猕猴桃种间杂交品种金艳的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物种间杂交品种的鉴定方法，尤其涉及一种猕猴桃种间杂交品种 '金艳'的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 建立植物新品种鉴定和保护体系对保护育种者权益、促进植物品种创新、有效利 用植物种质资源和促进农林产业发展具有重要意义。分子标记因其稳定、不受表型及环境 变异影响，已成为新品种特异性、一致性及稳定性（即DUS测试）测试的重要手段。此外，分 子标记解决了目前育种材料遗传基础日益狭窄及选育品种数目增多导致的品种差异趋同 问题。利用AFLP和SSR标记等多种分子标记的方法，对油菜、玉米和水稻等多种作物成功 地进行了 DUS补充测试。在我国，玉米、水稻和大麦等作物的分子鉴定图谱已经成为品种保 护国家标准(如，2014年颁布的《大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法》）。单核苷酸多态 性（SNP)标记作为第三代分子标记，目前已广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传连 锁图谱构建和重要性状的基因定位等相关研宄中。特别是，最近SNP标记在冬、春大麦等品 种测试中的成功运用，为猕猴桃等多倍体物种进行分子标记鉴定提供了有力示例。
[0003] 我国猕猴桃产业和科研的发展已成为猕猴桃品种分子鉴定体系开发的强劲推动 力。联想控股现代农业板块公司佳沃集团等大型企业介入农业，在产品的推介、品牌的创建 等方面投入大量的资金，推动了我国果品的高端化和国际化；但与此同时，一批劣质及仿冒 的品种和果品在市场流通，如何鉴定并保护新品种及其产品已成为国内企业及科研单位的 重要任务。随着猕猴桃分子生物学技术的发展，中华猕猴桃的参考基因组草图（616. IMb)和 39040个基因序列已经被公布并得到注释。这为我们开发猕猴桃品种鉴定的分子标记方法 提供了科研基础。
[0004] 本发明选择猕猴桃种间杂交品种'金艳'为研宄对象，拟开发出一套基于测序和生 物信息学手段的鉴定猕猴桃种间杂交特征的分子鉴定方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种猕猴桃种间杂交品种'金艳'的分子鉴定方法，适用于 '金艳'杂种特性的鉴定。
[0006] 本发明的目的是这样实现的： 本方法包括下列步骤： ① '金艳'猕猴桃及其父母本即中华猕猴桃和毛花猕猴桃物种DNA的提取及全基因组 序列测定； ② '金艳'猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制； ③ '金艳'猕猴桃及其父母本物种全基因组比对到'红阳'猕猴桃参考基因组序列； ④ '金艳'猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘和检测，证实'金 艳'含有大量毛花猕猴桃和中华猕猴桃的特异SNP位点，为两者的种间杂交后代； ⑤'金艳'种间杂交特征鉴定SNP位点的重验证，证明此方法切实可行。
[0007] 所述的'金艳'是黄色耐贮藏的猕猴桃品种，由中国科学院武汉植物园选 育；母本为毛花猕猴桃，父本为中华猕猴桃。该品种2010年通过国家品种审定（国 S-SV-AE-019-2010)，目前是第一个商业化的猕猴桃种间杂交品种。
[0008] 所述的'红阳'是红色果肉的猕猴桃品种，由四川省自然资源研宄所和苍溪县农 业局共同选育，该品种的基因组已经被测定并正式公布在公共网站：http://bioinfo.bti. Cornell, edu/kiwi。目前，'红阳'猕猴桃的基因组数据是其他猕猴桃物种和品种生物信息 学分析的参照数据。
[0009] 与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果： 本发明开发出一种适用猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定方法，经实验证明此套分子鉴 定方法具有重复性好、稳定性高的特点。本发明是第一个应用于猕猴桃种间杂交品种鉴定 的方法，可推广应用于其他类似猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定。
【附图说明】
[0010] 图1是利用引物1、2、3、4扩增的'金艳'和母本毛花猕猴桃特异位点比对图； 图2是利用引物5扩增的'金艳'和父本中华猕猴桃特异位点比对图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合附图和实施例详细说明： 一、方法 ①'金艳'猕猴桃及其父母本即中华猕猴桃和毛花猕猴桃物种DNA的提取及全基因组 序列测定 采用CTAB法提取'金艳'及其父本中华猕猴桃、母本毛花猕猴桃的DNA，DNA经质量检测 合格后基于Illumina HiSeq2000测序平台，对所有的分析样本构建600bp、500bp和180bp 的小片段文库，对样本进行6. 5X以上的基因组重测序分析，获得'金艳'及其父母本的基 因组序列； +f '金艳'猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制 从测序仪下机的数据可能包含不合格的数据，本发明按照下列标准过滤后使用：去除 N碱基含量超过5%的序列，去除低质量碱基(质量值小于5)含量大于50%的序列，去除有测 序接头污染的序列，去除具有大量重复的序列；对过滤后的数据，使用FastQC软件，设置为 默认参数，进行质量评价； ③测定'金艳'猕猴桃及其父母本物种基因组比对到'红阳'猕猴桃参考基因组 首先使用Stampy软件设置为默认参数将每个序列分别比对到参考基因组，得到.bam 格式的比对结果； 在文库构建过程中，同一个DNA分子经过PCR扩增后可能被多次测序，得到完全相同的 序列；如果在PCR起始几轮时出现错配，这些序列会导致下游发掘SNP步骤中将这些错配鉴 定为SNP，影响整体SNP集的正确性；因而本发明使用Picard软件中的MarkDuplicates. jar去除比对结果中的重复序列； 初步的比对将一条条序列单独比对上参考基因组序列，在插入缺失序列边界的碱基通 常存在较高的比对错误；因此，本项目使用GATK软件包中的RealignerTargetCreator先 鉴定出候选的插入缺失序列位置，然后再通过IndelRealigner将比对到这些位置的序列 进行多序列比对，提尚该位置的喊基比对正确率，提尚下游发掘SNP和插入缺失序列的准 确性； ++? '金艳'猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘、检测并发现'金 艳'含有大量的父母本特异位点，证实其为种间杂交后代： 得到比对结果后，本发明使用GATK软件包的UnifiedGenotyper对每个个体分别进行 SNP检测；该软件支持对多倍体进行分析；最终得到初步的检测结果.vcf格式的文件；随 后，使用GATK软件包的CombineVariants将所有个体的变异检