型胶原蛋白多肽。本发明人对这些发现的胶原蛋白多肽进一步进行了研究，发现这些胶原蛋白多肽在低温下不能自身形成凝胶。令人惊讶地，发明人在先前发明的胶原蛋白多肽的基础上添加小肽段，能够使形成的胶原蛋白多肽在低温下形成凝胶。本发明的凝胶可以不含交联剂。
8.在一个方面，本发明提供了多肽，包含n端序列和c端序列，其中n端序列包含一个或多个重复单元，该重复单元包含以seq id no.1所示的氨基酸序列，并且c端序列为seq id no.2所示的氨基酸序列。seq id no.1的氨基酸序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap。seq id no.2的氨基酸序列gapgpccgg。
9.在一个实施方案中，重复单元可以是seq id no.1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变(取代、插入、删除或添加)后得到的氨基酸序列。
10.在一个实施方案中，c端序列可以是seq id no.2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变(取代、插入、删除或添加)后得到的氨基酸序列。
11.在一个实施方案中，重复单元的数目是1-20。
12.在一个实施方案中，重复单元的数目是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
13.在一个实施方案中，n端序列和c端序列是直接连接的或间隔一个或多个氨基酸残基。
14.在一个实施方案中，各重复单元是直接连接的或间隔一个或多个氨基酸残基；
15.在一个实施方案中，多肽包含seq id no.3所示的氨基酸序列或seq id no.3的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变(取代、插入、删除或添加)后得到的氨基酸序列。
16.在一个实施方案中，在多肽序列发生突变的情况下，得到的多肽保留本发明的功能，如细胞粘附、自身形成凝胶的能力等。
17.在一个方面中，本发明提供了多核苷酸，其编码本文所述的多肽。
18.在一个实施方案中，多核苷酸包含seq id no.4所示的核苷酸序列。
19.在一个方面中，本发明提供了核酸，该核酸包含本文的多核苷酸。
20.在一个实施方案中，核酸还包含编码纯化标签，例如his标签、gst标签、mbp标签、sumo标签或nusa标签的核苷酸。
21.在一个实施方案中，核酸还包含编码前导序列的核苷酸。
22.在一个方面，本发明提供了载体，该载体包含本文的多核苷酸或核酸。在一个实施
方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，载体包含与多核苷酸或核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。
23.在一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文的多核苷酸、核酸或载体。
24.在一个实施方案中，宿主细胞是细菌、真菌或动物细胞。在一个实施方案中，细菌是大肠杆菌。在一个实施方案中，真菌是酵母，例如酿酒酵母。
25.在一个方面，本发明提供生产多肽的方法，其包括：
26.(1)在合适的培养条件下培养本文的宿主细胞；
27.(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；
28.(3)纯化多肽。
29.在一个方面，本发明提供了组合物，其包含本文所述的多肽。组合物可以是组织填充和/或增容用的组合物。
30.在一个方面，本发明提供了凝胶，其包含本文所述的多肽或者从该多肽制备。在一个实施方案中，凝胶不包含交联剂。在一个实施方案中，本文的凝胶是人体结构性材料，可用于组织填充和/或增容。
31.在另一个方面，本发明提供了制备凝胶的方法，其包括在低温下贮存本文所述的多肽的步骤。
32.在一个实施方案中，低温是2～8℃的温度。在一个实施方案中，低温是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
33.在一个实施方案中，本发明的方法包括贮存多肽溶液的步骤。优选地，多肽溶液是多肽的氯化钠溶液。溶液可以是50-500mm nacl，例如100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm或450mm。在一个实施方案中，氯化钠溶液的ph为6以上，例如6.5、7、7.5、8.0、8.5、9或9.5。
34.在又一个方面，本发明提供了本文的多肽、多核苷酸、核酸、宿主细胞、组合物或凝胶用于增加细胞粘附或用作组织填充和增容的用途。例如，本文的多肽、多核苷酸、核酸、宿主细胞、组合物或凝胶可以用于隆乳、隆鼻和/或脸部填充。
35.本发明的优点包括：
36.1.本发明首次成功合成重组ⅲ型人源化胶原蛋白低温凝胶，其氨基酸序列全部来源于人体本身，无外源氨基酸序列；
37.2.本发明制备得到的重组ⅲ型人源化胶原蛋白在无外源交联剂参与的情况下即可发生交联反应形成低温凝胶，无生物毒性；
38.3.本发明制备得到的重组ⅲ型人源化胶原蛋白低温凝胶属于人源化胶原蛋白，具有良好的组织填充和增容作用，且应用于人体无免疫反应、组织相容性强，可作为人体结构性材料直接注射于人体；
39.4.本发明中生物合成重组ⅲ型人源化胶原蛋白低温凝胶的方法可工业化大规模稳定生产。
40.5.本发明中提供了一种用于组织填充与增容的人体结构性材料的用途，因其无需从人体移植，但又具有人体组织填充的天然优势，所以有望在隆乳、隆鼻和面中部填充等领域得到广泛的应用。
附图说明
41.图1：纯化后的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16的电泳检测结果。
42.图2：纯化后的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16的细胞黏附活性检测结果。
43.图3：纯化后的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16表达产物的质谱出峰结果。
44.图4：人源胶原蛋白t16、te16c和at16的动力粘度测定过程中的图像。
具体实施方式
45.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.本发明人对人源化胶原蛋白进行长期的研究，并且在中国专利申请cn201210482543.2和cn201811438582.6中发现了多种iii型胶原蛋白多肽。本发明人对这些发现的胶原蛋白多肽进一步进行了研究，发现这些胶原蛋白多肽在低温下不能自身形成凝胶。令人惊讶地，发明人在先前发明的胶原蛋白多肽的基础上添加小肽段，能够使形成的胶原蛋白多肽在低温下形成凝胶。本发明的凝胶可以不含交联剂。筛选出的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16功能区的氨基酸序列为：
47.gergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgapgpccgg(seq id no.3)。划横线的氨基酸序列部分是针对专利cn201811438582.6的氨基酸的基础上进行的新功能区的组合拼接。
48.如本文中所用，“多肽”是指通过肽键连接的多个氨基酸残基。如本文中所用，就多肽或特定氨基酸序列而言，“c端”和“n端”是指相对于该多肽或特定氨基酸序列的位置，具体指位于多肽或特定氨基酸序列的羧基端或氨基端方向。
49.在本文中，从n端至c端，多肽可以包含n端序列和c端序列。n端序列可以包含一个或多个重复单元，该重复单元包含以seq id no.1所示的氨基酸序列或者该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变(取代、添加、插入或缺失)后的氨基酸序列。重复单元的数目可以是1-20。例如，重复单元的数目是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。特别地，突变可以是取代，例如保守氨基酸取代。seq id no.1的氨基酸序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap。在n端序列中，各重复单元可以是直接连接的或间隔一个或多个氨基酸残基。
50.c端序列可以为seq id no.2所示的氨基酸序列或者该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变(取代、添加、插入或缺失)后的氨基酸序列。特别地，突变可以是取代，例如保守氨基酸取代。seq id no.2的氨基酸序列gapgpccgg。n端序列和c端序列可以是直接连接的或可以间隔一个或多个氨基酸残基，例如2-10个氨基酸残基。例如，n端序列和c端
序列可以间隔3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。
51.在多肽序列发生突变或存在间隔序列的情况下，得到的多肽保留本发明的功能，如细胞粘附、自身形成凝胶的能力等。
52.本发明的多肽可以是合成的或者可以通过重组表达。在重组表达的情况下，本发明的多肽可以由多核苷酸编码。多核苷酸可以针对进行表达的宿主细胞进行密码子优化。编码多肽的多核苷酸可以与表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子可操作连接以构成核酸，或者表达盒。该核酸还可以包含编码纯化标签，例如his标签、gst标签、mbp标签、sumo标签或nusa标签的核苷酸或者编码前导序列的核苷酸，以便于多肽的纯化或分泌。
53.如本文中所用，术语“载体”是可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体可以包含本发明的核酸以便于导入细胞进行表达。载体可以包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。
54.如本文中所用，术语“宿主细胞”是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸dna。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。例如，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。原核细胞可以是大肠杆菌细胞。
55.本发明还提供了生产多肽的方法，其包括：(1)在合适的培养条件下培养本文的宿主细胞；(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和(3)纯化多肽。本发明的方法可以包括酶切标签的步骤。
56.本发明的多肽可以制备成组合物或试剂盒。组合物或试剂盒可以是组织填充和/或增容用的组合物或试剂盒。组合物或试剂盒还可以包含辅助物质。本发明的组合物可以是凝胶，其包含本文所述的多肽。凝胶可以由本文所述的多肽自主产生，不包含交联剂。本发明的组合物，特别是凝胶是人体结构性材料，例如可用于组织填充和/或增容。本发明的凝胶可以通过简单的方法制备。例如，制备凝胶的方法可以包括在低温下贮存本文所述的多肽的步骤。本发明的多肽在低温下就可以完成自身胶凝。低温可以是2～8℃的温度，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。本发明的方法可以包括贮存多肽溶液的步骤。优选地，多肽溶液是多肽的氯化钠的水溶液。氯化钠溶液可以是50mm-500mm溶液。例如，氯化钠溶液可以是100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm或450mm。在一个实施方案中，氯化钠溶液的ph为6以上，例如6.5、7、7.5、8.0、8.5、9或9.5。溶液中的多肽浓度可以为大于5mg/ml，或大于10mg/ml，例如可以是10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml或更大的浓度。
57.实施例
58.提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的，而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定。
59.实施例1：重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的构建及表达
60.1.进行大规模功能区筛选和组装拼接，得到重组ⅲ型人源化胶原蛋白的目的基因片段：at16的氨基酸序列为：gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgapgpccgg。本发明中针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化，优化后的碱基序列为：ggagaaaggggggcgcctggctttcgtggtccggcgggtccgaatggcattccgggtgaaaagggtcctgccggtgagcgtggtgctccgggtgagcgcggcgctccgggtttccgcggtcccgcgggtccgaacggcatcccgggagaaaaaggcccagctggcgagcgcggtgcaccgggcgaacgtggtgccccgggcttccgtggcccagcgggtccgaacggtattccgggcgagaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcgccaggcgagcgtggtgcgcctggtttcagaggcccagcaggcccaaatggcatccccggtgagaagggcccagccggtgagcgcggggcaccgggtgaacgtggcgcgccgggctttcgcggaccggcgggtccgaacggcatcccgggtgagaagggtccggctggcgagcgtggtgcgccgggtgaacgtggtgcaccgggattccgcggcccggcgggaccgaatggtattccgggtgagaagggtccggcgggcgaacgcggagcaccaggcgaacgcggcgctccgggctttcgcggtccggcgggtccgaatggtatcccgggcgagaagggtcctgccggtgagcgtggtgccccgggcgaacgtggcgctccgggttttcgtggtccggcgggtccgaacggcattccgggtgaaaagggcccagcgggtgagcgtggcgcgccaggcgagagaggtgccccgggttttcgtggcccggcgggtccgaacggcatcccgggtgagaaaggcccggcgggcgaacgtggtgcgccaggcgagagaggtgctccgggtttccgtggcccggctggtccgaacggtattccgggtgaaaagggcccggcgggcgagcgtggcgcgccgggtgagcgtggtgccccaggctttcgtggtccagctggtccgaacggtatcccgggtgaaaaaggtccggcgggtgagcgtggcgcgccgggtgaacgtggtgccccaggcttccgcgggccggcaggtcccaacggtatcccgggcgagaaaggtccggctggcgagcgaggtgccccgggcgaacgtggcgcgccgggcttccgcggtccggcaggcccgaacggtatcccgggcgagaaaggtccggcaggtgagcgtggtgcgccgggtgaacgcggcgctccgggttttcgtggcccggcaggcccaaatggcattccgggcgaaaaaggcccagcgggtgagcgtggtgccccgggtgagcgcggtgcgccgggtttccgcggtccggcgggtccgaatggtattccgggcgaaaaaggcccggcgggcgagcgtggcgctccgggcgaacgtggagcgccaggattccgcggcccggcaggaccgaacggcatcccgggagaaaagggcccggcgggtgaacgtggtgcaccgggagcgcctggtccgtgttgcggtggt(seq id no:4)。
61.2.将合成的基因片段插入pet-28a-trx-his表达载体中得到重组表达质粒。
62.3.将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)。具体过程为：(1)在超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)置于冰上，待半融时取2μl待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，稍微混匀2-3次。(2)将混合物置于冰上冰浴30min，然后于42℃水浴热激45-90s，取出后置于冰上冰浴2min。(3)转移至生物安全柜中，并加入700μl液体lb培养基，然后于37℃、220rpm条件下培养60min。(4)取200μl的菌液均匀涂布在含有硫酸卡那霉素lb平板上。(5)将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
63.4.挑取优选后的大肠杆菌基因工程单菌落，置于含有卡那霉素的lb液体培养基
中，于37℃，220rpm培养5小时后，降温至16℃，加入终浓度为0.5mm iptg进行诱导。培养16小时后，于6000rpm、4℃离心12min，收集菌体。
64.5.将重组人源化ⅲ型胶原蛋白的进行纯化和酶切，具体过程是：(1)用tris缓冲液(25mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph＝8.0)重悬细菌，均质破碎，17000rpm 4℃离心20分钟，收集上清液；(2)利用ni6ff亲和柱结合蛋白，用含有20mm咪唑的洗涤缓冲溶液(20mm咪唑，25mm tris，200mm nacl，ph 8.0)漂洗杂蛋白，用含有350mm咪唑的溶液(350mm咪唑，25mm tris，200mm nacl，ph 8.0)洗脱目的蛋白；(3)在洗脱的蛋白样品中加入适量具有his标签的tev蛋白酶20℃，酶切2h，获得重组人源化ⅲ型胶原蛋白at16；(4)利用10kda透析袋，将酶切后的重组人源化ⅲ型胶原蛋白at16的混合液透析换液至氯化钠溶液中；(5)利用10kda超滤浓缩管，将换液后的重组人源化ⅲ型胶原蛋白at16浓缩至蛋白浓度不小于10mg/ml。
65.6.重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶的形成，具体过程为：将获得的重组人源化ⅲ型胶原蛋白at16放入冰箱保存，使蛋白在低温环境下交联形成凝胶。
66.7.重组ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶纯度检测
67.所得at16蛋白利用sds-page检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液20μl，加入5μl 5
×
的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph 6.8)，10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮5min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压150v电泳1h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％乙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色3min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
68.图1显示了纯化后的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16的电泳检测结果，at16的表观分子量在45kda，分子量对应at16多肽，表明多肽at16得到正确的表达。
69.实施例2：重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16的生物活性检测
70.胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献juming yao,satoshi yanagisawa,tetsuo asakura,design,expression and characterization of collagen-like proteins based on the cell adhesive and crosslinking sequences derived from native collagens,j biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
71.(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括牛i型胶原标准品(sigma，编号：380002)、本发明提供的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16。
72.具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式c(μg/ml)＝144
×
(a215-a225)计算蛋白质浓度，注意需在a215《1.5的情况下检测。该方法的原理是：测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为walker jm.the protein protocols handbook,second edition.humanapress.43-45.)。检测完蛋白浓度后，用pbs将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
73.(2)向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白pbs溶液对照，室温静置60min。
74.(3)每孔中加入105个培养状态良好的3t3细胞，37℃孵育60min。
75.(4)每孔用pbs清洗4次。
76.(5)用ldh检测试剂盒(roche，04744926001)检测od492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细
细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
77.结果如图2所示(d-pbs表示空白pbs组；b coli表示牛i型胶原标品对照组；0.25表示0.25mg/ml at16组；0.5表示0.5mg/ml at16组；1表示1.0mg/ml at16组)，从对比中可知，相比于商品化的人胶原蛋白，本发明的不同浓度的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16具有更加优秀的生物黏附活性。
78.实施例3：重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16的质谱检测
79.实验方法
[0080][0081]
蛋白样品经dtt还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。酶解后得到的肽段再经c18ziptip脱盐后，与基质α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(chca)混合点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪maldi-tof/tof ulraflextreme
tm
，brucker，germany进行分析(肽指纹图谱的技术可以参考protein j.2016；35:212-7)。
[0082]
数据检索是通过从本地masco网站上ms/ms ion search页面处理的。蛋白质鉴定结果是根据酶解后所产生的肽段的一级质谱得到的。检测参数：trypsin酶解，设两个漏切位点。设定半胱氨酸的烷基化为固定修饰。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。鉴定所用的数据库为ncbprot。
[0083]
表1：质谱检出分子量及对应多肽
[0084][0085][0086]
检出多肽片段的覆盖率为84.66％。
[0087]
实施例4：重组ⅲ型人源化胶原蛋白t16、te16c、at16的动力粘度测试实验方法
[0088]
将重组ⅲ型人源胶原蛋白t16(氨基酸序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpng
ipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgppgpccggg，seq id no.5)和te16c(氨基酸序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap，seq id no.6)和本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16在相同浓度及对应溶液(150mm nacl溶液，多肽浓度15mg/ml)中，分别储存在2～8℃环境中放入仪器旋转粘度仪中，对其动力粘度进行测试对比。
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实验结果
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重组ⅲ型人源胶原蛋白t16和te16c的无法测出动力粘度，而本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16测出的动力粘度是3510mpa
·
s。这表明在相同条件下本发明的重组ⅲ型人源化胶原蛋白at16能更好的形成凝胶，见图4。根据图4可见，与呈无色透明的t16和te16c相比，at16呈乳白色，能够形成凝胶。