一种高效培养极地低温微藻的简易方法
【技术领域】
[0001]本发明属于应用藻类技术领域，特别涉及一种高效培养极地低温微藻的简易方法。具体说是利用特制的玻璃夹套培养管和低温冷却液泵，在玻璃管的夹套中通入循环的冷却液，使培养液保持在较低温度，同时提供合适光照和通入CO2,使得极地低温微藻能在普通(常规温度)光照培养室中快速生长。
【背景技术】
[0002]极地地理环境以低温、高光照和强紫外线辐射为主要特点，且环境中营养匮乏。在这种极端环境中，主要的初级生产者是微藻，它们对于维护极地生态系统平衡具有重要意义。为此，它们有一套有效的抗胁迫体系来避免低温、高光强和强紫外辐射的危害，保证其光合系统、生物膜系统和酶系统正常运转。目前，关于极地微藻抗冻、抗氧化和抗辐射的研究是人们关注的热点，具有重要的理论和现实意义。有关在极地低温微藻中开发抗低温基因及其产物、低温酶(如脂肪酶、蛋白酶)以及不饱和脂肪酸的研究方兴未艾。在进行这些研究的同时，都需要首先获得一定生物量的微藻。
[0003]极地微藻长期处于低温的环境中，它们须在低温环境下正常生长繁殖，低温培养室和光照培养箱是培养极地低温微藻常用的两个装置。低温培养室因建造和运转成本较高，大多数实验室并不具备，同时低温培养室的缺点是在一个时间段内只能保持在一个恒定的温度。而光照培养箱面临着当外界环境温度过高时难以维持箱内低温，培养空间极其有限，光照强度难以根据不同实验需求控制，添加紫外辐射光源且通气装置安装不便等问题。因此，极地低温微藻类的培养和研究在很多地方受限。现有公开报道的极地低温微藻的大量培养由于培养设备及方法的限制，存在培养周期长，生长缓慢等问题，难以获得足够多的微藻生物量，从而影响了极地微藻的理论和应用研究的深入发展。
[0004]本发明正是针对这一问题，通过利用循环冷却液泵和夹套培养管，在充分认识和利用藻类生长过程中对光和CO2的动态需求规律的基础上，实现极地藻类在普通光照培养室中能够快速生长，使得极地藻类的培养变得简单易行，为极地藻类的科学研究和开发利用提供大量的藻类生物量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能在常温环境下，快速高效获得极地低温微藻生物量的简易培养方法。它是利用在夹套式玻璃培养管的夹层中通入低温冷却液来调节培养液温度，从而实现利用常温光照培养室来培养极地低温微藻，而不必对培养室进行必要的低温化改造。改变了极地低温藻的常规培养仅仅限于低温培养室和低温培养箱中的状况。同时还可以很方便地调节CO2浓度和光照强度，满足藻类对光强和CO2需求的动态变化，实现低温微藻的快速生长。另外，通过在每根培养管的气体通路中配备一个简易的气体流量调节装置，实现通入每根培养管中的气体流量相同，避免了因气体流量不同而导致的生长不均匀。而培养管底部的圆锥型设计，避免了因搅动力不足而导致微藻细胞在培养管底部沉积的现象。
[0006]本发明提供的培养极地藻类的方法按照如下步骤进行:(1)根据所要调节的温度，在低温循环泵中添加适当冷却液，当控温范围在10-20°C时优选水，控温范围在0-10°C时优选20%乙醇溶液，接种前半小时打开低温冷却液循环泵，并调节到设定温度；(2)联通夹套式培养管和低温冷却液循环泵，使得冷却液从夹套上部的管口进入，从下部管口出，以保证热交换效率，保持培养管中温度稳定；(3)藻种活化:挑取极地藻种接种到含预冷培养液的夹套式培养管中，在10°C、5001ux光照下进行活化，通入空气，空气流量初始设置为每升培养基0.08Lmin^,待藻液0D730大于0.5时，通气流量增至0.ZLmirT1，光强增至20001uX ;(4)藻种的扩大培养:将活化的藻类按1: 3-1: 5的比例接种到含预冷培养液的夹套式培养管中，藻的初始接种密度优选0.1-0.Sgdwr1 ； (5)通入过滤空气或添加一定浓度CO2的空气，流量为每升培养基0.05-lLmirT1，优选为0.2-0.6Lmin^,C02浓度为0.5-5%(V/V)，优选为1-2%，以使培养液pH维持在6.5-8.5为宜，所有气体均经孔径为0.45 μ m滤膜过滤后再通入到培养管中，气体流量通过滚轮式气体流量调节器调节；(6)根据微藻的种类、接种密度以及培养管直径调节相应光照强度(500-60001uX)，不同种类微藻，根据其光强生长实验或光合作用光反应曲线，选择适当强度的光照，相同种类的藻，随密度增大，光照强度应增大，在相同接种密度下，培养管直径越大，提供的光照强度也应该越强。
[0007]利用本发明提供的方法，可以更加精确和方便地控制培养温度，对外界环境温度要求低。由于操作空间大，还可方便添加外源处理(如紫外线辐射)，具有控制精确、运行成本低和操作简便等特点。可以满足不同藻类对温度的不同需求，实现藻类快速生长。利用此方法培养极地微藻，I周内培养管中的藻类生物量可达周内达到4-8gdwL'同时本装置还可以配合低温培养室和控温光照培养箱使用，一次完成多个温度梯度实验，大大缩短实验周期。
【具体实施方式】
[0008]本发明提供一种高效培养极地低温微藻的简易方法。具体说就是利用本发明提供的夹套式培养管和低温冷却液循环泵，控制培养液温度在所需要的低温，实现能够在常温环境中培养极地低温藻类。在培养过程中动态调节光强、CO2浓度和通气量，满足藻类生长过程对于光照和碳需求，避免光抑制和碳源限制，使微藻生长良好，从而获得最大生物量产率。下面以具体实例对本发明进行进一步阐述。
[0009]实施例
[0010]棚藻(Scenedesmussp2008_88)和小球藻(Chlorella sp.2006-68)米集于北极王湾，保存中国极地研究中心低温藻种库提供。藻种接种到液体培养基中，于4°C保存。活化时将藻种接种到含预冷改良BGll液体培养基的夹套培养管中，按每升培养基0.08LHiirT1通入空气，培养管内径为3.2cm，外径为4.5cm，底部为平底圆锥形(图1)，培养温度为10°C，室温设定为25°C，通入空气，流量初始设置为每升培养基0.08L mirT1，随着藻细胞浓度增加，适当增加气体流量，以使藻细胞充分悬浮，无细胞沉淀产生为宜，待细胞生长至干重为1.SgL-1时，3000rpm离心收集藻细胞，用新鲜培养基重新悬浮后，接种到同等大小的三只夹套培养管中，初始接种密度为0.SgdwL—1，通入含1% CO2 (v/v)的空气，气体流速为每升培养基0.4L mirT1，pH维持在6.5-8.5，初始光强设置为20001ux, 3天后增加到40001ux,每两天取样一次，监测藻类生长。在生长过程中，培养管温度基本稳定在10°c，最大偏离为rc，主要是由低温循环水浴的温度改变而导致，通入的气体输入的热量对温度变化贡献较小(图2)。2天后,栅藻和小球藻每升培养液的生物量干重分别达1.6g和1.35g ；6天后为3.358和3.11 g，而在第 12 天为 4.3g 和 4.05g (图 3)。
[0011]所用改良BGll培养基的成分如下=NaNO3LOglA KH2PO40.MgSO4.7Η200.3gL_1, CaCl20.03gL_1, NaH⑶30.4gL' FeCl27.542mgL_1, Na2EDTA5mgL_1,H3B033.15mgL_1, MnCl2.H202mgL_1, ZnSO4.7H200.222mgL_1, CuSO4.5H200.08mgL_1,Na2MoO4.2H200.04ImgL^1, CoCl2.6H200.(MmgL'培养基配制时采用蒸馏水，培养基在103.5kPa, 121°C下灭菌20min，冷却后备用。
【附图说明】
[0012]图1培养极地微藻的装置图
[0013]图2藻液温度和室温变化图(设定温度为10°C )
[0014]图3 极地栅藻(Scenedesmus sp.)和小球藻(Chlorella sp.)在 10°C的生长。
【主权项】
1.一种高效培养极地低温微藻的简易方法，其特征在于，将活化的藻类接种到特制的隔套式培养管中，通过低温冷却液循环泵向夹套中通入循环冷却液，控制培养液温度在0-20°C范围内，向培养液中通入空气或添加一定浓度CO2的空气，适当供给一定强度的光照(500-6000lux)，培养液酸碱度控制在pH6-9。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，隔套式培养管的内管管径为3-7cm，外管管径为4.2-8.2cm,内外管间密封,外管的上端为进水口，下端为出水口，进水口和出水口均为渐细的玻璃管，分别通过硅胶管和循环泵的出水口和入水口相连，内管长度为20-80cm，底部为钝圆至圆锥型，外管底部为微钝圆或平底。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，循环泵中的冷却液为水或添加一定乙醇的水，乙醇浓度(V/V)在5% -40%之间。
4.根据权利要求1和3所述的方法，其特征在于，控温范围在10-20°C时优选水，控温范围在0-10°C时优选20%乙醇溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通入气体的流量为每升培养基0.05-1LmirT1，优选为0.2-0.eLmirT1，CO2浓度为0.5-5% (V/V)，优选为1_2 %，以溶液pH控制在7-9为宜，所有气体均经孔径为0.45 μ m的微孔滤膜过滤后再通入到培养管中，在通入每个培养管的气体通路中配有一个气体流量调节装置，方便调节每根培养管中的气体流量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于气体流量调节阀可以是球阀或在通气软管上添加调速器，优选为在软管上添加滚轮式流速调节器。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，光由冷光源灯管提供，光强的调节依据藻细胞密度调节。
8.通过此培养法获得的极地低温微藻在生产和商业中的应用。
【专利摘要】本发明公开了属于藻类应用技术领域的一种高效培养极地低温微藻的简易方法。它包括应用一种特殊设计的夹套式玻璃培养管，在夹套式玻璃培养管的夹层中通入低温冷却液来稳定培养液温度，使得在常温培养室内能进行极地低温藻类培养。通过在每根培养管的气体通路中配备一个简易的气体流量调节装置，实现通入每根培养管中的气体流量相同，避免了因气体流量不同而导致的生长不均匀。而培养管底部的圆锥型设计，避免了藻因搅动力不足而导致藻细胞在培养管底部沉积的现象。在微藻培养过程中，供给适当光强(500-6000lux)和CO2，1周内培养管中的藻类生物量可达3-4gdwL-1，2周内达到4-8gdw？L-1，可以大大提高极地低温微藻的生长速度，提供丰富的生物量以供后续研究和开发利用。
【IPC分类】C12N1-12, C12R1-89
【公开号】CN104560718
【申请号】CN201310503141
【发明人】罗玮, 李运广, 汪靓, 李会荣, 朱艳红, 陈守文, 伍阳, 楼妍颖
【申请人】中国极地研究中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月22日