ENO3在肾癌诊断及治疗中的应用

eno3在肾癌诊断及治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及eno3在肾癌诊断及治疗中的应用。


背景技术：

2.肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率占所有恶性肿瘤的3％-4％，其全球的发病率以每年超过20万新发病例和10万死亡病例的速度在增长，严重危害着人类生命和健康。
3.肾癌早期常常无明显临床症状，患者在初次就诊时就已出现不同程度的扩散或转移，其比例达到20％-30％。部分肾癌患者在肾癌根治术后的数月或数年仍会复发进展为转移性肾癌，该比例可以达到肾癌患者的30％-40％，其中约50％-60％会出现肺部转移，约30％-40％会出现骨、肝、淋巴结转移，约20％会出现肾上腺转移，约5％会出现脑转移，约10％会出现对侧肾脏转移。
4.近年来，肿瘤的基因诊断和基因治疗技术发展迅速，为肾癌的治疗带来了新的契机。随着基因组学和分子生物学的进步，近几年分子靶向治疗技术也得到了飞速发展，现在已经逐步开始应用于临床，并且已经慢慢成为一种针对癌症治疗的重要方法，并且能获得确切的治疗效果。癌症的生长、进展及转移过程是多因素的，是一个涉及许多癌基因和抑癌基因共同参与的过程。癌症发展所包含的过程可包括癌基因的活化，抑癌基因的失活，细胞周期调控紊乱，表观遗传学变化和细胞信号转导异常等机制，癌基因和抑癌基因的改变可直接或间接导致肿瘤细胞的增殖和凋亡，肾细胞癌的发病机制也是如此。因此，探索新的肾癌相关基因可为未来的肾癌早期诊断及靶向治疗提供新的理论依据。


技术实现要素：

5.为弥补现有技术的不足，本发明提供了用于诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的生物标志物eno3，以实现肾癌的早期诊断和有效治疗。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面提供了检测eno3的试剂在制备诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的产品中的应用。
8.进一步，所述试剂选自特异性识别eno3基因的寡核苷酸探针、特异性扩增eno3基因的引物或特异性结合eno3基因编码的蛋白的结合剂。
9.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
10.本发明的第二方面提供了一种诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的产品，所述产品包括能够检测eno3表达水平的试剂。
11.进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
12.进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测eno3基因转录水平的针对eno3基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括eno3蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测
eno3基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测eno3蛋白表达水平的试剂或芯片。
13.进一步，所述试剂盒包括通过rt-pcr法、qrt-pcr法、生物芯片检测法、dna印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测eno3基因或蛋白表达水平的试剂。
14.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
15.本发明的第三方面提供了eno3在制备治疗肾癌的药物组合物中的应用。
16.进一步，所述药物组合物包括eno3的抑制剂。
17.进一步，所述抑制剂降低eno3的表达水平。
18.进一步，所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。
19.进一步，所述核酸抑制剂包括sirna、shrna。
20.进一步，所述蛋白抑制剂包括中和eno3的抗体。
21.进一步，所述抑制剂为shrna。
22.进一步，所述药物组合还包括药学上可接受的载体。
23.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
24.本发明的第四方面提供了一种用于治疗肾癌的药物组合物，所述药物组合物包括eno3的抑制剂。
25.进一步，所述抑制剂降低eno3的表达水平。
26.进一步，所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。
27.进一步，所述核酸抑制剂包括sirna、shrna。
28.进一步，所述蛋白抑制剂包括中和eno3的抗体。
29.进一步，所述抑制剂为shrna。
30.进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
31.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
32.本发明的第五方面提供了eno3在筛选治疗肾癌的候选药物中的应用。
33.进一步，筛选治疗肾癌的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有eno3基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中eno3基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制eno3基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肾癌的候选药物。
34.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
35.本发明的第六方面提供了一种筛选治疗肾癌的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有eno3基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中eno3基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制eno3基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肾癌的候选药物。
36.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
37.本发明的第七方面提供了eno3在构建诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的计算模型中的应用。
38.进一步，所述计算模型以eno3的表达水平为输入变量，使用生物信息学方法运算，以诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的结果为输出结果。
39.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
40.本发明的第八方面提供了eno3在构建诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的系统中的应用。
41.进一步，所述系统包括检测单元，所述检测单元检测eno3的表达水平。
42.进一步，所述系统还包括结果显示单元，所述结果显示单元显示诊断肾癌/预测肾癌预后/预测肿瘤分期的结果。
43.进一步，所述系统还包括信息获取单元、计算单元、评估单元。
44.进一步，所述肾癌为肾透明细胞癌。
45.本发明的优点和有益效果：
46.本发明首次发现了eno3与肾癌诊断及治疗的相关性，为实现肾癌的早期诊断和有效治疗提供新的思路，具有广阔的应用前景。
附图说明
47.图1是差异基因表达图，其中，1a是不同基因mrna表达水平图，1b是eno3蛋白免疫印迹图，1c是eno3蛋白表达水平图，1d是免疫组化染色检测图，1e是eno3阳性细胞数量图，1f是患者存活率图；
48.图2是eno3在不同细胞系中的表达图，其中，2a是eno3蛋白表达水平图，2b是eno3 mrna表达水平图，2c是敲低eno3 mrna水平图，2d是敲低eno3蛋白免疫印迹图，2e是敲低eno3蛋白水平图，2f是786-0细胞活力图；
49.图3是eno3敲低肿瘤图，其中，3a是肿瘤图，3b是肿瘤重量图，3c是肿瘤体积图。
具体实施方式
50.eno3包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的eno3，以及源自细胞中加工的任何形式的eno3。该术语涵盖eno3的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如eno3基因，人的eno3以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的eno3，基因id:2027。
51.术语“诊断”、“诊断的”、“进行诊断”及这些术语的变化型是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即，不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即，存在疾病或疾患或特性的评估)。上述术语“诊断”、“诊断的”、“进行诊断”等包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。
52.术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
53.术语“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3’末端羟基(游离3’羟基)的核酸序列，它可以与互补模板(template)形成碱基对(basepair)并充当复制模板的起点。
54.术语“表达水平”或“表达的水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一
般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mrna)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成rna但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体rna)。
55.术语“芯片”包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测eno3基因转录水平的针对eno3基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括eno3蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测eno3基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测eno3蛋白表达水平的试剂或芯片。
56.作为本发明的一种实施方案，针对eno3基因的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
57.术语“结合剂”指特异性结合靶的天然存在的或非天然存在的分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂质。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体。
58.在本发明中，特异性结合eno3基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质eno3的受体、结合蛋白质eno3的凝集素、针对蛋白质eno3的抗体、针对蛋白质eno3的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
59.术语“试剂盒”是指在用于对核苷酸进行测序和/或分离核苷酸序列和/或基于来自样品或细胞的表达核苷酸序列的存在、不存在和/或量来诊断患有疾病或感染的受试者的系统的情况下提供的一组组件。在一些实施方案中，术语“试剂盒”是指在用于对核苷酸进行测序和/或分离核苷酸序列和/或基于样品或细胞中的表达核苷酸序列的空间位置来诊断患有疾病或感染的受试者的系统的情况下提供的一组组件。这类系统可包括例如允许在一个或多个细胞(例如，在适当容器中的寡核苷酸、编码酶的寡核苷酸，细胞外基质组分)和/或支持物质(例如，缓冲液、培养基、细胞、用于进行测定的书面说明)中储存、确认或从一个位置向另一位置递送表达基因的系统。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持物质的一个或多个外壳(例如，盒)。术语“片段化试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的诊断测定，每个容器含有总试剂盒组分的子部分。容器可一起或分开地递送至预期的接受者。例如，第一容器可含有用于细胞培养测定的固体支持物或聚苯乙烯板，而第二容器可含有细胞，如对照细胞。作为另一实例，试剂盒可包括第一容器和第二
容器，所述第一容器包含具有对本发明公开的一种或多种生物标志物具有亲和力的一种或多种配体的固体支持物，如芯片或载玻片，所述第二容器包含检测和/或定量样品中脂质修饰的寡核苷酸的量所必需的任何一种或多种试剂。术语“片段化试剂盒”旨在涵盖含有根据federal food,drug,and cosmetic act第520(e)条规定的分析物特异性试剂(asr)的试剂盒，但不限于此。任何包含两个或多个单独容器的递送系统都包含在术语“碎片化试剂盒”中，每个容器包含总试剂盒组分的子部分。相比之下，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳每种所需组分的单个盒中)含有所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括片段化的和组合的试剂盒两者。
60.在本发明的实施方案中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；基因检测试剂盒包括用于检测eno3基因转录水平的试剂；蛋白免疫检测试剂盒包括eno3蛋白的特异性抗体。
61.本发明中所述的芯片、试剂盒或膜条可用于检测包括eno3基因或蛋白在内的多个基因或蛋白及其表达产物(例如，肾癌相关的多个基因或蛋白)的表达水平。将肾癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肾癌诊断或预后预测的准确率。
62.术语“抑制剂”是指任何可减少eno3蛋白的活性、降低eno3基因或蛋白的稳定性、下调eno3蛋白的表达、减少eno3蛋白有效作用时间或抑制eno3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调eno3有用的物质，从而可用于预防或治疗肾癌。
63.所述的抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子。其中核酸抑制剂选自：以eno3或其转录本为靶序列、且能够抑制eno3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与eno3蛋白特异性结合的物质，如能够抑制eno3蛋白活性的抗体或配体。
64.在本发明的一些实施方案中，所述的eno3的抑制剂是一种特异性与eno3结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与eno3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
65.在本发明的一些实施方案中，所述的eno3的抑制剂是小干扰rna(sirna)，所述的小干扰rna是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rna interference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。
66.在本发明的具体实施方案中，所述的eno3的抑制剂是“小发夹rna(small hairpin rna，shrna)”，其是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，小发夹rna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shrna可以由双链dna模板来表达。双链dna模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shrna在真核细胞内dicer酶的作用下，可被切割成小干扰rna分子，从而进入rnai途径。“shrna表达载体”是指一些本领域常规用于构建shrna结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位
于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shrna(或类似物)相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该dna序列转录后的rna可形成shrna(short hairpin)结构。所述的“shrna表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
67.本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
68.本发明中eno3的抑制剂可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括但不限于乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。
69.术语“药学上可接受的载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
70.其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖。
71.本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。
72.其中，稳定剂包括人类血清蛋白、l-氨基酸、糖及纤维素衍生物。l-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
73.本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。
74.本发明的药物还可与其他治疗肾癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的
活性成分(例如，eno3的抑制剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如eno3的抑制剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。
75.术语“培养体系”包括但不限于细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴)。
76.在本发明的实施方案中，筛选治疗肾癌的候选药物的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制肾癌的效果，若测试化合物对肾癌有显著的抑制效果，则说明该候选药物为治疗肾癌的候选药物。
77.在本发明的一些实施方案中，肾癌包括但不限于透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、多房性囊性肾细胞癌、肾髓样癌、肾嫌色细胞癌。
78.在本发明的具体实施方案中，肾癌选自肾透明细胞癌。
79.下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
80.实施例
81.1实验方法
82.1.1临床样本信息
83.本研究纳入了49名ccrcc患者(35名男性和14名女性；31
–
74岁，平均57.7
±
8.5岁)。所有患者于2018年11月至2021年10月在河北医科大学第二医院接受b超和微流显像(mfi)检查(超声科)并接受外科治疗(泌尿外科)。病理。本研究患者否认有慢性肾脏病史，尿素氮、肌酐等肾功能检查正常。所有患者在检查前均获得知情同意。本研究中的所有实验方案均经河北医科大学第二医院人类伦理委员会批准。
84.1.2原代细胞培养
85.新鲜的ccrcc组织立即用冰冷的生理盐水洗涤两次，并浸入含有1％青霉素/链霉素(gibco)和0.5％谷氨酰胺的冷rpmi 1640培养基(gibco)中。手术后60分钟内去除周围的脂肪、血管和坏死组织，用剪刀剪掉肿瘤组织。用无血清rpmi 1640培养基洗涤解离的肿瘤细胞两次，重悬于含有20％胎牛血清(fbs)、2mmol/l l-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，并在37℃、5％co2和95％湿度下孵育。细胞传代至80％。第三代至第五代ccrcc用于实验研究。
86.1.3细胞系和转染
87.人ccrcc细胞系(a498、sw839和786-0)和293a细胞购自美国典型培养物保藏中心，保存于河北医科大学第二医院分子生物学实验室。所有细胞均在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素(gibco)的dmem(gibco)中培养。细胞在95％空气和5％co2的加湿气氛中生长，使用lipofectamine 2000(invitrogen)进行转染。
88.1.4 rna分离和实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)
89.通过ezna分离和提取肿瘤组织或培养细胞的总rna。使用nanodrop 2000(thermo)测量总rna的浓度和质量。三代逆转录预混液(monscript rtiii)含dsdnase(monad，china)和oligo-dt引物用于合成第一链cdna。monamp chemohs qpcr mix kit(monad)和c1000 touch热循环仪系统(bio-rad)用于检测基因mrna表达。将相对转录表达水平标准化为甘油
醛3-磷酸脱氢酶，并使用2-δδct
公式。
90.1.5蛋白质印迹分析
91.放射免疫沉淀测定缓冲液裂解培养的细胞和冷冻组织临床样品。蛋白质样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds)电泳中分离，并通过电泳(bio-rad)电转移到聚偏二氟乙烯膜(millipore)上。将膜与5％脱脂牛奶一起孵育2小时，并在4℃下用一抗处理过夜。使用的一抗是eno3(1:1000；ab126259)、cdk6(1:1000；ab124821)和β-肌动蛋白(1:1000；ab8226)。第二天，用辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:8000；rockland)与膜反应。通过增强化学发光处理蛋白质印迹，并使用azure biosystems c400(美国)进行检测。使用cseries capture software(azure biosystems)捕获和处理图像。
92.1.6异种移植动物
93.雄性balb/c裸鼠(18-22g；4-6周龄)由实验动物科技有限公司(中国北京)提供，用于异种移植动物模型。786-0细胞(5
×
106)具有稳定的eno3，被重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水培养基瓶中，并与50％matrigel(bd)混合以形成0.2ml的体积。将混合悬浮液在背侧皮下注射。一周后，每周两次测量小鼠肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积计算公式如下：肿瘤体积＝(长
×
宽2)/2。28天后，用co2窒息对小鼠实施安乐死。本研究中的动物模型方案经河北医科大学第二医院人类伦理委员会批准。
94.1.7免疫组化染色
95.石蜡组织切片用二甲苯脱蜡并用梯度乙醇再水化。接下来，过氧化氢处理和山羊血清封闭。将组织切片与一抗在4℃下孵育过夜。第二天，去除一抗，与二抗孵育30分钟。组织切片滴加辣根酶标链霉亲和素工作液20min。然后在室温下滴加适量的dab显色液。切片用苏木精洗涤并染色后，逐渐脱水，透明，封片。
96.1.8 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mts)测定
97.将786-0细胞接种到96孔板中并用相应的载体转染。每孔加入20μl mts试剂，孵育0.5至4h。最后，通过酶标仪在490nm(thermo fisher，usa)检测细胞的吸光度。
98.1.9生物信息学分析
99.通过http://www.oncolnc.org/获取ccrcc中eno3基因的表达情况，利用kaplan-meier分析分析其表达与患者预后的关系。
100.1.10统计分析
101.数据表示为平均值
±
平均值的标准误差(sem)。采用student's t检验分析两组间差异。p《0.05为差异有统计学意义。所有统计分析使用graphpad prism7.0版本。
102.2实验结果
103.2.1 ccrcc组织中eno3表达增加导致预后不良
104.结果显示，与正常组织相比，ccrcc组织中pkm、eno3、pgam1、pgam2和ldha的表达显著增加，然而，只有eno3随着肿瘤大小的增加而增加(图1a)。随后，蛋白质印迹和rt-qpcr也证实eno3表达随着ccrcc大小的增加而增加(图1b、1c)。同时，免疫组化染色显示eno3阳性细胞数随着肿瘤大小的增加而增加(图1d、1e)。此外，kaplan-meier分析提示高eno3水平的ccrcc患者预后较差(图1f)。此外，eno3 mrna表达水平的临床病理因素与肿瘤大小及tnm分期显著相关，而与年龄、性别等无关(表1)。总之，这些数据支持eno3上调与ccrcc进展有关。
105.表1临床病理特征
[0106][0107][0108]
2.2上调eno3可促进ccrcc细胞生长
[0109]
为了研究eno3的功能，在不同的ccrcc细胞系中检测了eno3的表达。结果显示，eno3在786-0中高表达(图2a、2b)，在786-0中敲低eno3(sheno3)，与慢病毒载体相比(plko)，786-0中的eno3的敲低证实了两种sheno3(sheno3-1#和sheno3-2#)载体有效地下调了eno3基因的表达(图2c-2e)。采用mts法检测细胞活力，敲低eno3显著降低了786-0细胞的增殖(图2f)。
[0110]
2.3敲低eno3抑制ccrcc体内进展
[0111]
为了研究敲低eno3是否会抑制异种移植物的进展，在786-0细胞中eno3被慢病毒稳定敲低(lv-shcon)。如图3所示，与lv-shcon相比，敲低eno3肿瘤(lv-sheno3)表现出较小体积或较小的湿重。结果表明，敲低eno3抑制了异种移植模型在体内的进展，说明eno3是ccrcc的潜在治疗靶点。
[0112]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。