专利名称:用于产生莽那亭的方法
技术领域：
本发明涉及使用L-氨基酸氨基转移酶等产生莽那亭(Monatin)的方法。
背景技术：
莽那亭[4_(卩引哚 _3_ 基-甲基)-4-轻基-谷氨酸](4_ (indole-3-yl-methyl) _4-hydroxy-glutamic acid)是一种包含于南非的灌木 Schlerochitom ilicifolius 的根中的氨基酸，并特别期待其作为低热量增甜剂，因为其具有为蔗糖一千数百倍的甜度(参见专利文献I)。莽那亭在位置2和4具有不对称碳原子，且莽那亭的天然存在的立体异构体为2S，4S异构体。已通过有机化学方法合成了非天然存在的三种立体异构体。所有这些立体异构体具有优异的甜度，并期待用作增甜剂。
已报道几种方法作为产生莽那亭的方法(例如，参见专利文献2)。然而，所有报道的方法需要多阶段的步骤，并因此需要改善莽那亭的合成收率。
具体而言，对于用于产生莽那亭的方法，已知下述用于产生2R，4R_莽那亭的方法，即从L-色氨酸(L-Trp)合成吲哚-3-丙酮酸(根据需要，在后文中称作“IPA”)，从所得的IPA和丙酮酸合成4R形式的4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-2-酮戊二酸(根据需要，在后文中称作“4R-IH0G”)，并随后对获得的4R-IH0G进行肟化反应，还原反应和差向异构-结晶方法(常规方法(I))(参见专利文献2)。
然而，醛缩酶步骤(第二步骤)是平衡反应，因此，并不总是在该反应中获得令人满意的收率。
用于产生2R，4R_莽那亭的常规方法(I)
t肟化
脱氨酶醛缩酶+
(脱氨)(缩合)还原
a a a a
T NHT NHT NHT NH
i i yco2h 5e<r 5 :
H2N CO2H^CO2HOHO CO2H uHO CO2H
L-TrpIPA4R-IHOG2民4R-莽那亭
为了改善2R，4R_莽那亭的收率，已经发明了通过一锅法酶反应产生2R，4R_莽那亭的方法(常规方法(2))(参见专利文献3至6)。
专利文献I JP Sho-64-25757-A
专利文献2 :国际公开W02003/059865
专利文献3 :国际公开W02007/133184
专利文献4 国际公开TO2005/042756
专利文献5 :美国专利公开号2006/0252135说明书[0014]专利文献6 :美国专利公开号2008/020434说明书
发明内容
发明待解决的问题
本发明的目标是提供以良好收率产生莽那亭的方法。
解决问题的手段
作为广泛研究的结果，本发明发现上述问题可通过使用L-氨基酸氨基转移酶来解决，并完成了本发明。目前尚未知任何作用于4R-IH0G的L-氨基酸-氨基转移酶。
相应地，本发明如下所述
[I] 一种用于产生2S，4R_莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将 4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。
[2] [I]的产生方法，进一步包括将酮酸与脱羧酶相接触而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-氨基酸形成的。
[3] [I]的产生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。
[4] [3]的产生方法，进一步包括将草酰乙酸与草酰乙酸脱羧酶相接触而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-天冬氨酸形成的。
[5] [I]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒杆菌属(Corynebacterium)、洛德酵母属(Lodderomyces)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌属(Dietzia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、Carnimonas 属、西洋蓍霉属(Yarrowia)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲焼嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、席蓝细菌(Phormidium)、火球菌属(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母属(Saccharomyces)、嗷糖菌属(Saccharophagus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)或栖热菌属(Thermus)的微生物。
[6] [5]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)、高地芽抱杆菌(Bacillus altitudinis)、解纤维芽抱杆菌(Bacillus ce I lulosi Iyt icus)、短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、芽抱杆菌属菌种(Bacillus sp.)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、平常假丝酵母(Candida inconspicua)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、长抱洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)、微杆菌属菌种(Microbacterium sp.)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronocllolis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)、寡养单胞菌属菌种(Stenotrophomonassp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia mar is)、Ochrobactrum pseudogrignonense、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowia lypolytica)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、Deinococcus geothermal is、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、热自养甲烧嗜热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、Phormidium lapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解卩遼糖菌(Saccharophagus degradans)、 苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的微生物。
[7] [I]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶由与以EQ ID NO :2、SEQ IDNO :48、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 9USEQ ID NO 93, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO:99、SEQ ID NO 10U SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 105,SEQ ID NO107,SEQ ID NO :109 或SEQ ID NO :111表示的氨基酸序列显示90%或更高同一性的氨基酸序列组成。
[8] [7]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，所述氨基酸残基选自下组位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431处的氨基酸残基。
[9] [8]的产生方法，其中所述一种或多种氨基酸残基的突变选自下组
i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；
ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；
iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；
iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；
V)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；
vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；
vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；
viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；
ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；
X)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和
xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。
[10] [I]的产生方法，其中使用表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触。
[11] [I]的产生方法，进一步包括将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IH0G。
[12] [11]的产生方法，通过将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸与醛缩酶相接触而将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合。[0043][13] [11]的产生方法，其中至少部分用于形成4R-IH0G的丙酮酸是来自由于草酰乙酸脱羧酶的作用从草酰乙酸形成的丙酮酸。
[14] [11]的产生方法，进一步包括使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
[15] [14]的产生方法，其中所述色氨酸通过将色氨酸与脱氨酶相接触来脱氨基。
[16] [11]或[14]的产生方法，其中所述2S，4R_莽那亭或其盐的产生是在一个反应器中进行的。
[17] 一种用于产生2R，4R_莽那亭或其盐的方法，包括下述⑴和(II)
(I)进行[I]的方法而形成2S，4R_莽那亭；和
(II)异构化2S，4R_莽那亭而形成2R，4R_莽那亭。[18] [17]的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。
[19] [17]的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。
[20] 一种L-氨基酸氨基转移酶，其为选自下组(A)-(D)的蛋白
(A)蛋白，其由以 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQID NO :61 表示的氨基酸序列组成。
(B)蛋白，其包含以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列。
(C)蛋白，其由与以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列显示90%或更高同一性，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成；和
(D)蛋白，其由在以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成，所述突变选自下组氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入。
[21] [20]的L-氨基酸氨基转移酶，其中L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ IDNO :2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，其中氨基酸残基选自下组位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288和位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基。
[22] [21]的L-氨基酸氨基转移酶，其中所述一个或多个氨基酸残基的突变选自下组
i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；
ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；
iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；
iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；
V)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；
vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；
vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；
viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；
ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；
X)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和
xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。[0070][23] 一种多核苷酸，选自下组(a)-(e)
(a)多核苷酸，其由以 SEQ ID NO USEQ ID NO : 47、SEQ ID N0:52 或 SEQ ID NO:60表示的核苷酸序列组成；
(b)多核苷酸，其包含以 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 52 或 SEQ IDNO 60表不的核苷酸序列；
(c)多核苷酸，其由与以 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 52 或 SEQ ID
NO 60表不的氣基酸序列显不90%或更闻同一性,并编码具有L-氣基酸氣基转移酶的蛋白的核苷酸序列组成；(d)多核苷酸，其在严格条件下与由互补于以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ IDN0:52或SEQ ID NO :60表示的核苷酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有L-氨基酸氨基转移酶活性的蛋白；和
(e)多核苷酸，其编码[20]的L-氨基酸氨基转移酶。
[24] 一种表达载体,其包含[23]的多核苷酸。
[25] 一种转化体，其导入[24]的表达载体。
[26] 一种用于产生L-氨基转移酶的方法，包括在培养基中培养[25]的转化体而获得L-氨基酸氨基转移酶。
[27] 一种产生2S，4R_莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IH0G与[20]的L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。
[28] 一种用于产生2R，4R_莽那亭或其盐的方法，包括下述(I’ )和(II’ )
(I’ )进行[27]的方法而形成2S，4R_莽那亭；和
(II’)异构化2S，4R_莽那亭而形成2R，4R_莽那亭。
[29] [28]的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。
[30] [28]的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。
发明的效果
本发明的方法可通过使用L-氨基酸氨基转移酶从4R-IH0G以良好收率产生2S，4R-莽那亭而有助于莽那亭收率的改善。本发明的方法具有下述优点:当从IHOG形成2S，4R-莽那亭时无需使用昂贵的D-氨基酸(D-Asp等)作为底物，或无需添加酶如消旋酶以从L-氨基酸形成D-氨基酸。在本发明的方法中，当不仅进行从4R-IH0G形成2S，4R-莽那亭的反应(第三步)，还进行从L-Trp形成IPA的反应(第一步)，和进行从IPA形成4R-IH0G的反应(第二步)时，可在第三步中限定全反应的平衡，并将第二步中的反应平衡极大地移向形成4R-IH0G的方向。在此情况下，本发明的方法使得可通过避免副产物L-Trp (第一步的逆反应的进程)而以非常良好的收率(yield)产生2S，4R-莽那亭。
图I是显示本发明的产生方法的一个实例的图。Trp :色氨酸；IPA:D引哚-3-丙酮酸；IHOG :4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-2-酮戊二酸；莽那亭4-(吲哚-3-基-甲基)-4-轻基-谷氨酸。
图2是显示本发明的产生方法的一个实例的图。缩写与图I中的相同；和
图3是显示本发明的产生方法的一个优选实例的图。L-Trp :L_色氨酸；L_Asp L-天冬氨酸；OAA :草酰乙酸；PA :丙酮酸；而其他缩写与图I中的相同。
图4是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID166)以400ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。SR-莽那亭2S，4R-莽那亭；SS_莽那亭2S，4S_莽那亭；IH0G 4R-IH0G ；Trp :L-Trp。
图5是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID189)以80ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。缩写与图4中的那些类似。
图6是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID296)以80ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。缩写与图4中的那些类似。
实施发明的最佳模式(I)用于产生2S，4R_莽那亭或其盐的方法
本发明提供了用于产生2S，4R_莽那亭或其盐的方法(I)。本发明的产生方法可分类为(1-1) 一种用于从4R-IH0G产生2S,4R-莽那亭的方法，(1-2) —种用于从IPA和丙酮酸产生2S，4R-莽那亭的方法，和(1-3) —种用于从色氨酸产生2S，4R-莽那亭的方法。方法(1-1)、(1-2)和(1-3)在将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶在L-氨基酸的存在下相接触而形成2S，4R-莽那亭方面是共同的。
(1-1)用于从4R-IH0G产生2S，4R_莽那亭的方法
该方法包括在L-氨基酸的存在下将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭(反应I)。通过在L-氨基酸的存在下将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触，可将L-氨基酸中的氨基基团转移至4R-IH0G而形成2S，4R-莽那亭。
权利要求
1.一种用于产生2S，4R-莽那亭(2S，4R-M0natin)或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。
2.权利要求
I的产生方法，进一步包括将酮酸与脱羧酶相接触而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-氨基酸形成的。
3.权利要求
I的产生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。
4.权利要求
3的产生方法，进一步包括将草酰乙酸与草酰乙酸脱羧酶相接触而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-天冬氨酸形成的。
5.权利要求
I的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒杆菌属(Corynebacterium)、洛德酵母属(Lodderomyces)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根 瘤菌属(Rhizobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌属(Dietzia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、Carnimonas 属、西洋蓍霉属(Yarrowia)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲焼嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、席蓝细菌属(Phormidium)、火球菌属(pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母属(Saccharomyces)、嗷糖菌属(Saccharophagus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)或栖热菌属(Thermus)的微生物。
6.权利要求
5的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)、高地芽抱杆菌(Bacillus altitudinis)、解纤维芽抱杆菌(Bacillus ceIlulosiIyticus)、短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、芽抱杆菌属菌种(Bacillus sp.)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、平常假丝酵母(Candida inconspicua)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、长抱洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)、微杆菌属菌种(Microbacterium sp.)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronocllolis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)、寡养单胞菌属菌种(Stenotrophomonassp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia mar is)、Ochrobactrum pseudogrignonense、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iypolytica)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、Deinococcus geothermalis、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、热自养甲焼嗜热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、Phormidium lapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解曬糖菌(Saccharophagus degradans)、苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的微生物。
7.权利要求
I的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶由与以EQID N0:2、SEQ IDNO 48, SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 9USEQ ID NO 93, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO:99、SEQ ID NO 10U SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 105,SEQ ID NO107,SEQ ID NO :109 或SEQ ID NO :111表示的氨基酸序列显示90%或更高同一性的氨基酸序列组成。
8.权利要求
7的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶在以SEQID NO 2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，所述氨基酸残基选自下组位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431处的氨基酸残基。
9.权利要求
8的产生方法，其中所述一种或多种氨基酸残基的突变选自下组 i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸； ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸； iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺； iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸； V)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸； vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸； vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸； viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸； ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸； X)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和 xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。
10.权利要求
I的产生方法，其中使用表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体将4R-IH0G与L-氨基酸氨基转移酶相接触。
11.权利要求
I的产生方法，进一步包括使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IH0G。
12.权利要求
11的产生方法，通过使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸与醛缩酶相接触而将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合。
13.权利要求
11的产生方法，其中至少部分用于形成4R-IH0G的丙酮酸是来自由于草酰乙酸脱羧酶的作用而从草酰乙酸形成的丙酮酸。
14.权利要求
11的产生方法，进一步包括使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
15.权利要求
14的产生方法，其中所述色氨酸通过将色氨酸与脱氨酶相接触来脱氨基。
16.权利要求
11或14的产生方法，其中2S，4R-莽那亭或其盐的产生是在一个反应器中进行的。
17.一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I)和(II)(I)进行权利要求
I的方法而形成2S，4R-莽那亭；和 (II)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。
18.权利要求
17的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。
19.权利要求
17的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。
20.一种L-氨基酸氨基转移酶，其为选自(A)-(D)的蛋白
⑷蛋白，其由以 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQ ID NO :61 表示的氨基酸序列组成。
(B)蛋白，其包含以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列。
(C)蛋白，其由与以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列显示90%或更高同一性，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成；和
(D)蛋白，其由在以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的突变，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成，所述突变选自下组氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入。
21.权利要求
20的L-氨基酸氨基转移酶，其中L-氨基酸氨基转移酶在以SEQID NO2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，其中氨基酸残基选自下组位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288，位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基。
22.权利要求
21的L-氨基酸氨基转移酶，其中所述一个或多个氨基酸残基的突变选自下组 i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸； ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸； iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺； iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸； V)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸； vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸； vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸； viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸； ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸； X)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和 xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。
23.一种多核苷酸，选自下组(a)-(e)
(a)多核苷酸，其由以SEQ ID NO U SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :52 或 SEQ ID NO 60表示的核苷酸序列组成；
(b)多核苷酸，其包含以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ ID NO:52 或 SEQ ID NO 60表示的核苷酸序列；
(c)多核苷酸,其由与以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ ID NO:52 或 SEQ ID NO 60表示的氨基酸序列显示90%或更高同一性，并编码具有L-氨基酸氨基转移酶的蛋白的核苷酸序列组成； (d)多核苷酸，其在严格条件下与由互补于以SEQID NO U SEQ ID NO :47、SEQ IDNO :52或SEQ ID NO :60表示的核苷酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有L-氨基酸氨基转移酶活性的蛋白；和 (e)多核苷酸，其编码权利要求
20的L-氨基酸氨基转移酶。
24.—种表达载体,其包含权利要求
23的多核苷酸。
25.—种转化体，其导入有权利要求
24的表达载体。
26.一种用于产生L-氨基转移酶的方法，包括在培养基中培养权利要求
25的转化体而获得所述L-氨基酸氨基转移酶。
27.一种产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IH0G与权利要求
20的L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。
28.一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I’ )和(II’ ) (I’ )执行权利要求
27的方法而形成2S，4R-莽那亭；和 (II’)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。
29.权利要求
28的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。
30.权利要求
28的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。
专利摘要
本发明提供了用于改善2R，4R-莽那亭收率的方法。具体而言，本发明提供了用于产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸存在下用L-氨基酸氨基转移酶接触4R-IHOG而形成2S，4R-莽那亭；用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括异构化2S，4R-莽那亭以产生2R，4R-莽那亭；等等。这些产生方法可进一步包括将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG，和使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
文档编号C12N9/10GKCN102741406SQ201180004246
公开日2012年10月17日 申请日期2011年10月12日
发明者杉山雅一, 森健一, 田上宇乃, 田渕英莉, 石川弘纪, 荻野博臣, 藤井秀美, 高仓康彰 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan