TB)，为方便比较结果均乘以1000 ;所述的SPSS version 20. 0软件差异显著性 检验，采用单因素方差分析，P < 0. 01表示差异极显著，所有结果均以平均值和标准差来表 /_J、i 〇
[0020] 本发明还提供了所述的引物对P和引物对ACTB在检测(基因245bp deletion 可变剪接体中的应用。
[0021] 本发明还提供了所述的试剂盒在检测基因245bp deletion可变剪接体中的 应用。
[0022] 本发明经实际实验，取得了非常满意的技术效果。以下以鹌鹑为例，有关实验资料 如下： 本实施例的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤： 本实施例的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤： (1)组织样品的采集 购买河南武陟县鹌鹑养殖场4周龄朝鲜龙城黄羽鹌鹑10只，分别采集组织样如下：肝 脏、胰脏、十二指肠、骨骼肌、腹脂、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、腺胃、下丘脑和垂体，液氮 冷冻后放于_80°C冰箱保存备用。
[0023] (2 )组织RNA提取及cDNA合成 组织总RNA的提取采用TaKaRaRNAisoPlus试剂盒，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop2000微量紫外分光 光度计测定。
[0024] 米用 PrimeScriptTM RT Rragent kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China)试剂盒将RNA反转录成cDNA。
[0025] (3)引物设计 根据我们在NCBI公布的鹌鹑LEPR基因245bp deletion可变剪接体序列（GenBank AccessionNo.KM066117)设计引物对P;根据NCBI公布的鸡、火鸡和鸭的ACTB基因序列(GenBankAccessionNo.NM_205518. 1，XM_003210591. 1，EF667345. 1)比对后设计引物 对ACTB。
[0026] 引物对P为： 上游引物，P-F:5' -TCCCTACCAAGATGCTGAC-3' ； 下游引物，P-R:5' -TTGCTCGCGATCGITCACA-3' ； 引物对ACTB为： 上游引物，ACTB-F:5' - GAGAGAAGATGACACAGAC -3' ； 下游引物，ACTB-R:5' - GTCCATCACAATACCAGTGG -3'。
[0027] (4 )荧光定量PCR扩增 荧光定量PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数 量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个去RNA酶的1. 5 mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到荧光定量PCR专用的8联管中，然后分别加入 模板cDNA，再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增，整个操作过程尽量避光；荧光定量PCR反 应体系见表1。反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变性10s，60°C退火30s，72°C延伸30s， 40个循环。
[00281 ^ 1 PPR
【主权项】
1. 一种用于检测基因 245bp deletion可变剪接体的引物，其特征在于，包括引物 对P和引物对ACTB， 所述的引物对P为： 上游引物，P-F :5' - TCCCTACCAAGATGCTGAC -3' ； 下游引物，P-R:5' - TTGCTCGCGATCGTTCACA -3' ； 所述的引物对ACTB为： 上游引物，ACTB-F :5' - GAGAGAAGATGACACAGAC -3' ； 下游引物，ACTB-R:5' - GTCCATCACAATACCAGTGG -3'。
2. -种用于检测基因245bp deletion可变剪接体的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括权利要求1所述的引物对P、引物对ACTB、2XSYBR?Premix Ex Taq?II和去RNA酶 的超纯水。
3. -种检测基因 245bp deletion可变剪接体的的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 以待测cDNA为模板，以权利要求1所述的引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩 增内参基因，以权利要求1所述的引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增感因 245bp deletion可变剪接体，所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2 X SYBIfPremix Ex Taq?II 9~11 μ L，去 RNA 酶的超纯水 7~8 μ L，引物 P-F 或 ACTB-F0. 5~1 μ L，引物 P-R 或ACTB-R0. 5~1 μ L，cDNA模板0. 5~1. 5 μ L构成，其反应方法是92~96°C预变性4~6min， 92~96°C变性 8~12s，55~65°C退火 25~35 s，70~74°C延伸 25~35s，35~45 个循环； (2) 对步骤（1)的荧光定量PCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用 对定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。
4. 根据权利要求3所述的检测基因245bp deletion可变剪接体的方法，其特 征在于，所述的反应体系包括有2 X SYBIfPremix Ex Taq? II 10. 0 μ L，去RNA酶的超纯水 7. 4 μ L，引物 P-F 或 ACTB-F0. 8 μ L，引物 P-R 或 ACTB-R0. 8 μ L，cDNA 模板 L 0 μ L 构成，其 反应方法是941：预变性51^11，941：变性1〇8,6〇1：退火3〇8,721：延伸3〇8,40个循环。
5. 根据权利要求3所述的检测基因245bp deletion可变剪接体的方法，其特征 在于，所述步骤（1)中引物对ACTB的扩增产物长度为116bp，引物对P的扩增产物长度为 161bp。
6. 根据权利要求3所述的检测基因245bp deletion可变剪接体的方法，其特征 在于， 所述步骤（2)中采用相对定量方法计算该剪接体的相对表达量=2^CT =2^ΕΙ^ΤΑετΒ)， 为方便比较结果均乘以1000;所述的SPSS version 20. 0软件差异显著性检验，采用单因 素方差分析，P < 〇. 01表示差异极显著，所有结果均以平均值和标准差来表示。
7. 权利要求1所述的引物对P和引物对ACTB在检测基因 245bp deletion可变 剪接体中的应用。
8. 权利要求2所述的试剂盒在检测基因245bp deletion可变剪接体中的应用。
【专利摘要】本发明涉及检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，解决程序繁琐、耗时长、准确率低的问题，以待测cDNA为模板，引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因，以引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR扩增的反应体系由2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、去RNA酶的超纯水、引物P-F或ACTB-F、引物P-R或ACTB-R、cDNA模板构成，反应方法是预变性、变性、退火、延伸；对qPCR实时监测结果进行分析，用2-△CT相对定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验，本发明准确、快速、方便，适用性强。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104673912
【申请号】CN201510077497
【发明人】刘小军, 王丹丹, 徐春林, 李转见, 王台安, 蒋瑞瑞, 闫峰宾, 康相涛
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日