结直肠癌的预后标志物EIF3F及其应用

结直肠癌的预后标志物eif3f及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及结直肠癌的预后标志物eif3f及其应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer,crc)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尽管现代诊疗技术已经取得了较大的进展，但对中晚期患者的治疗效果仍然较差，探索结直肠癌相关分子标志物及分子靶标是制定个体化治疗的基础。细胞代谢重编程是肿瘤的重要标志之一，为肿瘤的增殖、迁移等生物学提供能源和物质。前人已有研究证实丝氨酸合成在结直肠癌细胞内异常活跃，然而其具体的调控机制尚未明确。靶向丝氨酸合成途径是一个有前景的肿瘤治疗方向。
3.eif3f(eukaryotic translation initiation factor 3,f subunit)是真核生物翻译起始因子复合物3(eif3)的一个亚基，已有研究发现eif3f不仅参与基因翻译过程，而且在许多肿瘤发生发展及恶病质等方面具有重要的功能。然而，eif3f在结直肠肿瘤的作用尚未明确。


技术实现要素：

4.本发明研究了eif3f在结直肠癌发生发展中的生物学作用及其与预后的相关关系，并围绕eif3f-phgdh轴对结直肠癌细胞增殖和代谢的影响探索其参与调控的主要分子机制，为结直肠癌的个体化治疗提供新的药物靶点。
5.研究方法
6.1.通过调取公共数据库进行数据分析，并在结直肠癌细胞系、结直肠癌组织及组织微阵列(tissue microarray,tma)中应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)、免疫印迹(western blot，wb)和免疫组化(immunohistology，ihc)等方法，分析eif3f在结直肠癌中的表达变化情况；利用kaplan-meier生存分析方法探讨eif3f的表达水平与结直肠癌患者预后的相关性。
7.2.构建沉默或过表达eif3f的结直肠癌细胞株，通过qrt-pcr及wb验证其沉默或过表达的效率；通过cck8细胞活力实验、平板克隆形成、划痕实验、流式细胞术、海马细胞能量代谢分析等实验探索eif3f对结直肠癌细胞的生物学行为的影响。
8.3.通过免疫荧光(immunofluorescence)、蛋白质免疫共沉淀、邻位连接技术(proximity ligation assay，pla)、蛋白泛素化水平、蛋白降解速率和功能域突变等方法研究和明确eif3f对phgdh的泛素化水平的调控作用；
9.4.通过[u-13c]葡萄糖同位素示踪实验、s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)检测、nadph合成实验、丝氨酸回补实验等方法检测沉默eif3f对丝氨酸合成的影响。
[0010]
5.通过小鼠皮下荷瘤模型等实验，确定eif3f-phgdh轴对结直肠癌细胞增殖和代谢的作用。
[0011]
6.通过应用病人来源异种移植瘤模型(patient-derived xenograft，pdx)探讨phgdh抑制剂nct-503药物对eif3f不同表达水平的crc肿瘤的治疗效果。
[0012]
研究结果
[0013]
1.eif3f在结直肠癌组织中表达上调，高表达eif3f与结肠癌患者较差的总生存率密切相关。
[0014]
2.eif3f可调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、凋亡、细胞的耗氧率(oxygen consumption rate,ocr)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate，ecar)。
[0015]
3.eif3f通过与phgdh结合下调phgdh的泛素化水平，稳定phgdh蛋白。
[0016]
4.[u-13
c]葡萄糖同位素示踪实验证实了沉默eif3f导致丝氨酸和甘氨酸的合成量减少，而回补phgdh能部分逆转丝氨酸和甘氨酸的减少；sam实验和nadph实验证实了在结直肠癌细胞中沉默eif3f影响丝氨酸利用；丝氨酸回补实验证明了丝氨酸能部分逆转沉默eif3f导致的结直肠癌细胞增殖抑制。
[0017]
5.小鼠皮下成瘤实验结果表明，沉默eif3f抑制hct116细胞在裸鼠体内的成瘤能力，并抑制丝氨酸合成通路相关蛋白的表达。
[0018]
6.pdx模型实验结果表明，nct-503能有效地抑制eif3f高表达的结直肠癌患者来源的肿瘤生长，而对于eif3f表达相对较低的结直肠肿瘤的生长几乎没有影响。
[0019]
eif3f在结直肠癌组织中表达上调，高表达eif3f的结直肠癌患者预后较差，提示eif3f可作为结直肠癌预后的潜在分子标志物。在结直肠癌细胞中，eif3f通过与phgdh结合，下调phgdh的泛素化水平，调控phgdh的蛋白稳定性，促进丝氨酸合成，为结直肠癌细胞的增殖提供原材料。pdx模型实验表明phgdh的抑制剂nct-503对eif3f高表达肿瘤的生长有显著的抑制作用，明确eif3f-phgdh轴在结直肠癌发生发展的重要作用，为在结直肠癌患者中应用靶向丝氨酸代谢及肿瘤个体化治疗提供了理论基础。
附图说明
[0020]
图1：多个结肠癌(coad)geo数据集中eif3f的mrna表达分析；
[0021]
图2：26个结直肠癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织中，eif3f的相对mrna表达水平；
[0022]
图3：qrt-pcr检测ncm460细胞和多种结直肠癌细胞中eif3f的mrna表达水平；
[0023]
图4：western blot检测ncm460细胞和多种结肠直肠癌细胞中eif3f的蛋白水平；
[0024]
图5：基于gse71187和gse41258中结肠癌患者eif3f表达情况的总存活时间kaplan-meier图和对数秩检验，p《0.05具有统计学意义；
[0025]
图6：ihc染色法检测结直肠癌组织和正常组织中eif3f的表达；a.crc组织和配对正常组织中eif3f的ihc染色的代表性图像；b.用halo病理学软件分析tma中crc组织(n＝99)和正常组织(n＝76)中eif3f蛋白的ihc染色，p《0.05有统计学意义，配对t检验；c.用halo病理学软件分析tma中crc组织(n＝71)和配对正常组织(n＝71)中eif3f蛋白的ihc染色，p《0.05具有统计学意义，配对t检验；
[0026]
图7：使用cck8试剂盒在指定时间用多西环素处理后，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2诱导表达及对照的hct116细胞的细胞存活力，数据表示为平均值
±
标准差；
[0027]
图8：使用cck8试剂盒在指定时间用多西环素处理后，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2诱导表达及对照的rko细胞的细胞存活力，数据表示为平均值
±
标准差；
[0028]
图9：在有或没有多西环素的情况下，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2稳定表达hct116细胞中的集落形成能力；
[0029]
图10：在有或没有多西环素的情况下，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2稳定表达的rko细胞中的集落形成能力；
[0030]
图11：在hct116细胞中稳定表达plvx-载体或plvx-flag-eif3f的集落形成能力；
[0031]
图12：在有或没有多西环素的情况下，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2稳定表达hct116细胞的伤口愈合测定结果；
[0032]
图13：在有或没有多西环素的情况下，plko-tet-on-sheif3f#1或plko-tet-on-sheif3f#2稳定表达rko细胞的伤口愈合测定结果；
[0033]
图14：dox诱导plko-tet-on-sheif3f#1稳定表达的hct116细胞凋亡的代表性facs图谱，有或没有多西环素诱导(左)和凋亡细胞的定量(右)，p《0.05有统计学意义，t检验；
[0034]
图15：dox诱导plko-tet-on-sheif3f#1稳定表达的rko细胞凋亡的代表性facs图谱，有或没有多西环素诱导(左)和凋亡细胞的定量(右)，p《0.05有统计学意义，t检验；
[0035]
图16：有或者无多西环素的情况下，dox诱导plko-tet-on-sheif3f稳定表达的hct116细胞和rko细胞中测量耗氧率(ocr)；
[0036]
图17：有或者无多西环素的情况下，dox诱导plko-tet-on-sheif3f稳定表达的hct116细胞和rko细胞中测量了细胞外酸化率(ecars)；
[0037]
图18：hct116细胞和rko细胞的代表性免疫荧光图像，用抗eif3f抗体检测eif3f(二抗与alexa-488偶联)，用抗phgdh检测phgdh(二抗与alexa-555偶联)，细胞核用dapi染色；比例尺代表20μm；
[0038]
图19：pla结果图，显示eif3f与phgdh相互作用，比例尺代表10μm；
[0039]
图20：内源性免疫共沉淀结果图，表明eif3f与phgdh相互作用。hct116细胞裂解物用igg或eif3f抗体进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹(上图)；hct116细胞裂解物用igg或phgdh抗体进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹(下图)；
[0040]
图21：eif3f正向调节phgdh表达，a：western blot分析显示eif3f的过表达以剂量依赖的方式上调phgdh。用指示量的eif3f转染hct116细胞。用指示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。b：沉默eif3f下调phgdh表达。用多西环素处理指定时间后，表达hct116细胞(左)和rko细胞(右)的plko-tet-on-sheif3f#1的细胞裂解物用指定抗体进行免疫印迹；
[0041]
图22：沉默eif3f能加快phgdh蛋白的降解速率；
[0042]
图23：mg132处理能补救沉默eif3f引起的phgdh蛋白下降；
[0043]
图24：沉默eif3f增加phgdh的泛素化。在强力霉素处理诱导表达plko-tet-on-sheif3f的稳定rko细胞转染his-ubiquitin质粒并使用或不使用强力霉素处理64小时，然后加入50μm mg132处理6小时。
[0044]
图25：过表达eif3f以剂量依赖性方式降低phgdh的泛素化水平。在hek293t细胞转染flag-eif3f、ha-phgdh和his-ubi质粒，48小时后加入50μm mg132处理6小时。
[0045]
图26：eif3f能够去泛素化k48连接的phgdh的泛素化修饰。在hek293t细胞中转染
flag-eif3f、ha-phgdh以及ha-ubi(wt)、ha-ubi(k48)和ha-ubi(k63)质粒，48小时后加入50μm mg132处理6小时。用抗flag m2珠子免疫沉淀细胞裂解物，然后用指定的抗体进行蛋白质免疫印迹。
[0046]
图27：人结直肠癌tma中eif3f和phgdh的代表性ihc染色。病例1代表的是一名eif3f高表达的结肠癌患者。病例2代表的是一名eif3f低表达的结肠癌患者。比例尺表示50μm。
[0047]
图28：丝氨酸回补能部分解除沉默eif3f导致的结直肠癌细胞增殖的抑制。在表达plko-tet-on-sheif3f的hct116细胞中，使用或不是用强力霉素诱导eif3f敲低，并加入对照或丝氨酸处理。incucyte用于测量细胞的覆盖度。p《0.05认为具有统计学意义，two way-anova检验。
[0048]
图29：沉默eif3f减少细胞内s-腺苷甲硫氨酸的总量。
[0049]
图30：检测hct116细胞沉默eif3f后nadph/nadp+的影响。在hct116细胞内沉默eif3f导致nadph/nadp+比例减少。
[0050]
图31：建立nct-503治疗的pdx模型，a：pdx模型构建过程，b：在指定的患者来源的异种移植物(pdx)中eif3f表达水平的免疫印迹；
[0051]
图32：nct-503治疗抑制eif3f高表达的结直肠癌pdx肿瘤的生长。a：高表达eif3f的pdx肿瘤的生长曲线。b：低eif3f表达的pdx肿瘤的生长曲线。每五天测量异种移植pdx肿瘤大小；
[0052]
图33：nct-503治疗减少eif3f高表达的pdx肿瘤的瘤重。a：与对照组相比，nct-503治疗降低eif3f高表达的pdx肿瘤的瘤重；b：对照组和nct-503处理对eif3f低表达pdx肿瘤的肿瘤重量没有影响。结果显示为条形图。数据表示为平均值
±
标准差；
[0053]
图34：pdx肿瘤中tunel+凋亡信号的代表性免疫荧光图像。
具体实施方式
[0054]
实验方法
[0055]
1、在线数据库的数据挖掘与分析
[0056]
应用多个geo datasets(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term＝)分析并汇总eif3f在多个结直肠癌研究中的表达情况及统计差异情况。
[0057]
2、细胞培养
[0058]
本项目所用到的人结直肠癌细胞rko、widr及caco2在含有10％胎牛血清的细胞培养基mem中培养；人胚胎肾细胞hek293t、人结直正常肠上皮细胞ncm460、人结直肠癌细胞sw480以及sw620在含有10％胎牛血清的细胞培养基dmem中培养；人结直肠癌细胞hct116、dld1、hct8以及hct15在含有10％胎牛血清的细胞培养基rpmi-1640中培养。所有细胞培养中均加入适量的青链霉素抗生素。所有细胞培养的环境均为37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0059]
3、组织或细胞的rna提取
[0060]
(1)组织或细胞裂解
[0061]
①
组织：将组织从-80℃超低温冰箱中取出，切取适量体积的组织放到2ml宽底ep管内，并加入已经灭菌的3颗磁珠以及1ml的trizol试剂。把ep管放置于组织研磨仪研磨1min(65hz)，重复1次。研磨完毕后，将trizol组织样品转入对应的另一个无菌ep管内(避免
吸入磁珠)，室温静置5min，使其充分裂解，以进行下一步rna提取操作。
②
细胞：对于贴壁细胞，先弃掉上层细胞培养基，往细胞培养皿中加入预冷的pbs清洗两遍，然后吸掉pbs，往细胞培养皿加入适量体积的trizol试剂，室温静置5min，使其充分裂解。
[0062]
(2)把步骤(1)的trizol裂解液转移到新的1.5ml ep管中，按0.2ml氯仿/ml trizol比例加入氯仿，充分震荡混匀，放置室温静置3min。把ep管放入4℃预冷的高速离心机，以12000rpm转速离心15min。
[0063]
(3)吸取上层透明水相转移到另一个新的无菌ep管中，按0.5ml异丙醇/ml trizol比例加入异丙醇混匀，室温放置10min，然后放入4℃预冷的高速离心机中，以12000rpm转速离心10min。
[0064]
(4)弃上清，管底的白色沉淀为rna。按1ml 75％乙醇/ml trizol加入75％的乙醇，温和地颠倒ep管使管底的沉淀悬浮，然后放入预冷的高速离心机，4℃，12000rpm，离心5min。重复此步骤一次。
[0065]
(5)弃上清，保留底部的白色沉淀，把ep管再放入4℃预冷的高速离心机，以12000rpm空转离心2min，使管壁的残余液体沉淀到管底，后将管内的液体尽量吸干。管口敞开在通风且干净处5～15min挥发残余酒精。待管底白色沉淀变成半透明状，加入适量体积的depc处理水溶解rna。溶解后，用nanodrop 2000对已提取的rna进行浓度及质量的检测。一般rna样品浓度在100ng/μl到2000ng/μl之间。
[0066]
4、总rna逆转录
[0067]
(1)rna定量。应用超微量分光光度计nanodrop 2000对已提取的rna进行浓度及质量的检测。其中当a260/280数值在1.85-2.20之间，说明被测rna样品质量良好。
[0068]
(2)使用toyobo的revertraace qpcr rt master mix试剂盒逆转提取的rna，所有操作均在冰上进行。下面以10μl体系进行说明。
[0069]
①
65℃，5min，迅速拿出放置冰上1min。
②
去除基因组dna：把下述组分(表1)加入待逆转的rna中，轻柔混合，瞬时离心，然后把反应管放置到普通pcr仪，反应条件为37℃，5min。
[0070]
表1去除基因组dna反应的组分
[0071]
试剂体积4x dn mix(已加gdna remover)2μlrna0.5μgdepc处理水补充至8μl
[0072]
③
逆转录反应
[0073]
将以上体系内加入2μl 5x rt mix ii试剂，轻轻混合，瞬时离心，然后把反应管放到普通pcr仪。反应条件如下：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，∞。逆转录完成后，可把逆转后的cdna样品放置到-20℃冰箱保存。
[0074]
5、qpcr引物设计与合成
[0075]
结合ncbi及ensemble数据库获取eif3f等基因的转录本。利用网站(https://sg.idtdna.com/sessiontimeout.aspx)设计扩增相应的qpcr引物。设计完成的引物序列由深圳华大基因研究院合成，引物序列见表2。
[0076]
表2相关基因qrt-pcr引物列表
[0077][0078]
6、荧光定量pcr反应
[0079]
本研究使用biomake公司的2
×
sybr green qpcr master mix对目的基因扩增，使用罗氏480仪器检测荧光信号，以actin为内参，运用基因相对定量公式(公式1-1)对目的基因进行相对定量计算。
[0080]
基因相对定量＝2-δδct(公式1-1)
[0081]
根据2
×
sybr green qpcr master mix说明书，本课题采用的荧光定量pcr反应体系(10μl)如下(表3)：
[0082]
表3荧光定量pcr反应体系
[0083]
试剂体积(μl)cdna样品0.2depc水2.82x sybr green5荧光定量pcr引物mix2总共10
[0084]
按照上述组分把反应体系加入到96孔板中，瞬时离心后，把96孔板放入罗氏480仪器里进行反应，具体反应程序如下(表4)：
[0085]
表4荧光定量pcr反应条件
[0086][0087]
7、细胞蛋白提取及定量
[0088]
(1)收集组织及细胞的总蛋白(蛋白裂解的所有步骤均在冰上操作)
[0089]
①
组织：将组织从液氮或-80℃超低温冰箱中取出，放入添加灭菌后的2-3颗磁珠以及适量的细胞裂解液的宽底ep管内，放置于组织研磨仪研磨1min(60赫兹)，重复1次。研磨完毕后，将研磨后的样品转入对应的另一个无菌ep管内(避免吸入磁珠)，室温静置5min，使其充分裂解，以进行下一步rna提取操作。
②
细胞：对于贴壁细胞，先弃上层细胞培养基，用预冷的pbs清洗两遍，根据细胞的数量在每个板孔或细胞皿加入适量的细胞裂解液，室温
静置5min，使其充分裂解。然后用细胞刮刀将细胞收集并装入对应的无菌ep管中，放置于冰上。
[0090]
(2)把收集的细胞裂解样本使用超声波细胞粉碎机超声10次裂解细胞。
[0091]
(3)将超声裂解后的样本放入4℃旋转摇床中，旋转混匀30min，使其充分裂解。
[0092]
(4)裂解完成后，将装有样本的ep管放入预冷的高速离心机，4℃，12000rpm，离心15min。把上清转移干净无菌ep管中(注意避免吸到管底部的沉淀，否则会影响蛋白定量结果)，该上清即为总蛋白裂解液。
[0093]
(5)总蛋白的定量
[0094]
①
本课题采用bca蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量。根据试剂盒说明书的步骤，使用1μg/μl的蛋白标准液配置成不同浓度的蛋白样品绘制拟合曲线。
②
配置bca反应工作液(反应液a：反应液b＝50：1)，每孔加入200μlbca反应工作液。轻柔震荡10s混匀，在37℃生化培养箱中孵育30min。
③
使用epoch酶标仪检测波长为562nm处od值。根据标准品的od值及标准蛋白质量，绘制拟合曲线计算得出线性回归方程(标准曲线)，标准曲线的r值应＞0.99，否则重测。将各样品的od值代入标准曲线即可计算各样品的蛋白浓度。
[0095]
(6)蛋白变性：根据定量结果，使用细胞裂解液配平同一实验各组样本蛋白量，使各组蛋白样浓度一致，并加入5x上样缓冲液(loading buffer)与样品混匀，然后放入金属浴95度，加热10min进行蛋白变性。变性的蛋白样品将进行后续实验。
[0096]
8、蛋白质免疫印迹法(western-blotting)
[0097]
(1)sds-page凝胶配制(gel preparation)：根据目的检测蛋白大小，配制相应浓度的sds-page分离胶以及4％丙烯酰胺的sds-page浓缩胶，充分混匀后，快速灌胶，并在上端加入无水乙醇隔绝空气，室温静置30min待分离胶完全凝固。然后倒出乙醇，用清水冲洗干净，后进行下一步浓缩胶的配制，充分混匀后，快速灌胶，注意避免气泡；然后根据实验需要插入预先洗干净的10孔或15孔的梳子，室温静置1小时，待浓缩胶完全凝固。将配制好的凝胶固定在电泳槽，加入足够的新配的1
×
电泳缓冲液。
[0098]
(2)上样(loading)：根据待测目的蛋白在细胞的蛋白丰度，用移液枪把适量的已变性蛋白样品加入到sds-page凝胶的板孔里，每孔一般加入蛋白样10μg到30μg。每次实验同时预留2个或以上的板孔，加入约3μl-5μl蛋白marker，作为蛋白大小的标志，避免出现目的检测蛋白跑丢的情况，也为后续检测不同大小蛋白条带分离作指示。
[0099]
(3)电泳(running)：蛋白分离的使用电泳仪，其电泳程序设置电压为一般为80v(约30min)，待蛋白marker出现分离后，把电压调至120v(约1小时至1.5小时)，直至目的检测蛋白分离完成。
[0100]
(4)电转(transferring)：蛋白分离完成后，停止电泳，取出电泳胶。将裁剪合适大小的pvdf膜，放入足量的甲醇充分浸泡湿润活化。接着按照经典的western blot“三明治”转膜法，把电泳胶和活化后的pvdf膜按照“黑色转膜夹板-海绵-滤纸-电泳胶-pvdf膜-滤纸-海绵-透明转膜夹板”的结构组合起来，这个过程注意避免气泡的产生。组合完毕后，将转膜夹板放入电转槽内，加入1
×
新配制的预冷转膜液。转膜应在冰浴条件下进行，转膜电泳仪条程序为300毫安，2小时。
[0101]
(5)封闭(blocking)：转膜完成后，将pvdf膜取出放到1
×
洗涤缓冲液(tbst)中，室温洗涤5min，以洗涤干净膜上残留的电转液。接着将pvdf膜置于1
×
tbst配置的5％脱脂牛
奶封闭液中，放置于摇床(65转/min)，室温孵育1到2小时。
[0102]
(6)孵育一抗：封闭结束后，将pvdf膜取出放到1
×
洗涤缓冲液(tbst)中，室温洗涤5min，以洗涤干净膜上残留的封闭液。接着根据不同目的蛋白大小将pvdf膜裁开不同大小的条带，放入抗体孵育槽内，并加入适量对应的一抗(注意需浸没条带，避免pvdf膜变干)。把抗体孵育盒放置于4度摇床上，孵育过夜。
[0103]
(7)孵育二抗：取出pvdf膜，将pvdf膜取出放到1
×
洗涤缓冲液(tbst)中，室温摇床洗涤10min，更换新的1
×
tbst，重复洗涤三次，以洗涤干净膜上残留的一抗。洗涤完毕后，接着将条带放入与一抗对应的种属(抗鼠或抗兔)的二抗溶液中，并放置于摇床(60转/min)室温孵育1小时。
[0104]
(8)显影：取出pvdf膜，将pvdf膜取出放到1
×
洗涤缓冲液(tbst)中，室温洗涤10min，更换新的1
×
tbst，重复洗涤三次，以洗涤干净膜上残留多余的二抗。然后，根据ecl化学发光检测试剂盒说明书，配制ecl化学发光混合液。将pvdf膜放置于ecl化学发光混合液中，孵育45s。使用蛋白印迹用的x胶片及洗片机对蛋白条带进行曝光。
[0105]
9、免疫组织化学
[0106]
(1)组织固定：把组织切片玻片放置于65℃烘箱，孵育3小时。(2)脱蜡：从烘箱把组织切片玻片取出，并把玻片放入装有二甲苯的孵育盒中充分浸没组织，室温浸泡10min后更换新的二甲苯，继续浸泡，共浸泡脱蜡3次。(3)水化：把脱蜡后的切片放入装有乙醇的孵育盒中，进行梯度水化各5min。其具体条件如下：无水乙醇浸泡5min
→
95％乙醇浸泡5min
→
75％乙醇浸泡5min。(4)洗涤：双蒸水浸泡1min，pbs溶液浸泡5min。(5)抗原修复：先用烧杯把配置好的1
×
edta抗原修复液放置微波炉，中高火直至煮沸腾；然后把切片放入烧杯中(加入的抗原修复液必须浸没所有切片，避免干片)，放入微波炉中中低火10min。然后拿出装有切片和抗原修复液的烧杯放置在室温自然降温约1小时。(6)洗涤：双蒸水浸泡1次，每次5min。(7)灭活酶：使用3％过氧化氢浸泡切片，室温避光孵育15min。(8)洗涤：双蒸水浸泡。(9)封闭：使用适量的羊抗血清滴到组织上充分覆盖组织，室温孵育30min。(10)孵育一抗：洗涤，加入合适浓度的足量一抗溶液，滴加到组织上，并把切片放于湿盒中4℃孵育过夜。第二天，把装有孵育一抗的切片的湿盒放入37℃的生化培养箱孵育30min。(11)孵育二抗：洗涤，加入适量的二抗，室温孵育15min。(12)显色：洗涤，滴加适量的dab显色液到组织上，根据不同的抗体，室温显色1～3min。(13)核染色：洗涤，滴加适量的苏木素染料到组织上，进行细胞核染色，待室温浸泡5min后，自来水流动洗涤残留的苏木素染料。(14)反蓝：盐酸酒精浸泡切片2min，流水反蓝。(15)晾干：把染好的切片放置阴凉通风处晾干。(16)封片：待切片组织完全晾干后，滴加适量的树脂到组织上，并盖上盖玻片进行封片，注意避免气泡产生。封片结束后，把片子放置室温通风处晾干。(17)拍照：把封好且晾干的片子取出，放置到显微镜下选取适当的视野拍照。
[0107]
cck8试剂盒检测细胞增殖
[0108]
根据cck8试剂盒检测细胞活性。先在96孔板中接种细胞悬液4000个(100μl/孔)，将细胞培养板放置在37℃，5％co2条件的细胞培养箱中。待细胞贴壁后，加入5μl/孔的cck8溶液，注意加药时不要在孔中产生气泡否则会影响od值的读数。将细胞培养板放回细胞培养箱中孵育3小时后，用epoch酶标仪测定样本在450nm处的吸光度。按照实验设计，连续检测数天。
[0109]
10、平板克隆形成实验
[0110]
(1)种板：按照500个细胞每孔的密度，将细胞接种到六孔细胞培养板中，加入适量的培养基并轻轻晃动细胞板，使细胞分散均匀，并把细胞培养板放置在细胞培养箱中培养7～14天。观察细胞培养板，当培养板孔中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。(2)固定及染色：取出细胞培养板，吸走所有培养基，使用室温的pbs轻柔地洗两遍。吸走所有的pbs，每孔加入0.5％c/v结晶紫/甲醇溶液，室温避光放置15～30min。吸走所有固定/染色液，用流水缓慢洗去固定/染色液后，去掉所有液体，室温通风处晾干。(3)扫描：把平板放置于扫描仪扫描，获得平板克隆形成结果图。(4)计数：应用imagej，计数克隆。
[0111]
11、细胞凋亡检测
[0112]
在本研究中的细胞凋亡检测使用了联科生物的annexin v/pi apoptosis kit试剂盒，详细的操作步骤参考厂家说明书。
[0113]
(1)收集细胞：对待检测的细胞用胰酶进行消化，离心收集1～5
×
105个细胞每反应，用预冷的pbs洗涤两次，离心弃上清；(2)细胞标记：用双蒸水把5
×
binding buffer稀释为1
×
binding buffer，于每个反应管加入500ul的1
×
binding buffer重悬细胞；然后每管细胞悬液各加入5ul annexin v-fitc和10ul pi试剂，轻轻混匀；室温避光静置5min；(3)使用流式细胞仪进行凋亡分析；(4)结果判断：凋亡细胞对pi具有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜完整的细胞和凋亡早期的细胞不会被pi着染而产生红色荧光。因此，在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示为活细胞(fitc-/pi-)；右上象限显示为晚期凋亡和非活细胞即坏死细胞(fitc+/pi+)；右下象限则显示为早期凋亡细胞(fitc+/pi-)。比较晚期凋亡和并早期凋亡的比例。
[0114]
12、细胞划痕实验
[0115]
细胞划痕实验是常见的研究细胞迁移的体外实验方法，具体方法如下。
[0116]
(1)铺板：把结直肠癌上皮细胞种植到6孔板里，细胞密度为过夜能达100％。(2)标记：待细胞完全贴壁伸展后，先用marker笔在6孔板的背后，均匀地划横线。(3)划痕：根据标记，用灭菌的枪头垂直于板背后的划痕线，划出间隙。(4)培养：划痕后，用室温pbs洗细胞3遍，以去掉划下来的细胞，加入无血清培养基，放入37℃，5％co2细胞培养箱继续培养。(5)拍照：按照实验目的把6孔板取出在显微镜下进行拍摄。一般拍取0、24小时。
[0117]
13、细胞外酸化率
[0118]
海马细胞能量代谢检测仪能通过检测细胞的细胞外酸化率(ecar)，反映细胞的糖酵解。具体步骤如下：
[0119]
第一天：(1)铺板：将适量待检测细胞种在24孔的seahorse细胞培养板；预留4个孔(a1、b4、c3、d6)作为空白对照，只加培养基不加细胞。(2)水化探针：取出探针板，每孔加入1ml校准液，避光放置于37℃无co2的培养箱中水化过夜12小时以上。(3)预热仪器：打开仪器电源和电脑控制软件，设置37℃，平衡过夜。
[0120]
第二天：(4)配制检测用培养基：往seahorse base medium中加入l-glutamine(2mm)。把培养基预热至37℃，调节ph至7.4，并用0.22μm的滤膜过滤后使用。(5)换液：从细胞培养箱中取出24孔的seahorse细胞培养板，并先在显微镜下观察，确认细胞状态良好后，吸走细胞培养基，用步骤(4)配制的测试培养基将细胞洗两遍，再往每孔加入450μl测试培养基。放置在37℃无co2的培养箱中孵育1小时。(6)配制药物：用测试培养基稀释药物至工
作浓度10
×
的浓度，其中包括glucose、oligomycin及2-dg。加入glucose后的值代表的是此时细胞的糖酵解能力；oligomycin是atp合酶抑制剂，加入后细胞的氧化磷酸化被抑制，此时细胞完全依赖糖酵解供氧，产酸增加，测得增加的值代表细胞糖酵解的潜力，总数值代表的是细胞最大的糖酵解能力；最后加的2-dg是糖酵解抑制剂。(7)加药：取出水化好的探针板，去掉中间粉色水化辅助板，把步骤(6)配制的药物按照实验说明分别加入到对应的孔中。(8)仪器校准：在seahorse控制软件上设计好程序和板布局，打开进板仓，放入已加好药物的探针板，点击start run按钮，仪器进行校准，这个过程大约需要25min。(9)检测：待仪器完成校准时，仪器会自动弹出底板，取出步骤(5)细胞培养板，取下细胞培养板的盖子，将细胞培养板放入进板仓，并点击continue开始实验。
[0121]
14、耗氧率(ocr)
[0122]
实验步骤与第二章2.1.19细胞外酸化率(ecar)基本相同，不同的是测试培养基的配制及药物的配制。
[0123]
ocr检测与ecar检测不同之处如下。
[0124]
(1)检测培养基的配制：在seahorse base medium中补充glucose(10mm)，sodium pyruvate(1mm)，l-glutamine(2mm)。预热至37℃，调节ph至7.4，用0.22μm的滤膜过滤。(2)配制药物：用测试培养基稀释药物至工作浓度10
×
的浓度，其中包括oligomycin a、fccp及antimycin a+rotenone。oligomycin是一种atp合酶抑制剂；fccp是一种解偶联剂，它能使得大量质子回流，但这种质子回流并不能形成atp，加入fccp后细胞内耗氧的增加，代表线粒体的最大耗氧能力；antimycin a和rotenone是呼吸链抑制剂，加入后完全阻止线粒体耗氧。
[0125]
15、非靶代谢物测定
[0126]
我们选取了doxycycline诱导沉默hct116稳定细胞株，按照非靶代谢物测定样本制备的要求，收集了不加doxycycline的hct116细胞(对照组)及加入doxycycline诱导72小时的hct116细胞(处理组)各6份，外送到中科新生命公司执行高分辨非靶向代谢组学分析项目，该检测项目采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪(uhplc-q-tof ms)进行检测样本中的代谢物。获取代谢物的定性和定量数据后，进行进一步的数据分析。
[0127]
16、免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation，co-ip)
[0128]
16.1内源性免疫共沉淀实验
[0129]
(1)预冷的pbs将细胞洗两次。(2)加入600μl(10cm培养皿)含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，用细胞刮轻轻刮下细胞，用注射器吹吸30次，冰上裂解30min。(3)把样品放置4℃预冷离心机，以12000rpm转速离心15min。(4)离心结束后，收集上清至新的1.5ml ep管，吸出50μl到一个新的ep管保留作为全细胞的对照(input)，剩下的部分加入5μg抗体或相同种属的igg。(5)把ip样品放置4℃旋转摇床，过夜充分结合。(6)第二天，把20μg proteina/g agarose加入到ip样品中，继续在4℃旋转摇床孵育4小时。(7)孵育结束后，把装有ip样品和proteina/g agarose的ep管，放置4℃预冷离心机以12000rpm转速离心30s，弃上清，用预冷的ip裂解液洗4次。(8)最后去掉所有上清，加入40μl 2
×
sds loading buffer，98℃煮10min，用于蛋白免疫印迹实验。
[0130]
16.2外源性免疫共沉淀实验
[0131]
(1)根据实验目的，把相应质粒瞬时转染到细胞内，培养48小时。(2)转染48小时
后，收集细胞，具体细胞裂解步骤同3.1.6.1内源性免疫共沉淀。(3)从蛋白样品中取出50μl作为全细胞对照，剩下按照用来质粒的蛋白标签加入40μl相应珠子(anti-flag m2 beads或anti-myc免疫磁珠)，4℃旋转过夜孵育。(4)第二天孵育结束后，把样品放置4℃预冷离心机以12000rpm转速离心30s，弃上清，用预冷的ip裂解液洗4次。(5)最后去掉所有上清，加入40μl 2
×
sds loading buffer，98℃煮10min，用于蛋白免疫印迹实验。
[0132]
17、lc-ms/ms
[0133]
我们在hek293t细胞中瞬时转染质粒pcmv5-flag-eif3f，转染48小时后收集细胞，应用co-ip的方法获得与eif3f蛋白相互作用的蛋白样品，然后把样品送中科新生命公司进行蛋白质谱分析技术(lc-ms/ms)获得与eif3f相互作用的蛋白谱。
[0134]
18、邻位连接技术(proximity ligation assay，pla)
[0135]
pla技术是主要用于检测蛋白间的相互作用，通过加入一段分别与连接在抗体上的dna互补的连接寡聚脱氧核苷酸(pla probe)识别目的蛋白。当这两个探针识别目的蛋白后，如果这两个探针之间的距离足够靠近就会产生了邻近效应(proximity)，两个pla probe上的dna就会通过碱基互补配对作用，在连接酶的作用下，pla probe上的片段dna连接形成一条新的dna片段。通过pcr扩增的方法放大信号，并应用荧光显微镜分析。本研究采用in situ red小鼠/兔启动装试剂盒(sigma-aldrich，duo92101)。
[0136]
a.一抗反应。使用抗鼠或抗兔的特异性抗体孵育固定后的细胞。b.二抗(pla probe)反应。加入带有探针的抗鼠和抗兔的二抗进行孵育。c.连接。通过酶连反应把相邻的两个探针连接起来。d.扩增。通过扩增反应把pla的信号放大。
[0137]
按照试剂盒的protocol操作，具体步骤如下。
[0138]
第一天
[0139]
(1)铺板：把待检测细胞种到共聚焦应用细胞培养皿中，细胞密度约为20～30％。
[0140]
(2)固定：待细胞完全贴壁且铺展开后，把细胞培养基移除，用pbs洗涤2遍；吸掉所有pbs，加入4％多聚甲醛(pfa)放置室温固定10min。(3)通透：固定结束后，吸掉素有pfa，加入pbs放置水平摇床洗5min。吸掉所有pbs，加入含有0.5％triton-100的pbs洗涤液，室温孵育10min。(4)封闭：通透完成后，用含有0.05％tween-20的pbs洗涤液洗3遍，每遍5min。清洗完毕后，吸掉所有pbs洗涤液，加入1滴封闭液(duolink ii)到培养皿上均匀覆盖细胞，把培养皿放到湿盒并放置37℃温箱孵育1小时。(5)稀释一抗：用抗体稀释液稀释一抗，反应用浓度为一抗：抗体稀释液为1：100。(6)一抗孵育过夜：封闭结束后，去掉所有封闭液，把一抗稀释液加入到细胞皿中，4℃孵育过夜。
[0141]
第二天
[0142]
(7)稀释带有pla probes的二抗：按照说明书稀释pla probe(anti-rabbit)二和pla probe(anti-mouse)二抗，准备后续应用。(8)孵育二抗：将步骤(6)的细胞板取出，用duolink ii wash buffer a室温洗涤2遍，每遍5min。洗涤结束后，吸掉所有洗涤液，加入步骤(7)的二抗，放置于37℃孵育1小时。(9)连接反应：用超纯水稀释duolink ii ligation stock反应试剂，并加入ligase enzyme(1：40)。取出步骤(8)的细胞板，用duolink ii wash buffer a室温洗涤2遍，每遍5min。洗涤结束后，吸掉所有洗涤液，加入含有ligase enzyme的duolink ii ligation试剂，放置于37℃孵育30min。(10)扩增反应：配制扩增用试剂。把步骤(9)的细胞板取出，用duolink ii wash buffer a室温洗涤2遍，每遍3min。洗涤结束
后，吸掉所有洗涤液，加入扩增用试剂，放置于37℃孵育100min，这一步及后续实验注意全程避光。(11)染核：扩增反应结束后，取出步骤(10)的细胞板，用duolink ii wash buffer b室温洗涤10min。吸掉所有洗涤液，加入1滴0.1
×
duolink ii wash buffer b，迅速吸掉洗涤液，加入duolink ii mounting medium+dapi，室温避光孵育15min。(12)拍照：使用共聚焦显微镜进行拍摄。pla信号的吸收光波长为594nm，激发光波长为624nm。
[0143]
19、免疫荧光实验(immunofluorescence)
[0144]
(1)应用doxycycline诱导沉默eif3f细胞株，加入doxycycline(100μg/ml)诱导沉默eif3f基因72小时后，吸走培养基，使用无菌的预冷pbs洗涤液(1ml/皿)洗涤5min，共洗两次。(2)固定：洗涤完成后，吸走所有的pbs液，加入1ml/皿体积的4％多聚甲醛(通风橱操作)并放置室温固定15min后，小心吸走多聚甲醛，使用无菌的pbs洗涤液(1ml/皿)洗涤3次，每次5min。(3)透膜：小心地吸走所有的pbs液，加入0.3％的tritonx-100(现配现用，200μl/皿)通透6～8min，然后用pbs液洗涤3次，每次5min。(4)封闭：小心地吸走所有pbs液后，加入5％bsa封闭液。如果目的蛋白在核内，则透膜+封闭一起：0.3％tritonx-100+5％bsa+0.1％tween 20(在pbs中体积占比)，室温孵育1小时。(5)一抗孵育：加入1％bsa(tbs)稀释目的抗体并把细胞皿放入湿盒以防止液体挥发，在4℃条件下对细胞孵育过夜。(6)二抗孵育：吸走所有的抗体，用pbs洗涤3次，每次5min。小心地把所有pbs吸干净。并在避光条件下加入1％bsa(pbs)稀释的带荧光标签的二抗，避光室温孵育30min～1小时。(7)核染色：吸走所有的二抗，用pbs洗涤3次，每次5min。小心地把所有pbs吸干净。加入dapi(1：1000)进行核染色，避光室温孵育5min。(8)拍照：使用pbs洗涤3次，每次5min。然后加入pbs(1ml/皿)以防止细胞干燥。避光保存并通过共聚焦显微镜观察。
[0145]
20、cycloheximide(chx)处理细胞研究蛋白降解速率
[0146]
cycloheximide(放线菌酮)是一种真核生物蛋白质合成(protein synthesis)抑制剂，加入chx处理细胞后，细胞内的新生蛋白合成被阻遏，因此按照chx处理的不同时间点的已合成蛋白剩余量，可以描出已合成蛋白的降解速率。实验方法如下。
[0147]
(1)将细胞接种到6孔细胞培养板中，加入doxycycline诱导沉默eif3f在64～69小时后，此时对照组细胞密度达到约80％左右时即可进行。(2)根据实验要求设计的时间梯度，逆时间梯度分别加入新鲜配置的包含100μg/ml chx的完全培养基。(3)待所有处理时间结束后立即弃掉细胞培养基，用预冷的pbs洗两遍，以洗掉残留的培养基。然后把细胞培养板放在冰上，往每个板孔内加入适量的蛋白裂解液，轻轻晃动使细胞裂解液铺满细胞培养板孔底部，冰上静置5min后，用干净的细胞刮把细胞培养板孔中预裂解的所有细胞刮下至培养皿的一侧，用移液枪把包含有细胞的蛋白裂解液转移到新的ep管中，以进行后续的蛋白提取、定量及western blot实验。
[0148]
21、mg132处理鉴定目的蛋白通过蛋白酶体降解途径
[0149]
mg132是一种具有细胞透性的蛋白酶体抑制剂，能抑制蛋白通过蛋白酶体途径的降解。具体实验方法如下。
[0150]
(1)将细胞接种到6孔细胞培养板中，放置细胞培养箱常规培养约48小时，待细胞密度达到约80％左右时即可进行。(2)根据实验要求设计的加入新鲜配置的包含10～50μm浓度的mg132的完全培养基，继续培养6小时。(3)弃掉细胞培养基，用预冷的pbs洗两遍，然后把细胞收集起来以进行后续的蛋白提取、定量及western blot实验。
[0151]
22、his-ubiquitin泛素化实验
[0152]
(1)将细胞接种到100mm细胞培养皿，贴壁后在细胞密度达到60％左右进行转染。(2)根据实验设计，应用pei转染试剂，把目的质粒和his-tag的泛素分子质粒同时转染到细胞中，这个过程在无血清培养基环境中进行。(3)无血清转染6小时后，弃掉培养基，换成完全培养基，继续培养42小时。(4)加入适当浓度的mg132处理细胞约6～8小时，然后用胰酶消化细胞，把细胞收集到新的15ml离心管里，800rpm离心3min；去掉培养基，用预冷的pbs溶液洗涤一遍，再放置离心机中以800rpm转速离心3min；去掉pbs溶液，用1ml的pbs溶液把细胞重悬，预留50μl细胞悬液放置新的ep管里做后续蛋白定量及input，剩下的950μl细胞悬液放置在另一个新的ep管中做后续的泛素化实验。(5)把待进行泛素化实验的细胞放置4℃预冷的离心机中，以4000g转速离心5min后，去掉pbs，加入1ml的buffer a试剂重悬细胞，然后使用超声细胞粉碎仪把细胞悬液进行超声(功率45％，启动2s停2s，共2min)以充分裂解细胞；超声结束后，把ep管放入4℃预冷的离心机中，以12000rpm转速离心5min；离心结束后，把上清转移到新的ep管内，待进一步实验。(6)把预留的50μl细胞悬液放置4℃预冷的离心机中，以4000g转速离心15min后，弃掉pbs，把ep管放置在冰上，并加入50μl的蛋白裂解液把细胞重悬，然后使用超声细胞粉碎仪超声细胞若干次，把裂解的细胞悬液放置冰上充分裂解15min；然后把ep管放置4℃预冷的离心机，以12000rpm转速离心15min；离心结束后，取出新的ep管，把上清(包含蛋白的裂解液)转移到新的ep管中，进一步的bca定量。(7)根据步骤(6)的蛋白定量，调整步骤(5)的样本体积，使得所有样本的总蛋白量一致，并把调整后的样本转移到新的ep管中，用buffer a补齐体积。(8)取适量的ni-nta珠子，用buffer a预洗3遍，然后往步骤(7)的样本中加入40μl/管的ni-nta珠子，然后把ep管放置4℃冰箱的旋转摇床，充分反应过夜。(9)取出步骤(8)的样品，放置在4℃离心机以12000g转速离心2min。(10)离心去掉上清，加入buffer a洗4遍。(11)离心去掉上清，准备buffer ti，配制buffer a/buffer ti(1:3)混合液洗，用混合液洗4遍。(12)离心去掉上清，加入buffer ti洗2遍。(13)离心尽量去掉所有上清，加入50μl 2
×
sds loading buffer，98℃煮10min，用于蛋白免疫印迹实验。
[0153]
buffer a的组分
[0154][0155]
buffer ti的组分
[0156][0157]
23、ha-ubiquitin泛素化实验
[0158]
(1)转染：细胞内瞬时转染相应的质粒及ha-ubi质粒，继续培养48小时后，加入mg132处理6小时。(2)裂解细胞：用预冷的pbs洗细胞2次，加入预冷的细胞裂解液冰上裂解5min后，用干净的细胞刮把培养皿上的细胞收集下来到一个新的ep管中，放置冰上继续裂解30min。(3)离心：裂解完成后，把ep管放到4℃离心机中以12000rpm转速离心15min。(4)将上清转移到新的ep管里，吸出50μl留作全细胞input，其余加入anti-flag m2 beads(sigma)到ep管里，放置4℃旋转摇床孵育过夜。(5)孵育过夜后，把ep管放到4℃预冷的离心机中以12000rpm转速离心30s。用预冷的细胞裂解液洗涤4次。(6)蛋白变性：吸掉所有上清，加入50μl 2
×
loading buffer混匀，98℃煮10min，取上清做后续的蛋白质印迹实验。
[0159]
24、丝氨酸回补实验
[0160]
丝氨酸是肿瘤细胞增殖迁移所需要的重要氨基酸。在第二章节中，我们证实了沉默eif3f能够抑制结直肠癌细胞的增殖。因此，在本章节，我们采用了丝氨酸回补实验，检测丝氨酸的回补能否逆转eif3f下调所引起的结直肠癌细胞的增殖抑制，运用了incucyte zoom长时间动态活细胞成像系统检测了这一效应。具体方法如下。
[0161]
(1)诱导eif3f沉默：把强力霉素诱导plko-tet-on-sheif3f稳定表达的hct116细胞种植在6孔板中，设计2个孔(a1,b1)不加doxycycline，另外2个孔(a2，b2)加入doxycycline诱导沉默eif3f，处理48小时。(2)丝氨酸回补：在其中孔a2和b2中加入丝氨酸到培养基，把6孔板放到incucyte zoom长时间动态活细胞成像系统平台，继续培养，并检测细胞密度以反应细胞的增殖情况。
[0162]
25、细胞内sam检测
[0163]
s-腺苷甲硫氨酸(sam)是sgoc通路中的其中一个代谢产物，它在各种生物的甲基化过程中起着至关重要的作用，参与到dna和蛋白质的共价修饰当中。sam水平的变化与肿瘤发展密切相关。本研究采用s-adenosyl methionine(sam)fluorescence assay(mediomics，1-1-1003b)试剂盒，对细胞内的sam进行测定。它的实验原理是在配体s-腺苷蛋氨酸的存在下，具有dna序列特异性的metj蛋氨酸抑制蛋白对其特异的dna结合位点的亲和力大大增加；metj共识序列是由两个近似相等的dna“半位点”组成，其中一半的片段用荧光素标记，而另一半的片段用645荧光团标记。基于样品中sam相对含量会影响dna-metj蛋白复合物的形成量。因此，当这种复合物形成时，它能使荧光标记的dna半位点接近另一半的片段，并导致荧光信号发射量变化，然后使用酶标板阅读器测量，其中吸收光波长为485nm；激发光波长为665nm，最后使用sam标准曲线就能测定测试样品中的sam浓度。参照试剂盒的protocol，具体操作步骤如下。
[0164]
(1)提取细胞内的sam
[0165]
①
解冻缓冲cm，室温保存。
②
收集待测细胞，室温条件以2300rpm转速离心5min。
③
用预冷的pbs重悬细胞，计数5
×
104个细胞到新的ep管中。
④
离心去掉上清，加入30μl的cm缓冲液重悬步骤
③
已计数的细胞，放置于24℃的条件孵育细胞1小时，孵育期间可以震荡涡旋ep管以充分裂解细胞并释放sam。
⑤
细胞裂解结束后，把ep管放置预冷的4℃离心机中以10000
×
g转速离心5min，收集上清液用于sam分析。
[0166]
(2)检测sam量
[0167]
⑥
用buffer s缓冲液按1:5稀释稀释步骤
⑤
收集的样品(10μl样品+40μl buffer s缓冲液)；用buffer s缓冲液按1:5稀释将cm缓冲液稀释制备阴性对照。
⑦
取步骤
⑥
的稀释
的样品和阴性对照各10μl分别加入96孔板中，并在每个反应孔中加入90μl sam测定液，用移液枪轻轻吹打混匀，避免出现气泡。
⑧
把96孔板盖上铝箔，然后放在室温孵育30min，避免光线直射。
⑨
反应结束后，使用荧光酶标仪读取96孔板中的荧光信号强度(设置:激发～485nm；发射光谱～665nm)。
[0168]
26、细胞内nadph生成的检测
[0169]
本研究采用nadp/nadph-glo
tm
assay kit(promega,g9081)试剂盒，其实验原理为nadp cycling enzyme能催化底物生成nadp cycling product，同时将nadp+转换成nadph；reductase能催化底物生成luciferin，同时将nadph转变为napd+。luciferin可在luciferin detection reagent加入后消耗atp氧化发光。通过检测光信号可得知nadp+和nadph含量。根据氧化型的napd+在碱溶液中加热不稳定，而还原型nadph在酸性溶液中不稳定，本实验将同一份样品分为两份，分别用碱性溶液或酸性溶液来处理，然后测得其中一种的含量进行计算分析。按照试剂盒的实验步骤对细胞内nadph及nadp的量进行检测。具体操作步骤如下。
[0170]
(1)按试剂盒的说明书配制nadp/nadph-glo detection reagent等试剂。(2)收集细胞，离心去掉培养基，用pbs重悬，取100μl细胞悬液，加入100μl base solution和1％(质量)的dtab裂解细胞。(3)将裂解后的细胞样品平均分为两份，分别进行nadph或nadp+的定量。(4)nadph定量：60℃加热15min，室温孵育10min，再加入100μl hcl/trizma solution进行中和。(5)nadp+定量：加入50μl 0.4n hcl，60℃加热15min，室温孵育10min，加入50μl trizma base进行中和。(6)取中和后的样品，分别加入96孔酶标板，每孔50μl，每个样品设3个复孔。再每孔加入50μl nadp/nadph-glo detection reagent，用酶标仪检测发光值。最后将每组的碱处理样品的发光值除以酸处理样品的发光值得到nadph/nadp+的比值。
[0171]
27、[u13-c]葡萄糖示踪实验
[0172]
本研究通过采用[u13-c]葡萄糖特殊培养基，研究沉默eif3f后结直肠癌细胞内代谢流的改变。实验方法主要包括细胞代谢物的提取，提取完成后外送检测。代谢物提取的具体方法如下。
[0173]
(1)将细胞均匀地接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入或不加入doxycycline处理诱导沉默eif3f 48小时后，将细胞培养基换成含有[u13-c]葡萄糖的特殊培养基，继续培养24小时。(2)移除所有培养基，用预冷的pbs洗涤细胞2遍。(3)往6孔板中加入提取预冷的80％甲醇溶液，并用干净的细胞刮把细胞刮下，收集到新的1.5ml ep管中。(4)把步骤(3)的ep管放置4℃预冷的离心机以12000rpm转速离心15min，小心吸取上清转移到新的1.5ml ep管，作后续送检。
[0174]
28、小鼠皮下荷瘤实验
[0175]
本研究使用表达plko-tet-on-sheif3f的hct116细胞株进行小鼠皮下成瘤实验。首先，把5周零左右的balb/c裸鼠随机分为两组，在每只小鼠右侧皮下种植1
×
106个hct116细胞。种植后第三天开始给药，对照组腹腔注射pbs，实验组腹腔注射doxycycline(50mg/kg)，每3天给一次药。每三天测量一次肿瘤大小(记录最长径l和最短径w)和体重，其中小鼠的荷瘤直径不超过1.5cm，若小鼠出现体重减轻达20％～25％或出现恶液质时终止实验。
[0176]
29、病人来源的异种移植模型(patient-derived xenograft，pdx)
[0177]
(1)手术器材准备：
[0178]
①
手术器械：灭菌的剪刀、镊子、持针器、缝合针线等。
②
试剂：无菌的pbs、碘伏、戊巴比妥钠溶液。
③
其他材料：胰岛素针、消毒棉签、胶布、纱布、恒温保温平台等。
[0179]
(2)pdx操作步骤：
[0180]
①
麻醉：腹腔注射戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)给ncg小鼠进行麻醉。
②
准备肿瘤组织：将结直肠癌患者的新鲜肿瘤组织切成直径约3mm3大小的块状。
③
备皮：使用剃毛器把小鼠手术部位剃干净毛发，以充分暴露手术视野。
④
消毒：使用碘伏对手术部位进行消毒。
⑤
种植：用手术剪将手术部位皮肤剪出一个0.5cm小口；用镊子把切好的肿瘤组织种植于小鼠皮下，缝合好伤口，并用碘伏消毒。将小鼠放置40℃恒温保温板加速复温和苏醒。
⑥
待肿瘤长至大小约50mm3时，把小鼠进行分组；对照组腹腔注射vehicle，实验组腹腔注射nct-503(40mg/kg)。
[0181]
30、tunel细胞凋亡检测
[0182]
本课题采用tunel细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)对pdx肿瘤的石蜡切片进行染色，然后通过荧光显微镜检测呈现绿色荧光的凋亡细胞。tunel细胞凋亡检测的原理是，当细胞发生凋亡时，细胞内会有一些dna内切酶被激活，激活后的内切酶能切断核小体间的基因组dna。断裂的dna暴露的3
’‑
oh可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上绿色荧光探针标记的dutp，从而可以通过荧光显微镜进行检测。
[0183]
具体步骤如下：
[0184]
(1)脱蜡：把石蜡切片放入二甲苯中脱蜡5min，共脱蜡两次。然后依次放入无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2min，ddh2o 2min。(2)滴加20μg/ml不含dnase的蛋白酶k，放置37℃处理30min。(3)用pbs洗涤3次，每次5min。(4)配制tunel检测液：根据试剂盒的说明书，把适量的tdt酶、荧光标记液配制成tunel检测液。(5)在样品上加入适量体积的tunel检测液，37℃避光孵育1小时。(6)孵育结束后，用pbs避光洗涤3次，每次5min。(7)滴加dapi到样本上，加上盖玻片，避光孵育5min。(8)使用荧光显微镜观察，激发光波长为450-500nm，发射波长为515-565nm(绿色荧光)。
[0185]
31、组织微阵列分析(tissue micro-array，tma)
[0186]
组织微阵列，也称组织芯片，是将多个不同个体的组织标本以规则的阵列方式排布在同一个载玻片上，进行同一指标的原位组织学的研究。本实验采取了上海芯超生物科技有限公司的结直肠肿瘤组织芯片(阵列编号：hcola180su16)，对eif3f和下游靶蛋白phgdh进行了免疫组化的染色并分析它们在结直肠肿瘤中的表达。我们运用了halo病理分析软件对tma的每个组织的免疫组化染色进行了评分。
[0187]
32、统计学处理
[0188]
应用ibm spss statistics版本25或graphpad prism 8.0(california,usa)软件进行统计分析，数据均采用均数
±
标准差表示。统计方法上，定性资料采用卡方检验或wilcoxon检验，定量资料采用student's t检验来分析组间差异的显著性。利用kaplan-meier分析检验生存预后。表达高低分组的分界线是基于roc曲线分析。所有统计分析，p值《0.05被认为有显著统计学差异。
[0189]
实验结果
[0190]
1eif3f在结直肠癌组织高表达且与不良预后相关
[0191]
通过gse41258、gse77953及gse9348等多个结直肠癌的数据库检索了eif3f在结直
肠癌和癌旁组织中的表达。结果发现结直肠癌组织中eif3f的mrna水平显著高于正常的癌旁组织(图1)。这些结果提示了eif3f的表达在结直肠癌组织中显著升高。
[0192]
图1中，gse41258数据库中eif3f在186例结直肠癌组织和54例正常组织中的表达水平，gse77953数据库中eif3f在28个结直肠癌组织和13个正常组织中的eif3f表达水平，gse 9348数据库中eif3f在70个结直肠癌组织和12个正常组织中的eif3f表达水平。p《0.05有统计学意义，t检验。
[0193]
为了进一步验证这一发现，我们从中山大学附属第六医院收集了26个结直肠癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织，通过对组织提取rna并使用qrt-pcr的方法，检测了eif3f基因的mrna的表达水平。qrt-pcr的结果和数据库的发现一致，结直肠癌组织中eif3f基因具有较高的mrna表达，并且明显高于配对的正常的癌旁组织(图2)。
[0194]
1.1eif3f在结直肠癌细胞中相对正常细胞整体高表达
[0195]
我们利用qrt-pcr和western blot验证eif3f在各个结直肠癌细胞株的mrna表达水平和蛋白表达水平。qrt-pcr的结果显示，eif3f在常见的多株结直肠癌细胞中呈现整体高表达(图3)。在蛋白表达水平上，我们使用了image j软件对western blot条带进行了灰度分析，获得相对定量的蛋白表达水平。western blot的分析结果显示，eif3f在结直肠癌细胞rko、hct116、hct-8、hct-15、caco2、dld-1及sw620中呈现显著高表达；在widr和sw480细胞株中相对中度表达；在正常结肠上皮细胞ncm460中表达最低(图4)。
[0196]
1.2eif3f的高表达与结直肠癌患者的不良预后相关
[0197]
前面我们发现eif3f在结直肠癌肿瘤组织中的表达异常升高。为了进一步探究eif3f的表达是否与结直肠癌预后的关系，我们进一步分析了公共数据库gse71187和gse41258中结直肠癌患者的生存预后与eif3f表达的关系。结果发现，eif3f的高表达与结直肠癌患者的不良预后显著相关，eif3f高表达的crc患者存活率低(图5)。
[0198]
1.3结直肠癌组织微阵列的免疫组化染色显示eif3f在肿瘤组织中表达升高
[0199]
随后，为了验证eif3f在结直肠癌组织的蛋白水平，我们使用了包含108例结直肠癌患者的肿瘤组织微阵列的片子(tissue micro-array,tma)，使用免疫组化的方法(immunohistochemistry，ihc)对eif3f蛋白的表达进行了检测(图6a)。染色结果通过halo病理软件分析各组织的h-score，得出eif3f在肿瘤和配对正常组织的表达评分。结果显示，eif3f在结直肠癌组织的表达整体比正常的组织要高(图6b)。此外，71对结直肠癌肿瘤组织与配对癌旁正常组织的免疫组化分析结果显示，结直肠癌肿瘤组织中的eif3f蛋白的染色评分也显著高于配对的癌旁正常组织(图6c)。
[0200]
2eif3f影响结直肠癌细胞的体外增殖、迁移及凋亡
[0201]
2.1eif3f可以调控结直肠癌细胞的增殖
[0202]
肿瘤细胞的增殖失控是肿瘤最基本的生物学特征之一。我们应用强力霉素(dox)诱导plko-tet-on-sheif3f稳定表达的结直肠癌细胞株hct116和rko，进一步探索沉默eif3f对体外细胞活力的影响。我们使用cck8细胞活力检检测方法研究沉默eif3f后对hct116细胞及rko细胞体外增殖的能力的影响。结果显示，沉默eif3f可以抑制hct116细胞和rko细胞的增殖(图7和图8)。
[0203]
接着，我们进一步使用了平板克隆形成实验，检验沉默eif3f对结直肠癌细胞的克隆形成能力的影响。克隆形成是检测接种细胞后，贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，也是
评价细胞活力的方法。在所有组中，将500个细胞接种在6孔板中，并用或不用多西环素处理约7-10天。然后用4％多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫溶液染色。通过图像j对菌落进行计数。数据以平均值
±
标准差表示。p《0.05有统计学意义，t检验。实验结果与前面的相一致，沉默eif3f抑制hct116细胞和rko细胞的克隆形成(图9和图10)。
[0204]
同时，我们在hct116细胞中通过慢病毒感染的方法构建了plvx-flag-eif3f质粒稳定表达的结直肠癌细胞，进行细胞克隆能力的检测。将500个细胞接种在6孔板中约7-10天。然后用4％多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫溶液染色。通过图像j对菌落进行计数。数据以平均值
±
标准差表示。p《0.05有统计学意义，t检验。结果显示，过表达eif3f能促进hct116的体外增殖和克隆形成(图11)。
[0205]
2.2沉默eif3f基因可以抑制结直肠癌细胞的迁移
[0206]
除了细胞增殖失控外，肿瘤转移也是恶性肿瘤最基本的生物学特征之一。为了评价eif3f的表达对肿瘤细胞恶性程度的影响，我们使用了划痕实验的方法，检验沉默eif3f对肿瘤细胞迁移的影响。在所有组中，将细胞接种在经或未经强力霉素处理48小时的6孔板中。当每个孔中的细胞汇合达到100％时，根据指示的线制作伤口，并用无血清培养基培养细胞。在治疗后0小时和24小时拍摄图像。比例尺代表100μm。实验结果发现，沉默eif3f能抑制hct116细胞和rko细胞的迁移(图12和图13)。
[0207]
2.3沉默eif3f基因可以诱导结直肠癌细胞的凋亡
[0208]
增殖失控和转移都是肿瘤进展的重要标志，它们涉及许多因素如细胞的凋亡、肿瘤细胞代谢异常等，这些因素的异常起着关键的调控作用。促进肿瘤细胞凋亡、消除癌细胞一直是临床肿瘤学上治疗和研究的目标。因此，我们在强力霉素诱导表达plko-tet-on-sheif3f的稳定结直肠癌细胞中，使用或不使用强力霉素处理72小时以诱导沉默eif3f，并应用pe/annexin-v对细胞进行染色处理，然后用流式细胞检测技术分析对照组和沉默eif3f后细胞的凋亡比例。结果显示，沉默eif3f可以增加hct116细胞和rko细胞的凋亡比例(图14和图15)。
[0209]
2.4沉默eif3f基因可以损伤结直肠癌细胞的耗氧能力和糖酵解能力。
[0210]
肿瘤细胞代谢重建也是肿瘤生物学标志之一。在肿瘤的发生发展过程中，细胞内通常会发生代谢途径异常改变，以满足肿瘤细胞无限增殖和快速发展的需求。肿瘤细胞的代谢重建还会影响肿瘤的增殖、复发、转移等。接着，我们利用细胞能量代谢检测仪检测沉默eif3f对结直肠癌细胞耗氧能力(oxygen consumption rate，ocr)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate，ecar)的影响。
[0211]
我们在强力霉素诱导plko-tet-on-sheif3f稳定表达的结直肠癌细胞中，使用或不使用强力霉素处理48小时，然后将细胞重新种植到seahorse的24孔细胞板中，按照实验说明加入特定的药物，进行后续的氧气消耗率(ocr)和胞外酸化率(ecar)的检测实验。结果显示，沉默eif3f可以降低hct116细胞和rko细胞的线粒体氧消耗速率，损伤hct116细胞和rko细胞的耗氧能力(图16)；此外，沉默eif3f也降低hct116细胞和rko细胞的细胞外酸化率，损伤了hct116细胞和rko细胞的糖酵解能力(图17)。这些结果提示了，沉默eif3f可能影响结直肠癌细胞的代谢。
[0212]
3eif3f调控phgdh蛋白稳定性
[0213]
3.1eif3f蛋白与phgdh蛋白存在蛋白-蛋白相互作用
[0214]
我们首先在hct116细胞和rko细胞进行免疫荧光实验，探索eif3f和phgdh在细胞内的亚定位。实验结果发现，eif3f和phgdh都存在细胞质中，它们在亚细胞定位上存在共定位，这为eif3f与phgdh之间的相互作用提供了空间基础(图18)。
[0215]
接着，我们设计了pla实验及内源的免疫共沉淀实验，验证胞内的eif3f是否与phgdh存在蛋白间相互作用。pla实验结果显示，在hct116细胞中，eif3f主要与胞质的phgdh蛋白相互结合(图19)；内源性免疫共沉淀实验结果显示，eif3f能与phgdh结合(图20)。
[0216]
3.2过表达eif3f上调phgdh表达，沉默eif3f降低phgdh的表达
[0217]
为了进一步验证eif3f对phgdh蛋白的表达是否有调控，我们进行了免疫印迹实验，分析了在结直肠癌细胞中过表达eif3f质粒或沉默eif3f表达对phgdh表达的影响。western blot结果显示，过表达eif3f能增加phgdh的蛋白水平，并且随着eif3f的表达量增加，phgdh的蛋白表达越多(图21a)；同样的，沉默eif3f能够抑制phgdh的蛋白表达，并随着eif3f表达越少，phgdh的表达下降越多(图21b)。
[0218]
3.3eif3f蛋白能延长phgdh的半衰期并调控phgdh的蛋白酶体降解途径
[0219]
已有研究发现eif3f具有去泛素化酶的功能，能够下调与它相互作用的底物的泛素化水平，前面我们已经证实了eif3f与phgdh存在相互结合，因此我们假设phgdh是否为eif3f的一个去泛素化底物，eif3f是否能影响phgdh的泛素化水平。为了进一步验证假设，我们设计了chx处理实验探索沉默eif3f对phgdh蛋白的降解速率的影响。按照实验设计，我们在指定的时间加入chx药物处理，收集细胞裂解液并通过western blot的方法检测chx处理各时间点的phgdh蛋白水平，从而计算出phgdh的蛋白半衰期。chx的实验结果显示，在hct116和rko细胞中，沉默eif3f能缩短phgdh半衰期，加速phgdh蛋白的降解(图22)。
[0220]
我们设计了mg132处理实验验证eif3f是否能调控phgdh蛋白的蛋白酶体降解。mg132是一种具有细胞透性的蛋白酶体抑制剂，能抑制蛋白通过蛋白酶体途径的降解。免疫印迹实验结果显示，在hct116细胞和rko细胞中，沉默eif3f能下调phgdh的表达，mg132处理能补救这一效应(图23)。
[0221]
3.4eif3f能调控phgdh的泛素化
[0222]
为了进一步验证eif3f是phgdh的一个去泛素化酶，我们设计了泛素化实验探索eif3f对phgdh的泛素化水平的影响。我们首先检测结直肠癌细胞中，沉默eif3f后内源性的phgdh泛素化水平的变化。按照实验设计，先加入强力霉素诱导eif3f的沉默24小时后，瞬时转染his-ubi质粒，并在转染42小时后，加入mg132处理6小时，收集样本，应用nickel beads做免疫共沉淀，把泛素化的蛋白富集起来，通过western blot的方法检测phgdh的泛素化水平。结果显示，在结直肠癌细胞中，沉默eif3f蛋白表达后，phgdh的泛素化水平显著增加(图24)。接着，我们进一步检测外源性表达的泛素化实验来验证这一结果。我们在hek293t细胞株中同时过表达pcdna3.1-flag-eif3f、pcdna3.1-ha-phgdh及his-ubiquitin，同样应用nickel beads做免疫共沉淀，把泛素化的蛋白富集起来，通过western blot的方法检测ha-tag的phgdh蛋白的泛素化水平。实验结果表明，随着eif3f的表达增多，phgdh的泛素化水平逐渐降低，这说明了eif3f能够降低phgdh的泛素化水平，从而稳定phgdh蛋白，并且这种效应呈剂量作用(图25)。我们的ha-ubi泛素实验发现，eif3f能够下调野生型的泛素分子ha-ubi或ha-ubi k48的泛素分子连接的phgdh蛋白的泛素化水平，但无法下调ha-ubi k63的泛素分子连接的phgdh的泛素化水平，这表明eif3f能够去泛素化k48连接的phgdh蛋白的泛素
化，从而抑制phgdh蛋白酶体降解(图26)。
[0223]
4eif3f-phgdh-sgoc轴调控结直肠癌的发生发展
[0224]
4.1组织微阵列分析显示eif3f表达与phgdh表达具有正向相关
[0225]
为了验证eif3f与phgdh在结直肠癌中的关系，我们对结直肠癌组织微阵列(tma)进行了免疫组化的染色。免疫组化染色结果显示，在这些结直肠癌组织中，eif3f表达与phgdh表达具有显著的正向相关(图27)。根据免疫组化的染色结果，我们把eiff3f高表达(46/90)与低表达(44/90)及phgdh高表达(46/90)与phgdh低表达(44/90)两组，联合患者的临床病理特征，我们发现eif3f或phgdh的表达水平与本芯片收集的结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤分级、tmn分期、临床分期等因素之间无明显联系(表5)。
[0226]
病例1代表患有eif3f-高结肠癌的患者。病例2代表患有eif3f-低结肠癌的患者。eif3f和phgdh染色强度的量化如下表所示。p《0.05被认为有统计学意义，卡方检验。
[0227][0228]
表5 eif3f-phgdh轴表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系(n＝90)
[0229][0230]
卡方检验，p《0.05具有统计学差异
[0231]
进一步地，我们经过研究得到，丝氨酸能回补沉默eif3f产生的结直肠癌细胞增殖的抑制作用，过表达phgdh能部分沉默eif3f导致的细胞内丝氨酸和甘氨酸合成减少(图
27)。此外，沉默eif3f能抑制结直肠癌细胞内的sam和nadph的生成(图28和图29)。
[0232]
4.2nct503能有效抑制eif3f高表达的结直肠癌的增殖
[0233]
进一步探索靶向eif3f-phgdh轴是否可以有效抑制结直肠肿瘤的发展。由于目前对于eif3f的抑制剂尚未明确，并且phgdh是eif3f的一个重要的下游，因此我们选取了phgdh的抑制剂(nct-503)检验在eif3f表达水平不同的结直肠癌肿瘤对药物的反应。我们通过结直肠癌病人来源的肿瘤异种移植(pdx)模型中进行实验。
[0234]
首先，我们将四个新鲜的结直肠癌病例的肿瘤组织分别种植到ncg小鼠体内，形成第一代移植瘤(p1)。待p1的移植瘤在小鼠体内长到一定大小时，在无菌条件下取出该移植瘤组织，并把肿瘤切割成合适大小种植到新一批的ncg小鼠体内，形成第二代移植瘤(p2)，如此类推。待p2的移植瘤生长成一定大小后，在无菌条件下分离出新鲜的肿瘤组织(p3)，并把肿瘤组织分成若干2mm
×
2mm大小的组织块，接种到新一批的ncg小鼠的上下腹侧背部，构建pdx模型。同时，我们收集部分p2移植瘤组织进行蛋白提取，并通过免疫印迹实验分析eif3f的表达水平。结果发现，病例1和病例2的肿瘤组织的eif3f表达高于病例3和病例4的肿瘤组织，并且高表达eif3f的两个病例同时伴随着phgdh的相对高表达(图30)。
[0235]
接着，我们对p3的移植瘤进行vechicle或nct-503给药处理。我们根据每只小鼠的体重，每天腹腔注射nct-503(40mg/kg)或等体积的vehicle作为对照，并每五天测量一次肿瘤的大小。结果发现，两个eif3f表达较高的病例(病例1和病例2)的pdx肿瘤，经过nct-503处理后，肿瘤的大小明显小于对照组(vehicle)的肿瘤体积，提示nct-503可以抑制eif3f高表达的pdx肿瘤的生长；相比之下，在两个eif3f表达相对较低的病例(病例3和病例4)中，对照组(vehicle)的pdx肿瘤的大小与nct-503处理组的pdx肿瘤的大小没有显著的差异(图31)。
[0236]
待pdx肿瘤生长成一定大小(其中小鼠的荷瘤直径不超过1.5cm)，或小鼠出现体重减轻达20％～25％或出现恶液质时终止实验。通过二氧化碳猝死的方式，终结实验小鼠的生命，并取出完整肿瘤组织，称量各肿瘤的重量。结果发现，两个eif3f表达较高的病例(病例1和病例2)的pdx肿瘤，经过nct-503处理后，肿瘤的重量明显低于对照组(vehicle)的肿瘤重量；相比之下，在两个eif3f表达相对较低的病例(病例3和病例4)中，对照组(vehicle)的pdx肿瘤的重量与nct-503处理组的pdx肿瘤的重量没有显著的差异(图32)。
[0237]
接着，我们把收集的pdx肿瘤用多聚甲醛固定后，并送石蜡包埋切片。通过tunel染色检测组织切片中凋亡细胞的数目。结果显示，在两个eif3f表达较高的病例(病例1和病例2)的pdx肿瘤中，经过nct-503处理后，肿瘤组织中的凋亡细胞数目明显多于对照组(vehicle)的肿瘤组织；而在两个eif3f表达相对较低的病例(病例3和病例4)中，对照组(vehicle)与nct-503处理组的肿瘤组织内凋亡细胞数目没有明显的差异(图33)。