一种提高质粒碱裂解效率的方法与流程

1.本发明涉及质粒碱裂解技术领域，特别是涉及一种提高质粒碱裂解效率的方法。


背景技术：

2.在质粒生产过程中，碱裂解是为了裂解大肠杆菌细胞，释放质粒，从而为下游纯化提供内含质粒的细胞裂解液。碱裂解的效率对整个工艺中质粒的回收率有很大的影响，其中菌浓、裂解时间是关键调控点。
3.行业内传统碱裂解过程，裂解液的具体成分如表1所示：
4.溶液名称溶液成份裂解液150mm tris,20mm glucose,10mm edta,ph 8.0裂解液20.2m naoh,1％sds裂解液33m kac,2m hac
5.表1
6.基于表格1所示的裂解液，按照传统碱裂解菌浓90g/kg，且裂解液1：裂解液2：裂解液3＝1：2：1.5(体积比)进行处理。虽然上述处理工艺可以小规模操作且简单便宜，但是放大规模后，可操作性差，可控性差；其中，裂解液2的处理时间为5min会导致操作时间少，工艺可控性差，风险高。传统碱裂解效率一般维持在30％-50％，即理论上菌体内含100mg质粒，碱裂解后只能释放30-50mg质粒，存在碱裂解效率低的问题。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高质粒碱裂解效率的方法，用于解决现有技术中质粒碱裂解效率低的问题。本发明可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，且质粒质量不受影响。
8.为实现上述目的及其他相关目的，
9.本发明的第一方面，提供一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
10.步骤一、将菌体和第一裂解液混合，重悬处理形成菌体重悬液，所述菌体重悬液的菌体浓度为40～80g/kg；
11.步骤二、将菌体重悬液与第二裂解液按照体积比为1：(0.9～1.1)混合，碱裂解处理至少6min，即得菌体碱裂解液；
12.步骤三、将第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1～2)混合，中和处理，即可。
13.于本发明的一实施例中，所述步骤一中菌体的质量与第一裂解液的体积比值为1：(9～24)。
14.于本发明的一实施例中，所述步骤一中菌体重悬液的菌体浓度为40～60g/kg。
15.于本发明的一实施例中，所述步骤一中重悬处理的搅拌速度为300～600rpm，重悬时间为30～60min。
16.于本发明的一实施例中，所述步骤二中菌体重悬液与第二裂解液的体积比为1：(0.98～1.02)。
17.于本发明的一实施例中，所述步骤二中碱裂解处理的搅拌速度为30～100rpm，碱裂解时间为6～20min。
18.于本发明的一实施例中，所述步骤三中第二裂解液与第三裂解液按照体积比为1：(1.4～1.6)。
19.于本发明的一实施例中，所述中和处理的搅拌速度为30～100rpm，中和时间为8～12min。
20.于本发明的一实施例中，所述第一裂解液包括如下组分：80～120mm的氨基丁三醇，40～60mm的葡萄糖，8～12mm的乙二胺四乙酸；
21.所述第二裂解液包括如下组分：0.25～0.35m的氢氧化钠，1.8～2.2％的sds；
22.所述第三裂解液包括如下组分：2.2～2.8m的醋酸钾，2.2～2.8m的醋酸。
23.于本发明的一实施例中，所述第一裂解液包括如下组分：95～105mm的氨基丁三醇，45～55mm的葡萄糖，9～11mm的乙二胺四乙酸；
24.所述第二裂解液包括如下组分：0.29～0.31m的氢氧化钠，1.95～2.05％的sds；
25.所述第三裂解液包括如下组分：2.45～2.55m的醋酸钾，2.45～2.55m的醋酸。
26.如上所述，本发明的一种提高质粒碱裂解效率的方法，具有以下有益效果：本发明可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，有效提高碱裂解效率至60％～90％，质粒质量不受影响，便于工艺放大性、自动化性、可控性等。
附图说明
27.图1为本发明实施例1～6的裂解效率曲线图。
28.图2为本发明实施例7～10的裂解效率曲线图。
29.图3为本发明实施例11～18的裂解效率曲线图。
具体实施方式
30.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
31.实施例1
32.一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
33.步骤一、用天平称取目标菌体，按照菌体量(g)：第一裂解液(ml)＝1：9～24的质量体积比混合后形成菌体重悬液(菌体浓度为40g/kg)，再进行菌体重悬，搅拌转速400rpm，重悬40min，至无肉眼可见明显颗粒即可；
34.步骤二、菌体重悬液：第二裂解液的体积比为1：1，分别通过蠕动泵中的双管道，等流速的混合在一起形成菌体碱裂解液，进行碱裂解，控制泵速，保证裂解时间维持在12min，混合过程搅拌转速50rpm；
35.步骤三、第二裂解液：第三裂解液的体积比为1：1.5，使用蠕动泵的单管道加入第三裂解液进行中和，控制泵速，保证中和时间维持在10min，中和过程搅拌转速50rpm；
36.步骤四、碱裂解结束后，进行澄清过滤等。
37.实施例2～6
38.实施例2～6与实施例1的区别在于菌体浓度不同，实施例1～6的菌体浓度如表格2所示：
39.实施例菌体浓度/(g/kg)裂解效率/％140902508636085470705806369035
40.表2
41.表格2中的裂解效率曲线图如图1所示。从图1和表格2中可以看出，同一条件下，40-90g/kg菌浓范围内，碱裂解菌浓越高，裂解效率越低。碱裂解菌浓设置在40-80g/kg时，裂解效率高于60％；且菌体浓度优选为40-60g/kg。
42.实施例7
43.一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
44.步骤一、用天平称取目标菌体，按照菌体量(g)：第一裂解液(ml)＝1：9～24的质量体积比混合后形成菌体重悬液(菌体浓度为70g/kg)，再进行菌体重悬，搅拌转速400rpm，重悬40min，至无肉眼可见明显颗粒即可；
45.步骤二、菌体重悬液：第二裂解液的体积比为1：1，分别通过蠕动泵中的双管道，等流速的混合在一起形成菌体碱裂解液，进行碱裂解，控制泵速，保证裂解时间维持在12min，混合过程搅拌转速50rpm；
46.步骤三、菌体碱裂解液：第三裂解液的体积比为1：1，使用蠕动泵的单管道加入第三裂解液进行中和，控制泵速，保证中和时间维持在10min，中和过程搅拌转速50rpm；
47.步骤四、碱裂解结束后，进行澄清过滤等。
48.实施例8～10
49.实施例8～10与实施例7的区别在于体积比不同，实施例7～10的体积比如表格3所示：
[0050][0051]
表3
[0052]
表格3中的裂解效率曲线图如图2所示。从图2和表格3中可以看出，同一条件下，碱
裂解缓冲液体积比例(1：1：1～2)相比传统碱裂解缓冲液体积比例(1：2：1.5)裂解效率比较高。
[0053]
实施例11
[0054]
一种提高质粒碱裂解效率的方法，包括如下步骤：
[0055]
步骤一、用天平称取目标菌体，按照菌体量(g)：第一裂解液(ml)＝1：9～24的质量体积比混合后形成菌体重悬液(菌体浓度为70g/kg)，再进行菌体重悬，搅拌转速400rpm，重悬40min，至无肉眼可见明显颗粒即可；
[0056]
步骤二、菌体重悬液：第二裂解液的体积比为1：1，分别通过蠕动泵中的双管道，等流速的混合在一起形成菌体碱裂解液，进行碱裂解，控制泵速，保证裂解时间维持在6min，混合过程搅拌转速50rpm；
[0057]
步骤三、菌体碱裂解液：第三裂解液的体积比为1：1.5，使用蠕动泵的单管道加入第三裂解液进行中和，控制泵速，保证中和时间维持在10min，中和过程搅拌转速50rpm；
[0058]
步骤四、碱裂解结束后，进行澄清过滤等。
[0059]
实施例12～18
[0060]
实施例12～18与实施例11的区别在于碱裂解时间不同，实施例11～18的碱裂解时间如表格4所示：
[0061][0062][0063]
表4
[0064]
表格4中的裂解效率曲线图如图3所示。从图3和表格4中可以看出，同一条件下，随着裂解时间的增加(20min以内)，裂解效率呈现增长状。
[0065]
上述实施例1～18的裂解液的组分如表格5所示：
[0066][0067]
表5
[0068]
综上所述，本发明可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，提高碱裂解效率，进而提高质粒产量。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0069]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。