专利名称:通过核酸模板化学生物检测的相关应用的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及探针及其在生物检测和诊断学中的用途。更具体地，本发明涉及生物检测和诊断学(例如对核酸和蛋白质的检测)中核酸模板化学的组合物和方法(例如荧光的、化学发光的和发色化合物的合成)。
背景技术：
荧光和有色化合物已被用于生物学研究和医学领域，以检测生物分子的存在、不存在、状态、数量和组成。使用荧光和有色化合物的测定法可以体外、原位或体内进行。用于检测DNA和RNA的体外检测法中常用的例子是实时和终点PCR、DNA测序和DNA微阵列技术。
核酸检测
DNA和RNA检测测定法常常需要带有荧光标记的DNA探针和/或引物。典型地，这些通过酶合成和/或化学合成产生。体外荧光测定法的其它例子包括ELISA测定法，该测定法中用荧光团标记抗体。原位荧光`测定法的一个例子是用荧光修饰的抗体来标记整个细胞(活的或死的)，使得它们能够(例如使用流式分选器)被检测、成像和分离。最近，有人努力在完整动物中使用荧光作为侵害最小的检测技术。基本上，用近IR或IR荧光化合物来标记抗体或其它生物活性分子，随后注射进动物中；使用合适的光照和成像设备检测荧光定位。以这种方式可以发现和监测癌症和其它疾病，而不需要探查手术。前文只是阐述荧光作为生物探测技术的渗透性的若干例子。
典型地，对于多数这些类型的测定法而言，需要通过洗涤步骤去除未结合的探针或抗体以获得足够的信号噪音比和灵敏度。这向测定过程添加了步骤，导致额外的时间和成本(试剂和可能的设备)。DNA/RNA扩增测定法(如RT-PCR)不需要洗涤步骤，因为靶标被扩增有效地降低了样品的复杂性，同时提供了大量待分析物用于测定。但是即便是PCR也受到一些限制。例如，在单一测定中可以被检测的待分析物数量被限制为四个或更少，并且测定需要昂贵和耗能(power-hungry)的设备，这限制了其在实验性用途(特别是在田间用途)中的可应用性。具有与PCR同样的灵敏性和特异性，但是更加强大(robust)和轻便的测定技术会是有利的。在体内成像的情况下，因为注射和之后和成像之前需要一些时间，因此进行“生物学”洗涤步骤，允许生物活性化合物找到其靶标，并允许多余的试剂清除身体。
蛋白质检测[0008]蛋白质在许多生物学反应中起中心作用，所述生物学反应基本上由分子间作用和涉及多种蛋白质的分子识别组成。蛋白质鉴定和定量测定中用的常用方法使用双向电泳和质谱法。另一方法使用液相色谱和质谱法。对相互作用检测和蛋白质鉴定而言，也可使用抗体芯片，所述抗体芯片提供点在平表面上的大量抗体。使用电泳的常规方法在分辨率和检测灵敏度方面有问题。
Landegren et al.的 U.S.专利公开号 N0.20020064779 描述了接近连接(proximity ligation)测定法,其中与待检测祀标结合的两个探针与附着在所述两个结合探针上的两个寡核苷酸的末端酶连接。结合的寡聚体被扩增，以测定靶标分子的存在。Nadeau et al.的U.S.专利申请公开号N0.2005/0009050描述了形成扩增子的类似原理。
Kolman et al的U.S.专利申请公开号N0.20050095627描述了基于接近性的测定法，其中与两个寡核苷酸连接的两个结合配偶体与靶标结合时形成杂合体一这是部分为双链的DNA结构。然后可以用DNA聚合酶延伸所述部分为双链的结构，产生可以通过PCR被进一步扩增的产物。
人们需要针对上述生物检测方法中许多固有缺陷的、新的荧光和比色法。还需要发现新的荧光化合物。
发明内容
本发明部分基于下述发现:核酸模板化学可用于检测生物学靶标，例如核酸、蛋白质、自身抗体、细胞等。本发明部分基于下述发现:荧光、化学发光和发色化合物和产生荧光、化学发光和发色信号的反应可以通过核酸模板化学被合成。这类方法、化合物、化学反应和其它组分适用于检测生物分子，如核酸和蛋白质。使用荧光、化学发光和有色化合物的本发明测定法可以体外、原位或体内进行。
在一个方面，本发明涉及用于检测靶标核苷酸序列的方法。该方法包括(a)提供
(I)第一探针，其包含(i)第一寡核苷酸序列和(ii)与所述第一寡核苷酸序列连接的第一反应基团，和(2)第二探针，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)与所述第二寡核苷酸序列连接的第二反应基团，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列与靶标核苷酸的两个分离区域互补；(b)将所述第一探针和所述第二探针与将用来测试靶标核苷酸序列的存在的样品在下述条件下结合，所述条件是这样的:如果靶标核苷酸序列存在于样品中，那么在所述条件下，所述第一探针和所述第二探针与靶标核苷酸序列上它们各自的互补区杂交，从而使得所述第一反应基团和所述第二反应基团开始反应性接近；和(c)检测所述第一反应基团和所述第二反应基团之间的反应，从而测定靶标核苷酸序列的存在。
在另一方面，本发明涉及用于检测靶标核苷酸序列的方法。所述方法包括(a)提供一组探针对，每个探针对包含(I)第一探针，其包含(i)第一核苷酸序列和(ii)与所述第一寡核苷酸序列连接的第一反应基团，和(2)第二探针，其包含(i)第二寡核苷酸序列和
(ii)与所述第二寡核苷酸序列连接的相应第二反应基团，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列与靶标核苷酸的两个分离区域互补；(b)将所述探针对组与将用来测试靶标核苷酸序列的存在的样品在下述条件下结合，所述条件是这样的:如果靶标核苷酸序列存在于样品中，那么所述条件下所述探针对的每个所述第一探针和所述第二探针与靶标核苷酸序列上它们各自的互补区杂交，从而使得相应的所述第一反应基团和所述第二反应基团对开始反应性接近；和(C)检测所述第一反应基团和相应的所述第二反应基团对之间的一个或多个反应，从而测定靶标核苷酸序列的存在。
在又一方面，本发明涉及用于进行核酸模板化学的方法。本方法包括例如在基本相似的条件下和/或基本同时地进行多重核酸模板化学反应，所述反应以单个模板核苷酸序列作为模板。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标的方法。所述方法包括下述这些。提供第一探针。所述第一探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和
(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。提供第二探针，所述第二探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是有反应性的。将所述第一探针与所述第二探针与将用来测试生物学靶标存在的样品在下述条件下结合，所述条件下所述第一和第二结合部分与生物学靶标结合。所述第二寡核苷酸被允许与所述第一寡核苷酸杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定生物学靶标的存在。在一个实施方案中，第一和第二反应基团之间的反应产生荧光部分。在另一实施方案中，第一和第二反应基团之间的反应产生化学发光和/或发色部分。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标的方法。所述方法包括下述这些。提供生物学靶标与第一探针的结合复合物。所述第一探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。将结合复合物与第二探针接触。所述第二探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交，当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。所述第二寡核苷酸被允许与所述第一寡核苷酸杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定生物学靶标是否存在。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标存在的方法。所述方法包括下述这些。允许第一探针和第二探针与靶标结合。所述第一探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。所述第二探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，
(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。第二寡核苷酸能够与第一寡核苷酸序列杂交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。所述第二寡核苷酸被允许与所述第一寡核苷酸杂交，从而使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定样品中是否存在生物学靶标。在一个实施方案中，第一和第二反应基团之间的反应产生荧光部分。在另一实施方案中，第一和第二反应基团之间的反应产生化学发光和/或发色部分。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标存在的方法。所述方法包括下述这些。提供第一探针，其包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸压缩码序列。提供第二探针，其包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸压缩码。所述第一探针与第一报告子探针杂交，所述第一报告子探针包含(I)与所述第一寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸反压缩码序列，(2)第一报告子寡核苷酸，和(3)第一反应基团。所述第二探针与第二报告子探针杂交，所述第二报告子探针包含(I)与所述第二寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸反压缩码序列，(2)第二报告子寡核苷酸，和(3)第二反应基团。第二报告子寡核苷酸能够与第一报告子寡核苷酸序列杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。将所述第一和第二探针与用于测试所述生物学靶标存在的样品接触。当样品中存在所述生物学靶标时，允许所述第一和第二探针与所述生物学靶标结合，从而所述第二报告子寡核苷酸与所述第一报告子寡核苷酸杂交，使得所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定样品中是否存在所述生物学靶标。
值得指出的是，本发明的方法不要求对第一和/或第二寡核苷酸序列进行酶连接或化学连接。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学待分析物的试剂盒。所述试剂盒包括第一探针，其包含(I)对所述生物学待分析物具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团；和第二探针，其包含(I)对所述生物学待分析物具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。
在又一方面，本发明提供了可用于检测生物学待分析物的试剂盒。所述试剂盒包含第一探针，所述第一探针包含(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸压缩码序列；和第二探针，所述第二探针包含(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，和(2)第二寡核苷酸压缩码序列。所述第一探针能够与第一报告子探针杂交，所述第一报告子探针包含(I`)与所述第一寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸的反压缩码序列，(2)第一报告子寡核苷酸，和(3)第一反应基团。所述第二探针能够第二报告子探针杂交，所述第二报告子探针包含(I)与所述第二寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸的反压缩码序列，(2)第二报告子寡核苷酸，和(3)第二反应基团。所述第二报告子寡核苷酸能够与所述第一报告子寡核苷酸序列杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。
本发明包括提供一种、两种或多种本文所述探针的试剂盒。更具体地，本发明包括提供一种、两种或多种下述探针的试剂盒，所述探针利用核酸模板化学产生可检测的信号，用作检测生物学靶标或靶标(例如一种或多种核酸、一种或多种蛋白质、一种或多种自身抗体和/或一种或多种细胞)存在的手段。
参考下文附图、详述和权利要求
书可透彻地理解本发明之前的方面和实施方案。
定义
本文使用的术语“DNA程序化化学”或” DPC”指核酸模板化学，例如对化学反应物进行序列特异性控制，产生特定产物，这通过下文所述来完成:(I)提供一种或多种模板，其具有结合的反应基团；(2)将具有反密码子(例如一种或多种模板的互补序列)的一种或多种转移基团(试剂)与反应基团在允许与模板杂交的条件下接触，和(3)反应基团反应产生产物。例如在一步核酸模板反应中，“模板”和“互补”寡核苷酸的杂交将反应基团装配在一起，随后进行化学反应，产生目的产物。反应物和产物的结构无需与核酸的结构相关，所述核酸包含模板和转移基团寡核苷酸。参阅例如Liu et al.的U.S.专利申请公开号 Nos.2004/0180412 Al (USSN 10/643, 752 ；Aug.19,2003)和 Liu et al 的 2003/0113738 Al(USSN 10/101, 030 ；Mar.19,2002) ；Gartner, et al，2004，Science, vol.305,pp.1601-1605 ；Doyon, et al，2003，JACS, vol.125，pp.12372-12373，所有参考文献的全部内容通过引用明确并入本文。还参阅"Turn Over Probes and Use Thereof by Coull etal.，2006年五月3日提交的PCT国际申请PCT/US06/16999。
本文使用术语“核酸”、“寡核苷酸”(有时简称为“寡(oligo) ”)或“多核苷酸”是指核苷酸的多聚体。多聚体可包括，但不限于天然核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙块基_尿苷、C5-丙块基-胞苷、C5-甲基胞苷、7_脱氮腺苷、7_脱氮鸟苷、8_氧腺苷、8_氧鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫胞苷)、经化学修饰的碱基、经生物学修饰的碱基(例如甲基化的碱基)、插入的碱基、经修饰的糖(例如2’ -氟核糖、核糖、2’ -脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或经修饰的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5' -N-亚磷酰胺键)。核酸和寡核苷酸可还包括具有经修饰主链的其·它碱基多聚体，如锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)。
在整个说明书，组合物被描述为具有、包括或包含特异组分，或其中方法被描述为具有、包括或包含特异的操作步骤时，也包括下面的情况:本发明的组合物还主要由所述成分组成或由所述成分组成，本发明的方法也主要由所述操作步骤组成或由所述操作步骤组成。此外，应当理解:步骤顺序或进行某些活动的顺序是非关键性的，只要本发明仍可操作即可。另外，可同时进行两个或更多的步骤或行动。
附图概述
可从以下附图进一步理解本发明，其中:
图1是对根据本发明的一个实施方案用于检测核酸靶标的方法的图示。
图2是对通过基因涂抹(gene painting)检测低拷贝数基因的例子的图示。
图3是对通过辅因子释放测定法检测核酸靶标的例子的图示。
图4是对根据本发明的一个实施方案用于检测生物学靶标的方法的图示。
图5是对根据本发明的一个实施方案用于检测生物学靶标的方法的图示。
图6显示了受浓度、温度和单个碱基对错配的存在或不存在影响的杂交的例子。
图7显示了某些解链曲线实验中的示例性寡核苷酸。
图8是对根据本发明的一个实施方案用于检测生物学靶标的方法的图示。
图9是对根据本发明的一个实施方案用于检测血小板衍生的生长因子(TOGF)的方法的图示。
图10显示了夹板的(splinted)、压缩码的检测体系的示例性实施方案，其中使用适体作为靶标结合部分。
图11显示夹板的(、压缩码的检测体系的示例性实施方案，使用抗体作为靶标结合部分。
图12是对根据本发明的一个实施方案用于检测蛋白质靶标的方法的图示。
图13显示了聚甲炔染料、花青(cyanine)和半花青(hemicyanine)的一般结构。
图14显示了荧光信号的产生和通过三苯膦(TPP)和叠氮香豆素(AzC)报告化学对生物学靶标进行检测的例子。
图15显示了荧光信号的产生和通过TPP和AzC报告化学对生物学靶标进行检测的例子。
图16显示了解链曲线的某些例子，展示了寡核苷酸浓度对Tm的影响。
图17显示了有和没有抗生物素蛋白时，生物素化的寡核苷酸的DNA杂交解链曲线的某些例子。
图18显示了与抗生物素蛋白结合后互补的生物素化寡核苷酸的T111改变的某些例子。
图19显示了盐和镁浓度对寡核苷酸+/_生物素的Tm的影响的某些例子。
图20显示了在不同比例的寡核苷酸与抗生物素蛋白之比的情况下，生物素化的寡核苷酸解链温度行为的某些例子。
图21显示了存在和不存在抗生物素蛋白时，与生物素_5’ 5' (+)链寡核苷酸成为双链体的3’ (-)生物素-链寡核苷酸的解链曲线的某些例子。
图22显示了有和没有抗生物素蛋白时，富含AT的生物素化寡核苷酸二聚体解链曲线的某些例子。
图23是对根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的方法的图示。
图24显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果的例子。
图25A和图25B显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(反应混合物中甲酰胺的效应)的例子。
图26A和图26B显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(反应混合物中甲酰胺的效应)的例子。
图27显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(反应混合物中甲酰胺的效应)的例子。
图28显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(反应混合物的时程)的例子。
图29显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(反应混合物的时程)的例子。
图30显示了根据本发明的一个实施方案检测生物学靶标的实验结果(探针比例)的例子。
图31显示了通过压缩码检测体系检测TOGF的例子。
图32显示了针对适体和报告子的比例进行的实验。
图33阐述了用于检测TOGF的“单片”检测体系的实施方案。
图34显示了夹板的、压缩码的检测体系的示例性实施方案，其中使用抗体作为靶标结合部分。
图35显示了反应混合物的MALD1-MS谱。[0066]图36显示了反应混合物的吸收和荧光发射光谱。
图37显示了纯化的半花青的吸收和荧光发射光谱。
图38显示了化合物的电喷射质量数据。
发明详述
就最简单的目的而言，本发明旨在通过核酸模板反应产生可检测的、指示靶标待分析物(例如核酸或蛋白质)的存在的信号。更具体地，本发明提供了令人兴奋的方法来产生荧光、化学发光或发色化合物和信号，并将这类技术用于生物检测和/或诊断应用中。直接作为核酸模板化学反应结果的(由于化学键的形成或切割，或功能基团的化学转化产生的)有色、荧光或化学发光化合物或前体的产生及检测提供了独特的技术，所述技术可应用于许多领域，包括生物恐怖剂(bioterror agent)检测和疾病诊断。
因此，探针之间的杂交事件之后是由DNA模板(寡核苷酸)介导的化学反应，所述DNA模板由于接近效应从而显著提高了化学反应的速率，并能够介导大量化学反应。因此，靶标生物分子(例如核酸或蛋白质)的存在导致可检测化学反应的发生。从而，本发明提供了易于使用和高信噪比的生物学靶标检测。
核酸检测
图1阐述了对核酸的检测的一个实施方案。两个寡核苷酸与DNA或RNA靶标(待分析物，例如在相信含有生物恐怖剂或其它传染剂的样品中)结合。用化学反应种类X和Y标记两种探针。杂交后，X与Y反应产生产信号的化合物Z(例如荧光、化学发光或有色化合物)。Z与两个探针可以共价连接或不连接，不连接时Z可以与任一探针连接。Z形成后可从寡核苷酸释放。
如果荧光图或发色团被释放，其可以从杂交复合物分离并单独分析，或其被检测后可被去除，从而能够进行样品的另一轮查询(例如探针翻转)。如果荧光团或发色团未被释放，也可将其从反应混合物剩余部分分离，例如作为双链结构移动，所述双链结构可通过例如凝胶电泳分析。DNA或RNA靶标上附着于DNA探针的荧光团可以附着在固相(例如珠、载玻片(微阵列)表面等)或溶液中(在该情况下反应构成均相测定)。
因此在一个方面，本发明涉及用于检测靶标核苷酸序列的方法。所述方法包括(a)提供(I)第一探针，其包含(i)第一寡核苷酸序列和(ii)与所述第一寡核苷酸序列连接的第一反应基团，和(2)第二探针，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)与所述第二寡核苷酸序列连接的第二反应基团，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列与靶标核苷酸的两个分离区域互补；(b)将所述第一探针和所述第二探针与用于测试靶标核苷酸序列存在的样品在下述条件下结合，所述条件是这样的:如果靶标核苷酸序列存在于样品中，那么所述条件下所述第一探针和所述第二探针与靶标核苷酸序列上它们各自的互补区杂交，从而所述第一反应基团和所述第二反应基团开始反应性接近；和(c)检测所述第一反应基团和所述第二反应基团之间的反应，从而测定靶标核苷酸序列的存在。
图2阐述了通过能够检测低拷贝数基因的核酸模板化学检测核酸序列的例子。用一组探针对(例如 400/基因)“涂抹”目的基因。探针对的数量可以在例如2、5、10和1，000、5，000或10，000之间。探针对(第一反应基团和响应的第二反应基团)之间的化学反应在所有探针对中可以相同， 也可以不同。产生不同荧光团的不同组探针对可以靶向靶标中不同的序列。[0077]图2中阐述的实施方案也可应用于除生物检测外的应用。单个DNA模板上发生多重核酸模板反应的原理不局限于产生突光信号。
因此，在另一方面，本发明涉及用于检测靶标核苷酸序列的方法。所述方法包括a)提供一组探针对，每个探针对包含(I)第一探针，其包含(i)第一核苷酸序列和(ii)与所述第一寡核苷酸序列连接的第一反应基团，和(2)第二探针，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)与所述第二寡核苷酸序列连接的相应第二反应基团，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列与靶标核苷酸的两个分离区域互补；(b)将所述探针对组与用于测试靶标核苷酸序列存在的样品在下述条件下结合，所述条件是这样的:如果靶标核苷酸序列存在于样品中，那么所述条件下所述探针对的每个所述第一探针和所述第二探针与靶标核苷酸序列上它们各自的互补区杂交，从而相应的所述第一反应基团和所述第二反应基团对开始反应性接近；和(C)检测所述第一反应基团和相应的所述第二反应基团对之间的一个或多个反应，从而测定靶标核苷酸序列的存在。
图3阐述了另一实施方案的例子，其中间接检测流程涉及核酸模板反应，随后是辅因子释放和后继的可检测反应。
蛋白质检测
图4和图5阐述了用于检测蛋白质革巴标的本发明的一个实施方案。
图4显示了通过本发明检测蛋白质靶标的一个实施方案。两个探针含有靶标结合部分、互补寡核苷酸，并且分别含有化学反应种类X和Y。杂交后X和Y反应产生产信号(例如荧光)化合物，其与两种探针可共价连接或不共价连接。X和Y的反应产物也可作为未结合的、可溶的化合物被释放进溶液中。蛋白质靶标可以附着在固相(例如珠、载玻片(微阵列)表面等)或溶液中。靶标结合部分可以是例如适体、抗体、抗体片段(即Fab)、受体蛋白或小分子。
在图5中更具体阐述的是使用两种探针的二元探针途径的例子，所述两种探针各带有一个“前荧光团”前体(Fl和F2)并含有靶标结合部分和被设计为彼此退火的寡核苷酸序列。在该实施方案中，检测在下述条件下进行:不存在靶标时前荧光团寡核苷酸不会彼此退火。这些条件通常被选为:使得不存在靶标时环境温度高于寡核苷酸对的Tm(从而不存在目的靶标待分析物时寡核苷酸对不会退火)。然而，存在目的靶标时，局部高浓度的寡核苷酸随后提高它们双链复合物的Tm使得杂交发生，之后发生产信号的核酸模板反应(Fl和F2之间的反应)。产信号核酸模板反应由于局部更高的前突光团浓度而被加速，但是也可被前荧光团基团朝向彼此的接近和定向促进。该信号产生的构型具有能够制造试剂盒的潜力，所述试剂盒用于检测多种生物分子、细胞、表面和用于原位测定法的设计。信号产生不需要酶，均相形式不需要样品加工。
在图5中显示了两种寡核苷酸，每种都通过可选的间隔臂与独立的结合物(如图所示的情况下是抗体，但是可以是其它结合物如适体或小分子)连接。每个抗体识别共用靶标待分析物(如蛋白质)上的独立表位。间隔臂可以添加至寡核苷酸和结合物之间的一个或两个寡核苷酸上。在某些情况下，该间隔臂可被要求符合接近的要求以达到所期望的反应性。原则上间隔臂可以是任何合适的基团，例如线性或分支的脂肪族碳链C3到C5、C10、C15、C20、C25、C30、C35、C40 或 ClOO 基团，I 到 10、15、20、30、50 或 100 个碱基长的 DNA序列或适当长度的聚乙二醇寡聚物。[0085]前荧光团可位于“螺旋末端”构型中(图5顶部)，一个附着于01igo5’端，另一附着于3’端。(可应用其它构型，包括将两个前荧光团置于序列中，或例如使一个寡核苷酸与部分发夹结构(例如100埃长)杂交)。在第一个例子中，一个01igo5’端附着于间隔臂和靶标结合物，另一个3’端附着于间隔臂和分离的靶标结合物。可以添加间隔臂(其可由不互补的DNA序列组成)或合成间隔臂(如乙二醇寡聚物)以满足接近要求。这类间隔臂可以非常有弹性，其具有下述优点:克服与坚硬间隔可能发生的任何结合位阻。合适的长间隔臂设计可以允许01igo5’与它们的结合物(图5底部)连接，或3’也连接，只要寡核苷酸能够以反向平行的构型退火并允许反应基团彼此反应即可。可对每个靶标设计最佳的间隔臂长度。过长的间隔臂应当避免，因为它们可能会降低体系中的特异性或降低的提高的Tm效应。
与两种寡核苷酸游离于溶液中相比，限定(tethering)寡核苷酸对所提供的接近效应可影响两个互补寡核苷酸序列退火的动力学。更重要的是，与游离复合物相比，局部高浓度使解链曲线向上移动，即提高复合物的Tm。如下文方程所阐述的，在大量(bulk)溶液中，已知 Tm 取决于总寡核苷酸浓度。ffetmur, Crit1.Rev.1n Biochem.And Mo1.Biol, 26,227-259(1991)。
Tm = (1000*AH)/(A+AS+R In(C τ /4)-273.15+16.6 log Na+)
其中Λ H和AS是螺旋形成的焓和熵，R是摩尔气体常数，Q是寡聚物的总浓度，Na+是溶液中钠离子的摩尔浓度。
图6显示了在0.1M盐中短寡核苷酸范围内Tm对浓度的斜线具有下述依赖性:根据上述方程，寡核苷酸(图7中的序列)浓度每提高10倍约+7°C。因此例如1000倍的局部浓度会被预期提高Tm约+21°C。
Fl和F2的反应产物可作为化学转化的结果从杂交复合物中释放。因此，荧光团或发色团可从杂交复合物分离并独立地分析，或检测后可将荧光团或发色团和退火的寡核苷酸去除，使得能够进行样品的另一轮查询。一旦形成产物，Fl和F2之间的反应可与两个探针共价连接或不共价连接。
因此在一个方面，本发明提供了用于检测生物学靶标的方法。所述方法包括下述这些。提供第一探针。所述第一探针包括(I)对生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。提供第二探针，其包含(I)对生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。将所述第一探针与所述第二探针与用于测试生物学靶标存在的样品在下述条件下结合，所述条件下所述第一和第二结合部分与生物学靶标结合。允许所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定生物学靶标的存在。在一个实施方案中，所述第一和第二反应基团之间的反应产生荧光部分。在另一实施方案中，所述第一和第二反应基团产生化学发光和/或发色部分。
在另一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标的方法。所述方法包括下述这些。提供生物学靶标和第一探针的结合复合物。所述第一探针包括(I)所述第一探针包含(I)对生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。将结合复合物与第二探针接触。所述第二探针包括(I)对生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团是反应性的。允许所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定样品中是否存在生物学靶标。
在又一方面，本发明提供了用于检测生物学靶标存在的方法。所述方法包括下述这些。允许第一探针和第二探针与靶标结合。所述第一探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团。所述第二探针包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团是反应性的。允许所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸序列杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定样品中是否存在所述生物学靶标。在一个实施方案中，所述第一和第二反应基团之间的反应产生荧光部分。在另一实施方案中，所述第一和第二反应基团之间的反应产生化学发光和/或发色部分。
图8阐述了本发明的另一实施方案，其使用“压缩码”夹板结构用于基于核酸模板的生物检测。在该实施方案中，与靶标结合部分直接与互补寡核苷酸(其杂交并开始核酸模板反应)连接(可选地通过间隔基团)不同，靶标结合部分与“压缩码”寡核苷酸序列连接。每个相应的报告寡核苷酸具有互补的、“压缩码”序列(除开始核酸模板反应的“报告”序列外)O核酸模板化学反应通过报告寡核苷酸的杂交开始，所述报告寡核苷酸与反应并产生可检测信号的反应基团连接。重要的是探针的每个寡核苷酸序列仅与其目的杂交配偶体互补，不与检测体系中的其它寡核苷酸互补。
所述压缩码结构支持产生信号报告子-寡核苷酸缀合物，所述缀合物会与不同的下游报告寡核苷酸通过 反压缩码序列装配。可如下文所述简单地测试与独特的反压缩码连接的不同报告子文库:将化学计量的结合物-压缩码寡核苷酸与其互补压缩码的缀合物与每个独特的压缩码混合。
图9是对压缩码夹板结构途径的阐述，其中靶标结合部分是两个适体。在用说明性寡核苷酸序列和报告子化学(例如三苯膦、TPP和7-叠氮香豆素、AzC)检测血小板衍生
的生长因子(TOGF)的该例子中，通过压缩码序列(NNN......)与TPP报告寡核苷酸上互补
的反压缩码序列(N' N' N'......)的杂交将TPP报告寡核苷酸自我装配至TOGF适体寡
核苷酸上。报告寡核苷酸末端是示例性的10碱基报告序列和5’-TPP基团。带有不同压缩码和反压缩码(成对彼此互补)的独立寡核苷酸对也自我装配，以提供AzC报告序列和3’ -AzC基团。AzC寡核苷酸与TPP寡核苷酸互补并反向平行，使得当TPP和AzC寡核苷酸彼此退火时，TPP和AzC基团端对端地终止。
图10更详细地阐述了用出性寡核苷酸序列和报告化学(TPP和AzC)检测TOGF的压缩码夹板结构途径。首先，TPP对在5’端包括TOGF适体，C18基于聚乙二醇的间隔和18个成员的压缩码序列。TPP报告序列在其3’端包括互补的反压缩码序列，C18 PEG间隔，和终止于5’TPP基团中的十碱基对报告序列。寡核苷酸的AzC对包括通过C18 PEG间隔与独立压缩码连接的3’ -适体，和与5’反压缩码连接的检测寡核苷酸，一个C18 PEG间隔和一个终止于3' AzC基团中的报告寡核苷酸。
图11阐述了相应设计的例子，其中使用抗体代替适体作为靶标结合部分。
“压缩码”途径的一个优点在于下述能力:独立地产生报告寡核苷酸，在维持结合物和核酸模板激活化学二者的活性的条件下将它们装配在一起。
压缩码体系基于两对寡核苷酸，通过独特压缩码和压缩码对的碱基配对将每对结合。“压缩码”是与它们的互补序列特异结合的寡核苷酸序列，它们优选被设计为使得:它们不与已知的基因组序列互补(如果样品可能含有基因组DNA的话，则相关)，具有相似的Tm值，缺乏显著的二级结构，不与检测体系中其它的压缩码或反压缩码序列退火。
因此，本发明的另一方面提供了用于检测生物学靶标存在的方法。所述方法包括下述这些。提供第一探针，其包含(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸压缩码序列。提供第二探针，所述第二探针包含(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，和(2)第二寡核苷酸压缩码序列。所述第一探针与第一报告探针杂交，所述第一报告探针包含(I)与所述第一寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸反压缩码序列，(2)第一报告子寡核苷酸，和(3)第一反应基团。所述第二探针与第二报告子探针杂交，所述第二报告子探针包含(I)与所述第二寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸反压缩码序列，(2)第二报告子寡核苷酸，和(3)第二反应基团。所述第二报告子寡核苷酸能够与所述第一报告子寡核苷酸序列杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。将所述第一和第二探针与用于测试所述生物学靶标存在的样品接触。当样品中存在`所述生物学靶标时，允许所述第一和第二探针与所述生物学靶标结合，从而所述第二报告子寡核苷酸与所述第一报告子寡核苷酸杂交，使得所述第一和第二反应基团开始反应性接近。检测所述第一和第二反应基团之间的反应，从而测定样品中是否存在所述生物学靶标。
值得指出的是，本发明的方法不要求对第一和/或第二寡核苷酸序列进行酶连接或化学连接。
最优化压缩码结构设计中可考虑的因素包括例如(I)适体/抗体和压缩码(间隔I)之间的间隔基团(例如寡核苷酸和/或非碱基基团)，用于例如允许杂交配偶体彼此到达，防止任何位阻；(2)压缩码序列的长度，为了与反压缩码序列形成足够稳定的退火而形成复合物；和⑶反压缩码和报告序列之间的间隔基团(间隔2)，用于例如防止任何位阻。
附着在寡核苷酸上的结合物(靶标结合部分)可以是与靶标分子特异结合并允许本发明的设计运作的任何化学部分。例子包括大范围的官能团，例如(I)抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgE、Fab' s、Fab'、F (ab) 2、Dab、Fv 或 ScFv 片段；(2)小分子结合物，例如抑制齐U、药物、辅因子；⑶蛋白质检测报告子，反之亦然；(4)0嫩、1 應、？嫩适体；(5)用于DNA结合的DNA序列和调节蛋白；(6)代表蛋白质结合基序的肽；(7)通过噬菌体展示、随机合成、诱变发现的肽；(8)天然结合蛋白质对和复合物；(9)抗原(用于抗体检测)；和(10)独立附着在两个寡核苷酸上的单个多克隆抗体，其可用作不同特异性的两个独立结合物。
与寡核苷酸结合的靶标结合部分可以是针对相同靶标中不同位点的异种类型。例如，两个结合物可以是两个不同的抗体、一个抗体和一个受体、一个抗体和一个小分子结合物、一个受体和一个肽、一个适体和一个辅因子或任何其它组合。
靶标待分析物可以是任何类型的，只要靶标支持两个(或更多)结合位点即可。两个结合位点可相同或不同。位点相同的情况下，将不会获得用两个不同结合物所获得的特异性提高的好处。可通过一对探针来检测存在于单体形式和同型二聚体或更高聚合作用相的平衡之中的分子，所述探针含有相同的结合物但是不同的互补DNA序列。合适的靶标包括蛋白质、细胞表面、抗体、抗原、病毒、细菌、器官表面、膜、细胞器、固定细胞的原位分析、蛋白质复合物。本发明可具体地适用于检测融合蛋白(例如存在BCR和ABL时为BCR-ABL)。
图12显示了一个·实施方案——如何通过核酸模板化学使用荧光团或发色团的合成报告蛋白质或小分子结合测定。在该例子中，五边形所代表的蛋白质结合物(如适体、抗体或小分子结合物)与末端具有反应基团X的寡核苷酸(“模板”)缀合。样品与结合物-模板混合，如果存在目的待分析物(用圈代表)，则形成复合物。去除多余的结合物-模板，并添加带有反应基团Y的探针和与上述模板互补的寡核苷酸。寡核苷酸的杂交使得X和Y之间的反应起始，从而产生可检测的信号分子(例如荧光团或发色团)。
信号分子(用星号代表)可保持与探针-模板杂交体结合，或可从复合物被释放。待分析物可与固相结合，或可游离于溶液中，只要在添加带有Y的探针之前去除多余的结合物-模板即可。
因为模板和探针独特地编码对报告子的合成，并且可以预见到许多不同的报告子，因此可设计多路体系(multiplex system)。例如。可创造具有间隔(例如均勻间隔)发射的一列荧光团，允许同时检测两种、三种、四种、物种或更多的待分析物。另外，可设计一种体系，其中同时产生有色和荧光化合物。
在探针设计中，一个考虑是带有反应基团的两个报告序列的Tm。由于不存在靶标时双链体的TmS当低于室温，因此该序列通常应当较短，例如6-15个碱基和/或富含A-T。10碱基对的典型报告子长度在低盐浓度下可具有30°C左右的Tm。因此，通常甚至对短序列也需要添加10%到40%体积/体积的甲酰胺，将温度进一步降低至低于测定温度，或提高测定温度。非常短的报告寡核苷酸可遭受特异性缺乏并对不期望的压缩码序列(当使用这些序列时)显示部分结合。
探针设计中的另一因素是结合部分和报告序列之间包括任何压缩码序列的寡核苷酸的长度。它们必需足够长，使得报告子寡核苷酸能彼此到达并退火。序列可用聚乙二醇(PEG)接头分散，所述接头是弹性的，并可提供针对任何位阻的额外保护。例如，寡核苷酸总长度可在35碱基长左右。也可使用含0、1广义2个C18 PEG间隔的寡核苷酸或同聚物束(即Cltl)。
第三个考虑是使用压缩和反压缩序列时它们的长度(即图9和图34)。除了需要每个压缩码仅与其反压缩码退火而不与任何其它压缩码、反压缩码或报告序列退火外，一个重要的参数是压缩码和反压缩码之间双链体的τπ。该TmS当显著高于测定中会使用的最高温度，使得报告寡核苷酸保持与结合部分牢固地结合。在实践中，约为报告序列长度两倍的压缩码(即总长度为15-30碱基)是想要的，其通常满足这些标准。
关于信号产生的方面，可使用核酸模板化学产生或消除影响光学信号的标签，例如产生或消除荧光、化学发光或发色分子。另外，可对检测反应加以设计，来产生或消除直接或间接产生可检测标签的产物，例如下述这些产物，所述产物催化产生光学标签的反应；抑制产生光学标签的反应；是突光淬灭剂；是突光能量转移分子；产生Ramen标签；产生电化学发光标签(即ruthernium bipyridyl);生产电子自旋标签分子。
另外，可对检测反应加以设计，以包括“无标签”检测。可使用核酸模板化学来产生或消除可通过分子的固有天然性质辨别的分子，例如下述产物，所述产物产生光散射标签或聚集；可通过微量量热法检测；可通过表面等离振子共振(即与固定的抗体结合)检测(例如表位)；产生或破坏被抗体识别的表位(即ELISA);通过质谱法测量具有可辨别的质量；具有改变的尺寸，可通过光散射、凝胶电泳或尺寸排除色谱辨别；具有改变的疏水性或离子含量，可通过色谱辨别；具有改变的对亲和色谱分离的亲和力。
本发明的另一方面提供了可用于检测生物学待分析物的试剂盒。所述试剂盒包括第一探针，其包括(I)对所述生物学待分析物具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团；和第二探针，其包含(I)对所述生物学待分析物具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团。所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸序列杂 交。当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。
在又一方面，本发明提供了可用于检测生物学待分析物的试剂盒。所述试剂盒包括第一探针，其包括(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，和(2)第一寡核苷酸压缩码序列；和第二探针，所述第二探针包含(I)对所述生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，和(2)第二寡核苷酸压缩码序列。所述第一探针能够与第一报告探针杂交，所述第一报告探针包含(I)与所述第一寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸的反压缩码序列，(2)第一报告子寡核苷酸，和(3)第一反应基团。所述第二探针能够第二报告探针杂交，所述第二报告探针包含(I)与所述第二寡核苷酸压缩码序列互补的寡核苷酸反压缩码序列，
(2)第二报告子寡核苷酸，和(3)第二反应基团。所述第二报告子寡核苷酸能够与所述第一报告子寡核苷酸序列杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的。
本发明包括下述试剂盒，所述试剂盒提供本文所述的一种、两种或更多探针。更具体地，本发明包括提供一种、两种或更多探针的试剂盒，所述探针利用核酸模板化学用于产生可检测的信号，作为检测生物学靶标(例如核酸和蛋白质)存在的一种手段。
报告子化学
香豆素
香豆素可用于报告化学中，特别是7-位上带有供电子取代基的香豆素。下文的流程图阐述了如何使用核酸模板化学完成从7-叠氮香豆素(已知是非荧光的)到7-氨基衍生物(荧光的)的还原。
制备第I寡核苷酸
权利要求
1.用于检测生物学靶标的方法，所述方法包括； (a)提供第一探针，所述第一探针包含(I)对生物学靶标具有亲合力的第一结合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)与所述第一寡核苷酸序列结合的第一反应基团； (b)提供第二探针，所述第二探针包含(I)对生物学靶标具有亲合力的第二结合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)与所述第二寡核苷酸序列结合的第二反应基团，其中所述第二寡核苷酸能够与所述第一寡核苷酸杂交，且当彼此开始反应性接近时，所述第二反应基团对所述第一反应基团来说是反应性的； (c)将所述第一探针与所述第二探针与用于测试生物学靶标存在的样品在下述条件下结合，所述条件下所述第一和第二结合部分与生物学靶标结合； (d)允许所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交，使所述第一和第二反应基团开始反应性接近，其中所述第一和第二反应基团彼此进行化学反应从而产生反应产物；和 (e)检测所述反应产物是否存在,如果存在所述反应产物则表示存在所述生物学靶标。
2.权利要求
1所述的方法，其中所述第一探针还包含所述第一结合部分和所述第一寡核苷酸序列之间的第一接头。
3.权利要求
1所述的方法，其中所述第二探针还包含所述第二结合部分和所述第二寡核苷酸序列之间的第二接头。
4.权利要求
1所述的方法，其中所述生物学靶标是蛋白质。
5.权利要求
1所述的方法，其中所述生物学靶标是自身抗体。
6.权利要求
1所述的方法，其中所述生物学靶标是细胞。
7.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分中至少一个是针对所述生物学靶标的抗体。
8.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分均为针对所述生物学靶标的抗体。
9.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分中至少一个不是针对所述生物学靶标的抗体。
10.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分中至少一个是与所述生物学靶标结合的适体。
11.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分均为与所述生物学靶标结合的适体。
12.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分中至少一个是小分子结合物。
13.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二结合部分均为小分子结合物。
14.权利要求
1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列包含6到30个碱基的互补区。
15.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二反应基团之间的反应产生的反应产物是荧光部分。
16.权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二反应基团之间的反应产生的反应产物是化学发光部分或发色部分。
17.权利要求
1所述的方法，其中当所述样品中不含所述生物学靶标时，基本不产生可检测的反 应产物。
专利摘要
本发明提供了用于检测生物靶标(例如核酸和蛋白质)的组合物和方法，所述方法通过核酸模板化学，例如通过产生荧光、化学发光和/或发色信号来实现。
文档编号C12Q1/68GKCN101248189 B发布类型授权 专利申请号CN 200680027521
公开日2013年5月1日 申请日期2006年5月26日
发明者詹姆斯·M·库尔, 安德鲁·M·斯登, 劳伦斯·A·哈夫, 芭芭拉·S·福克斯, 黄玉梅 申请人:通信改革公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),