一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小麦分子育种领域，具体涉及一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记 HRM5及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，历年种植面积分别占耕地面积的 22%~30%，粮食作物总面积的22%~27%，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、江 苏、四川、安徽等省份；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22%，是我国约一半人口 的主食，因此高产小麦品种的选育一直是育种家关注的重点。
[0003] 小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点（Quantitative traitlocus,QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过 程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一 种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条 件限制、在植物发育的整个生长时期均可检测、选择效率高等优势。
[0004] 小麦产量由三个主要因素构成，即产量=穗数X穗粒数X粒重。分蘖是影响小 麦穗数进而影响小麦产量的重要农艺性状之一，同时又是单子叶植物的一种特殊的分枝现 象，具有重要的研宄意义。
[0005] 小麦分蘖遗传研宄总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因QTL 的分子标记定位及其遗传效应开展。部分分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将 其作为质量性状来研宄（RichardsRA.Atillerinhibitiongeneinwheatandits affectonplantgrowth.AustrJAgricRes. 1988,39:749-757;DugganBL，Richards RA,TsuyuzakiH.Environmentaleffectsontheexpressionofthetiller inhibition(tin)geneinwheat.FunctPlantBiol，2002, 29:45 - 53)。同时，也有很多 学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究（ShahaMM，GillaKSJaenzigei*PS，Yen Y,KaepplercSM,AriyarathneHM.Molecularmappingoflociforagronomictraits onchromosome3Aofbreadwheat.CropSci. 1999, 39:1728-1732;谢現，龙海，侯永翠， 郑有良.小麦寡分蘖材料H461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006, 26:21-23; 王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论 文，2009;温明星.望水白多分蘖、矮秆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕 士学位论文，2010;JinpengZhang,JunWu,WeihuaLiu，XiangLu，XinmingYang,Ainong Gao,XiuquanLi,YuqingLu，LihuiLi.Geneticmappingofafertiletiller inhibitiongene，ftin，inwheat.MolBreeding. 2013, 31:441-449)。迄今为止，已报道的 分蘖相关主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，微效基因位于5A，3B，7B，1D、?染色体， 其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。
[0006] 小麦材料H461相对于小麦品种川农16(国审品种）具有寡分蘖、多穗粒数、 多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性（侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数 型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研宄初报.四川农业大学学 报.2003, 21:94-9)。同时，小麦品种川麦107和分蘖数显著高于H461。因此，利用H461和 川麦107构建遗传研宄群体，进一步验证小麦H461的寡分蘖特性，定位控制分蘖基因，寻找 紧密连锁的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型 育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型 育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。
[0007] 分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型 与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。高 分辨熔解曲线（HighResolutionMelting,HRM)技术近年来国际上兴起的一种SNP及突变 研宄工具。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等 优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与分蘖基因紧密连锁 的，且适用于荧光定量PCR平台HRM技术的分子标记，不仅能对小麦分蘖基因进行选择，有 效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解 决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供与小麦H461寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记。
[0009] 本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供上述寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记的应 用。
[0011] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0012] 本发明的新寡分蘖基因Ltn3来自小麦H461，该基因位于小麦2D染色体。Ltn3能 显著降低小麦分蘖，L0D值大于5. 31，解释约12%的表型变异。
[0013] 本发明所提供的分子标记HRM5的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0014] 本发明所述分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3 之间的遗传距离为〇.35cM。
[0015] 本发明还提供了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，以待测植株 样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进 行基因型分型，将与H461分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。
[0016] 可选的，所述方法包括以下步骤：
[0017] (1)以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量 PCR扩增：
[0018] (2)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5 y L、上游引物和 下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10 y L ;
[0019] (3)荧光定量PCR程序：95°C预变性5min;94°C变性15s、53°C退火30s，共50个循 环；熔解曲线范围为65~95°C，每0.2°C读一次数，时间为10s;
[0020] (4)利用步骤（3)获得的结果进行基因分型。
[0021] 其中，所述待鉴定植株的DNA取自小麦样品三叶期的叶片。
[0022] 本发明还提供了所述分子标记的荧光定量PCR引物，其中，上游引物序列如SEQID No. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。
[0023] 本发明还提供了所述分子标记HRM5在小麦育种中的应用。
[0024] 本发明还提供了所述分子标记HRM5在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因 为寡分蘖基因Ltn3。
[0025] 本发明还提供了本分发明所述方法在小麦育种改良中的应用。
[0026] 本方还提供了所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。
[0027] 在本发明中，小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记HRM5是通过以下方法获得的：
[0028] (1)利用寡分蘖小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种Fl，F1 代单株自交获得F2,采用单粒传法获得含有223个株系的F8代RIL群体，随机选择188个 株系构成遗传作图群体。
[0029] (2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，选取 wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆盖六倍体小麦 A、B、D基因组的90KSNP芯片，以亲本H461和川农16的DNA为模版，进行基因分型，获得 所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体 株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B，杂合型为H。
[0030] (3)小麦成熟期田间鉴定所述F8群体植株的分蘖数。
[0031] (4)利用JoinMap4. 0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连 锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL6.0的 区间作图模型（IntervalMapping)和多QTL作图模型（MultipleQTLModel)，并结合F8 群体分蘖表型数据将寡分蘖基因Ltn3定位于2DL染色体上一个3. 49cM的区段内。
[0032] (5)获取该区段内的SNP探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据， 获得目标区段更多的序列信息，电子延长SNP探针序列两端对应的序列，并进行序列分析， 初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
[0033] (6)设计焚光定量PCR引物，用于后续筛选。利用BeaconDesigner7. 0软件设计 荧光定量PCR引物10对（见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18~25bp，扩 增产物长度65~10(^口，退火温度60°0,6(：含量在40%~60%之间，5即差异位点产物退 火温度差异大于0.2 °C。
[0034] 表1 10对SSR引物序列及扩增片段长度
[0035]
【主权项】
1. 一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5,其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记与小麦寡分蘖基因 Ltn3共定位于小麦2D染色体，且与Ltn3之间的遗传距离为0. 35cM。
3. 根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，小麦寡分蘖基因Ltn3显著降低 小麦分蘖，LOD值大于5. 31。
4. 一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5的方法，其特征在于，以待测植株样 品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行 基因型分型，将与H461分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩 增； (2)荧光定量PCR扩增反应体系：Ss〇FastEvaGreen超混合液5yL、上游引物和下游 引物各300ng、模板DNA100ng、Dnaes/RNase-free去离子水加至总量为10yL; ⑶荧光定量PCR程序：95°C预变性5min;94°C变性15s、53°C退火30s，共50个循环； 熔解曲线范围为65~95°C，每0.2°C读一次数，时间为IOs; (4)利用步骤（3)获得的结果进行基因分型。
6. 权利要求1-3中任意一项所述分子标记的荧光定量PCR引物，其特征在于，上游引物 序列如SEQIDNo. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。
7. 分子标记HRM5在小麦育种中的应用。
8. 分子标记HRM5在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。
9. 权利要求4或5所述的方法在小麦育种改良中的应用。
10. 权利要求6所述的荧光定量PCR引物在分子标记辅助小麦株型育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了与小麦寡分蘖基因Ltn3紧密连锁的分子标记HRM5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该分子标记与小麦寡分蘖基因Ltn3的遗传距离为0.35cM。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104818271
【申请号】CN201510222213
【发明人】刘亚西, 王智强, 高尚, 石浩然, 莫洪君, 卢艳丽, 王益, 魏育明, 郑有良
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月4日