一种发根农杆菌介导的桃愈伤组织遗传转化方法

1.本发明涉及桃生物技术和基因工程领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导的桃愈伤组织遗传转化方法。


背景技术：

2.转基因是利用载体或物理、化学的方法把目的基因转入宿主，以获得具有优良农艺性状的植物新品种的技术。转基因愈伤组织具有多种用途，一方面可利用其增殖快、便于继代的特点，研究植物生长发育及分化机制、性状分子机理；另一方面可利用其细胞全能性及分化潜力诱导再生植株，对植物分子育种具有重要意义。
3.桃具有观赏食用性强、童期短(2-3年)、基因组小(约256mb)等优点，是蔷薇科李属的重要果树及模式植物。但由于桃的顽固性，其遗传转化研究进展缓慢，目前尚无高效稳定的转基因愈伤组织体系建立公布。常见的遗传转化方法有农杆菌介导的转化、基因枪转化和花粉管通道法转化等。其中，农杆菌介导的遗传转化方法因操作简便、成本低、效率高、相对稳定等优势得到了广泛的应用。转化植物最常用的是根癌农杆菌和发根农杆菌，但根癌农杆菌介导的桃遗传转化非常困难，且不稳定、效率低。这严重阻碍了桃功能基因组学及分子遗传改良研究进程，使桃基础研究与应用进展远远落后于水稻、大豆和苹果等植物。因此，建立高效稳定的转化体系已成为当前推进桃农艺性状基础研究和分子遗传改良研究的关键。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对桃愈伤组织遗传转化难的技术瓶颈，提供一种发根农杆菌介导的桃愈伤组织遗传转化方法，即利用发根农杆菌介导桃叶片外植体遗传转化获得转基因愈伤组织的体系建立。
5.本发明的目的是这样实现的，具体地说，本方法包括下列步骤：
6.①
桃无菌实生苗培养及外植体制备
7.a、收集枣油桃成熟种子，取果核，先后用商品84消毒液、75％酒精分别浸泡30分钟、2分钟，清水洗净后晾干，加变色硅胶存放于4℃冰箱；
8.b、从种子中取出桃仁，用清水润洗3次，再用75％酒精浸泡1-2分钟，无菌水润洗9次，浸泡15小时，去除种皮后接种于1/2ms+0.05mg/l iba+0.5mg/l 6-ba胚培养基中25℃暗培养30-45天，待无菌苗生长至12-15cm，置于25℃光周期环境培养5-7天；
9.c、将无菌苗叶片切成1*1cm大小的方形，放于含无菌水的培养皿中保湿，切完应立即侵染；
10.②
发根农杆菌侵染菌液制备
11.a、在含筛选抗生素的lb固体培养基上划线培养含有目的基因的msu440发根农杆菌，28℃倒置培养2-3天，挑取1-2mm单克隆菌落至含筛选抗生素的lb液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养16-18小时至od
600
为0.7左右；
12.b、6000rpm/10min离心菌液，弃上清，加等量1/2ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+20mg/las重悬液于28℃、200rpm震荡培养1小时后，调节od
600
为0.8，作为待用侵染液；
13.③
侵染转化及共培养
14.叶片外植体用侵染液浸泡15分钟后取出，在无菌滤纸上吸干，接种于1/2ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+20mg/l as共培养基上25℃暗培养3天；
15.④
转基因愈伤组织诱导
16.用含500mg/l头孢的无菌水润洗外植体4次，在滤纸上吸干后接种于ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+0.5mg/l 6-ba+2mg/l iba+200mg/l头孢愈伤组织诱导培养基上，25℃暗培养15-30天诱导愈伤组织发生；
17.⑤
转基因愈伤组织检测
18.观察诱导发生的愈伤组织是否产生表型，并提取dna进行pcr分析检测其是否为转基因阳性愈伤组织，统计出愈率及共转化率；
19.⑥
转基因愈伤组织获得及继代
20.将转基因愈伤组织从叶片上分离下来接种在ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+0.5mg/l 6-ba+2mg/l iba愈伤组织继代培养基上，25℃暗培养30天获得大量继代增殖转基因愈伤组织。
21.本发明具有下列优点和积极效果：
22.桃愈伤组织稳定转化困难是制约桃功能基因组学研究的主要瓶颈，本发明利用发根农杆菌介导桃愈伤组织转化，将甜菜红素合成基因35s：：ruby成功转入桃体细胞，获得因大量积累甜菜红素而呈红色的转基因愈伤组织；其出愈率达到86％，共转化率高达48％，并成功继代培养；该方法突破了桃愈伤组织转化难的技术阻碍，为桃功能基因组学的研究提供了技术支撑。
附图说明
23.图1是发根农杆菌介导的桃叶片转化过程和转基因愈伤组织获得过程示意图；
24.图2是积累甜菜红素变红的转基因愈伤组织生长图；
25.图3是转基因愈伤组织pcr阳性鉴定图；
26.图4是转基因愈伤组织继代培养图。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施例详细说明：
28.实施例1：
29.本方法利用携带合成甜菜红素基因35s：：ruby表达盒的msu440发根农杆菌菌株介导枣油桃叶片转化获得了超表达甜菜红素的转基因愈伤组织；ruby基因的大小是3939bp，pcr扩增片段大小为273bp；野生型桃愈伤组织呈白色至淡黄色，转基因桃愈伤组织超表达甜菜红素会呈肉眼可见的红色。
30.本体系具体实施步骤如下：
31.①
桃无菌实生苗培养及外植体制备：
32.a、收集枣油桃成熟种子，取果核，先后用商品84消毒液、75％酒精分别浸泡30分
钟、2分钟，清水洗净后晾干，袋装，加变色硅胶密封好后存放于4℃冰箱；
33.b、用园艺剪从种子中取出桃仁，清水润洗3次，再用75％酒精浸泡1-2分钟，在超净台中用无菌水润洗9次，置于无菌组培瓶中浸泡15小时，用无菌手术刀去除种皮后接种于1/2ms+0.05mg/l iba+0.5mg/l 6-ba胚培养基中，25℃暗培养30-45天，待无菌苗生长至12-15cm，置于25℃光周期环境培养5-7天；
34.c、在超净台中用无菌手术刀将无菌苗叶片切成1*1cm大小的方形，放于含无菌水的培养皿中保湿，切完应立即侵染，以免外植体死亡；
35.②
发根农杆菌侵染菌液制备：
36.a、在含50mg/l卡那霉素、50mg/l链霉素的lb固体培养基上划线培养携带35s：：ruby表达盒的msu440发根农杆菌，28℃培养箱中倒置培养2-3天，挑取1-2mm单克隆菌落至含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，28℃培养箱中200rpm震荡培养16-18小时至od
600
为0.7左右；
37.b、6000rpm/10min离心菌液，弃上清，加等量1/2ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+20mg/las重悬液于28℃培养箱中200rpm震荡培养1小时后，调节od
600
为0.8，作为待用侵染液；
38.③
侵染转化及共培养：见图1，由此可见菌液侵染外植体；
39.叶片外植体用侵染液浸泡15分钟后用镊子取出，放在无菌滤纸上吸干菌液，再接种于1/2ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+20mg/l as共培养基上，25℃暗培养3天；
40.④
转基因愈伤组织诱导：见图1，由此可见菌液侵染外植体；
41.用含500mg/l头孢噻肟钠的无菌水润洗外植体4次，在滤纸上吸干后接种于ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+0.5mg/l 6-ba+2mg/l iba+200mg/l头孢愈伤组织诱导培养基上，25℃暗培养15-30天诱导愈伤组织发生；
42.⑤
转基因愈伤组织检测：见图2和图3，由此可见转基因愈伤检测结果为阳性；
43.肉眼观察诱导获得的愈伤组织是否有甜菜红素积累呈红色，初步确定其是否为转基因愈伤组织；随机选取6个红色愈伤，pcr实验验证结果全部为阳性。统计出愈率为86％，共转化率为48％；
44.⑥
转基因愈伤组织获得及继代：见图4，由此可见转基因愈伤组织继代；
45.在超净台中用镊子将转基因愈伤组织从叶片上分离下来接种在ms+2.5％蔗糖+0.8％琼脂+0.5mg/l 6-ba+2mg/l iba愈伤组织继代培养基上，25℃暗培养30天获得大量继代增殖转基因愈伤组织。