专利名称:一种利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种紫外诱变耐酸性运动发酵单胞菌的方法及利用该菌株开放式发酵 餐厨垃圾生产乙醇的方法。
技术背景
近年来，随着经济的不断发展，化石能源的日益枯竭，对可再生能源的研究日益受 到人们重视。燃料乙醇由于其制备工艺简单，并且可以作为乙醇汽油使用，得到了世界 各国的广泛关注。近年来，人们对利用微生物发酵生产燃料乙醇的技术进行了广泛研究， 公开号为CN1948498的专利公布了一种利用酵母发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的方法， 具有原料价格成本低，环境效益重大的优点，但发酵时间需要近60h，周期较长。近年 来，运动发酵单胞菌由于其乙醇产率高，发酵速率快，易进行基因改良等优点而日益受 到人们的重视。但由于该菌株生长条件不如酵母菌粗犷，而制约了其大规模应用的前景。 除却菌株的发展，各种节能低耗的发酵工艺更是不断被研发出来。不灭菌的开放式发酵 可以省却灭菌所需的大量能耗，同时可以避免高温灭菌过程中对营养物质的破坏，而日 益受到人们重视。控制底物至较酸环境，同时尽量縮短发酵时间是实现开放式发酵的重 要条件。若能获得一株在不易孳生杂菌的酸性条件下仍能正常生长且乙醇产率比酵母更 高的菌种，则能够省却在生产过程中的灭菌步骤，从而大大降低运行成本，使工艺简单、 节能、经济。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用经紫外诱变的耐酸性细菌在开放式条件下发酵餐厨 垃圾生产乙醇的方法，无需外加任何营养物质，无需严格的无菌操作条件，易于控制， 具有简单、节能、经济的优势。
本发明所述的乙醇生产方法，是采用不灭菌的开放式乙醇发酵方式，即取消现有酶 解一乙醇发酵工艺中高温灭菌步骤。
本发明目的通过如下步骤实现
1)出发菌株运动发酵单胞菌Zy附omo"Mwo6/fc 70225的酸性驯化 以中国工业微生物菌种保藏中心的运动发酵单胞菌Z:v附o附o"as woWfc 70225为出发菌株，利用0.05~ 0.10 mol/L的HC1溶液调节液体葡萄糖基础培养基至pH为3.5~4.5， 加入琼脂，制成固体培养基，灭菌后待用。将运动发酵单胞菌活化三代后，在已准备好 的固体葡萄糖基础培养基中用双层涂布平板法对其进行划线分离，选取生长旺盛的菌株 作为出发菌株进行下一轮酸性驯化，出发菌株经过三轮驯化，使得细菌能够在酸性条件 下高效生长，选取生长能力强的一株菌，接入液体葡萄糖基础培养基，制成菌株悬液， 进行后续的酸性发酵试验。
2) 耐酸性菌株的紫外诱变
将驯化后的耐酸菌株接种到液体葡萄糖基础培养基，制成菌株悬液，用无菌水稀释 至每毫升106-108个细胞，取稀释液l 3ml置于培养皿中进行紫外照射，照射后，诱变 菌液在黑暗冷冻中保存l-2h，然后在红灯下稀释，在固体葡萄糖基础培养基上涂菌进 行筛选，培养温度为30-35。C，时间为24-48小时，挑选长势良好的菌株进行乙醇发酵 试验，根据诱变株在液体葡萄糖基础培养基中产乙醇的能力，筛选出一株发酵速度最快， 产乙醇能力最高且稳定性好的菌株，置于4'C左右的冰箱中保存备用。
紫外照射的紫外灯功率为15-20W，紫外照射距离为20-30cm，照射时间为30~60秒。
3) 利用上述耐酸性运动发酵单胞菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇 将粉碎后的餐厨垃圾与水按1-2: 1的质量比进行混合，用稀盐酸将其pH调节到
3.5-4.5，得到餐厨垃圾的发酵培养基，然后按每克餐厨垃圾发酵培养基接入50-150 U 的糖化酶和蛋白酶，然后将经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌接入液体葡萄糖基础培 养基培养24 36h,得到接种液，并按照每100g餐厨垃圾发酵培养基5-10ml运动发酵单 胞菌的比例接入经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌，在30-35'C的密闭发酵摇瓶中进 行不灭菌的厌氧发酵，发酵时间为24-48小时，再经过蒸馏提纯，即获得工业乙醇产品。
葡萄糖基础培养基所含组分及配比为液体葡萄糖基础培养基为葡萄糖100g，酵
母膏5g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g，硫酸铵lg，水1000ml;固体葡萄糖基础培养
基为在上述成分基础上再加入20g的琼脂。
本发明具有如下优点本发明所选用的生产菌种为经紫外诱变的运动发酵单胞菌，
替代了传统乙醇发酵所用的酵母菌，该菌具有产乙醇效率高，产生物量少，产醇速率快，
乙醇耐受力强，能够在偏酸性的pH条件下发酵，发酵时无需控制加氧，耐高渗透压，
易于基因操作。本发明无须高温灭菌发酵底物，无需严格的无菌操作条件；发酵过程无须额外添加 任何营养物，生产条件温和，能耗低，无污染。
本发明所述的生产乙醇用原料可以是家庭、餐饮业抛弃的餐厨垃圾，其营养丰富， 在整个乙醇发酵过程中无需外加任何营养物质。
具体实施方式
实施例1:
以中国工业微生物菌种保藏中心的运动发酵单胞菌Zy附omowm wo6z'fc 10225为出 发菌株，利用0.07mol/L的HCl溶液调节液体葡萄糖基础培养基至pH为4。葡萄糖培 养基的所含组分及配比为液体培养基为葡萄糖100g，酵母膏5g，磷酸二氢钾lg，硫 酸镁0.5g，硫酸铵lg，水1000ml，再加入20g的琼脂，制成固体培养基，灭菌后待用。 将运动发酵单胞菌活化三代后，在已准备好的固体培养基中用双层涂布平板法对其进行 划线分离，选取生长旺盛的菌株作为出发菌株进行下一轮酸性驯化，出发菌株经过三轮 驯化，选取生长能力强的一株菌，接种至pH为4的葡萄糖基础培养基制成菌株悬液， 用无菌水稀释至每毫升106-108个细胞，取稀释液2ml置于培养皿中进行紫外照射，紫 外灯功率为20W，紫外照射距离为25cm，照射时间为40秒，照射后，诱变菌液在黑 暗冷冻中保存1.5h，然后在红灯下稀释，在固体培养基上涂菌进行筛选，培养温度为 35°C，时间为30小时，筛选出一株发酵速度最快，产乙醇能力最高且稳定性好的菌株。 分别将出发菌株和诱变的菌株接种到pH为4的液体葡萄糖基础培养基，发酵40h，测 定乙醇产量，其中诱变菌株产乙醇为48g/L，而出发菌株则几乎不生长，表明诱变菌株 能够在酸性条件下高效地生产乙醇，而未经过酸性驯化的菌株则不能够生成乙醇。
将粉碎后的餐厨垃圾与水按1.5: l的质量比进行混合，用0.05 mol/L稀盐酸调节 pH至4左右，得到餐厨垃圾发酵培养基。添加每克餐厨垃圾培养基各100U的糖化酶 及蛋白酶，同时按照7%(V/M)(接种液体积和餐厨垃圾培养基的质量比)的比例接入 预先在液体葡萄糖基础培养基培养24小时的经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌，35 。C条件下在密闭发酵摇瓶中厌氧发酵48小时，测定乙醇浓度，最终的乙醇浓度为48g/L， 表明驯化后的耐酸性运动发酵单胞菌可以在酸性条件下开放式发酵餐厨垃圾产乙醇。
实施例2:
将粉碎后的餐厨垃圾与水按2: 1的质量比进行混合，用0.05mol/L稀盐酸调节pH 至4左右，得到餐厨垃圾发酵培养基。添加每克餐厨垃圾培养基各100U的糖化酶及蛋白酶，同时按照5%(V/M)(接种液体积和餐厨垃圾培养基的质量比)的比例接入预先 在液体葡萄糖基础培养基培养24小时的将如实施例1所述的经紫外诱变的耐酸性运动 发酵单胞菌，35'C条件下在密闭发酵摇瓶中厌氧发酵48小时，测定乙醇浓度。
对比实验将粉碎后的餐厨垃圾与水按2: 1的质量比进行混合，维持pH在7左 右，得到餐厨垃圾发酵培养基，12rC灭菌20min后，添加每克餐厨垃圾发酵培养基各 100U的糖化酶及蛋白酶和10%(V/M)(接种液体积和餐厨垃圾培养基的质量比)经事 先活化的的酵母菌液，35'C条件下在密闭发酵摇瓶中厌氧发酵60个小时。
结果表明运动发酵单胞菌发酵到40 h就己经基本结束，乙醇浓度达到53g/L，而 酵母发酵60 h才基本结束，其乙醇浓度仅为32 g/L。因此经紫外诱变的耐酸性运动发 酵单胞菌与传统的酵母菌相比，具有发酵速度快，发酵时间短，能够在不灭菌条件下进 行开放式发酵等优点。
实施例3:
将粉碎后的餐厨垃圾与水按2: 1的质量比进行混合得到餐厨垃圾发酵培养基，用 0.07mol/L稀盐酸调节pH至4，将运动发酵单胞菌的原始菌株接种至未调节pH的液体 葡萄糖基础培养基，经将如实施例1所述的紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌接种至调 节pH为4的液体葡萄糖基础培养基，培养24小时，得到菌株悬液。按照每克餐厨垃 圾添加各120U的糖化酶及蛋白酶，同时分别接入运动发酵单胞菌的原始菌株和经紫外 诱变的耐酸性运动发酵单胞菌菌株悬液各7%(V/M)(接种液体积和餐厨垃圾培养基的 质量比)，3(TC条件下在密闭发酵摇瓶中厌氧发酵42个小时，得到发酵液后，蒸馏得到 乙醇。其中未经驯化的原始菌株几乎不生成乙醇，经过紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞 菌产乙醇浓度为53g/L，由此可见经过紫外诱变的耐酸性菌株可以在酸性条件下进行不 灭菌发酵而获得较高的乙醇产率。
实施例4:
将如实施例1所述的经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌接入pH调节到4的液体 葡萄糖基础培养基，培养24小时，得到菌株悬液备用。将粉碎后的餐厨垃圾与水按1.5: 1的质量比进行混合得到餐厨垃圾发酵培养基，，将培养基分为两类， 一类进行灭菌处 理，不调节pH，另一类不进行灭菌处理，使用0.08mol/L调节pH至4,2;两类培养基 按照每克餐厨垃圾培养基添加各150U的糖化酶及蛋白酶，10%(V/M)(接种液体积 和餐厨垃圾培养基的质量比)的经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌悬液，35'C条件下在密闭发酵摇瓶中厌氧发酵40个小时，得到发酵液蒸馏得到乙醇。其中经过灭菌处理 的发酵液乙醇浓度为50g/L,不经过灭菌处理的培养基乙醇浓度为53g/L。从结果来看， pH为4左右的的酸性条件可以和灭菌处理得到相当的乙醇产量。酸性条件有效地避免 杂菌的污染，并且由于营养物质没有经受高温的破坏，乙醇的产量还有所提高。
权利要求
1、一种利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，其特征在于，具体实施步骤为
1)以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 10225为出发菌株，利用0.05～0.10mol/L的HCl溶液调液体葡萄糖基础培养基的pH为3.5～4.5，加入琼脂，制成固体培养基，将运动发酵单胞菌活化三代后，采用双层涂布法在准备好的固体葡萄糖基础培养基中进行菌株筛选，选取生长旺盛的菌株进行三轮酸性驯化，选取生长能力强的一株菌，接入液体葡萄糖基础培养基，制成菌株悬液；
2)将步骤1)的菌株悬液用无菌水稀释至每毫升106-108个细胞，取稀释液1～3ml置于培养皿中进行紫外照射，照射后，将诱变菌液在黑暗冷冻中保存1-2h，然后在红灯下稀释，在固体葡萄糖基础培养基上涂菌进行筛选，培养温度为30-35℃，时间为24-48小时，挑选长势良好的耐酸性运动发酵单胞菌株置于4℃左右的冰箱中保存；
3)将粉碎后的餐厨垃圾与水按1-2∶1的质量比进行混合，用稀盐酸将其pH调节到3.5-4.5，得到餐厨垃圾的发酵培养基，按每克餐厨垃圾发酵培养基接入50-150U的糖化酶和蛋白酶，然后将步骤2制得的耐酸性运动发酵单胞菌接入液体葡萄糖基础培养基培养24～36h，得到接种液，并按照每100g餐厨垃圾发酵培养基5-10ml运动发酵单胞菌的比例接入经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌，在30-35℃的密闭发酵摇瓶中进行不灭菌的厌氧发酵，发酵时间为24-48小时，最后蒸馏提纯，得到乙醇。
2、 如权利要求
1所述的利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，其 特征在于，使用的Zymomo"w wo6!'fc 70225出发菌株为中国工业微生物菌种保藏中心 的运动发酵单胞菌。
3、 如权利要求
l所述的利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，其 特征在于，所述液体葡萄糖基础培养基的组分及配比为葡萄糖100g，酵母膏5g，磷 酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g，硫酸铵lg，水1000ml;所述固体葡萄糖基础培养基为在液体葡萄糖基础培养基成分基础上加入20g的琼脂。
4、 如权利要求
1所述的利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，其特征在于，所述紫外照射的紫外灯功率为15-20W，紫外照射距离为20-30cm，照射时 间为30-60秒。
专利摘要
本发明公开了一种利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，涉及细菌的诱变选育过程及利用该菌株开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇。具体步骤是对运动发酵单胞菌出发菌株进行诱变，得到能够在酸性条件下高产乙醇的运动发酵单胞菌；利用细菌进行开放式乙醇发酵，将粉碎后的餐厨垃圾与水按1-2∶1的质量比进行混合，并调节pH至4左右；将诱变的耐酸性运动发酵单胞菌接入餐厨垃圾进行开放式厌氧发酵；蒸馏乙醇。本发明所筛选出的运动发酵单胞菌能够在不易生长杂菌的酸性条件下生长并进行乙醇发酵，且整个反应过程不需要灭菌，大大降低了其运行成本。
文档编号C12P7/02GKCN101314781SQ200810115663
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月26日
发明者张文毓, 汪群慧, 赵芳妮, 马鸿志 申请人:北京科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan