一种快速区分小麦白粉菌交配型的分子检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种快速区分小麦白粉菌iBlumeriagraminis f.sp.triiic)交配型的分子检测方法。本发明技术适用于对小麦白粉菌交配型的检测，以及杂交后代与亲本遗传变异等方面的研宄。
【背景技术】
[0002]真菌的交配系统主要分为同宗配合(自身可育)和异宗配合(自身不育)，其中异宗配合的菌株必须由不同的交配型个体交配才能完成有性生殖。真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性繁殖的遗传基础，同宗配合的子囊真菌通常具有一个交配型基因座；而大多数异宗配合的丝状子囊真菌有一对高度异源的交配型基因座。在异宗配合子囊真菌中，异源的交配型基因座分别为姻/7-7和姻77-么其中姻77-7基因座至少含有一个α-1结构域的交配型基因姻/7-7-7，而姻77交配型基因座则至少含有一个具有高泳动蛋白家族(HMG)结构域的交配型基因拗通过检测拗77-7-7和MAT1-2-1交配型基因可确定异宗配合子囊真菌的交配型。
[0003]小麦白粉菌f.sp.tri tic I )是专性寄生植物病原真菌。小麦白粉菌在小麦生长后期发生有性生殖；在病叶上形成黑色的子囊壳，也即为白粉菌的有性世代。小麦白粉菌的有性世代在侵染循环中起什么作用，一直是有争议的问题。有研宄报道在山区或高海拔地域，子囊壳可作为初侵染源侵染下一季小麦，在侵染循环中发挥重要作用；此外，有性生殖也是白粉菌发生遗传变异的重要来源。因此，开发小麦白粉菌的交配型基因引物有助于揭示子囊壳在侵染循环中的作用，同时也为研宄其有性生殖的变异奠定基础。
[0004]近几年，用PCR方法对子囊菌交配型基因进行研宄和检测的报道不断增多，但有关小麦白粉菌交配型的研宄尚未见报道。Brewer等(Fungal Genetics and B1logy，2011，48:704 - 713)于2011年研宄葡萄白粉菌交配型时，利用多重PCR的方法扩增姻/7-7-7和姻的保守序列α -1结构域和HMG结构域获得葡萄白粉菌两种不同交配型基因，同时，Brewer等又设计简并引物扩增小麦和大麦白粉菌的交配型基因。但我们在试验中采用该简并引物并不能有效区分小麦白粉菌株的交配型。因而申请人在姻/7-7-7基因(GeneBank登录号:HQ 171902和姻77-J-7基因部分序列(GeneBank登录号:HQ171899)，设计了两对特异性引物，可用于检测小麦白粉菌交配型。从而高效、快速鉴定我国小麦白粉菌株的交配型，为研宄有性世代对遗传变异的影响奠定基础。
[0005]本发明基于GeneBank中登陆的两对交配型基因的部分保守序列，通过试验条件的优化，保证了检测结果特异、稳定和可靠。若采用传统的菌株相互杂交，需要3个月才能观察到有性世代子囊壳，工作量较大耗时、存在着随机性。该方法可快速检测小麦白粉菌分生孢子单孢菌株、子囊孢子单孢菌株的交配型，适用于小麦白粉菌流行预测及植物病理学领域的科学研宄。
【发明内容】
[0006]本发明的内容在于:针对目前对小麦白粉菌交配型检测方法中必须通过菌株杂交产生有性世代子囊壳确定亲本菌株的交配型，检测方法相对耗时，且具有随机性的缺陷。本发明提供一种快速、易于操作的检测小麦白粉菌交配型的分子检测方法。
[0007]为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案:
一种快速区分小麦白粉菌graminis f.sp.1riiici)交配型的分子检测方法，用于检测白粉菌的分生孢子交配型姻/7-7-7和姻77-2-7，多重PCR扩增体系中涉及的两对引物是 BOX1-F/BOX1-R 和 HMG2-F/HMG2-R，其中 BOX1-F 为 SEQ ID N0.1，BOXl-R 为SEQ ID N0.2，HMG2-F 为 SEQ ID N0.3，HMG2-R 为 SEQ ID N0.4。
[0008]在本发明中，PCR扩增体系包括 1XBuffer 2.5yL，2.5Mm dNTPs 2.0 yL,5U/μ L Taq DNA 聚合酶 0.125 μ L，10 μ M 引物 B0X1-F/B0X1-R 和 HMG2-F/HMG2-R 各 1.0 μ L，10ng/ μ L DNA模板1.0 μ L，ddH20补足至25 μ L。PCR扩增程序为95°C预变性5min，然后进行35个循环，95°C变性15 s、56°C退火30 s、72°C延伸40 S，最后72°C延伸5min。4°C保存。
[0009]利用特异性引物B0X1-F/B0X1-R和HMG2-F/HMG2-R进行PCR扩增程序检测小麦白粉菌交配型时，姻/7-7-7交配型菌株均可得到一条140bp左右的条带，拗77-J-7交配型菌株均可得到一条220bp左右的条带。
[0010]本发明的核心在于用于检测小麦白粉菌交配型的两对特异性引物。所用引物是依据GeneBank数据库中小麦白粉菌两个交配型基因的部分序列(GeneBank登录号:HQ171902和GeneBank登录号:HQ171899)设计的。随机选取10个小麦白粉菌单分生孢子菌株，利用引物BOX 1-F/B0X1-R和HMG1-F/HMG1-R对其DNA进行PCR扩增时，姻77 -1 -1交配型菌株可以扩增得到一条140bp左右的条带，姻77交配型菌株可以扩增得到一条220bp左右的条带。
[0011 ] 本发明的优点:使用多重PCR方法将姻77-7-7和姻77检测特异性引物置于同一个PCR反应体系中，使用一次PCR和凝胶电泳即可检测小麦白粉菌样品的交配型，减少了检测步骤并节约检测成本，适用于大批量的小麦白粉菌样本交配型的快速检测，较传统的交配型检测方法省时、结果稳定可靠。同时为后续研宄有性生殖的遗传变异奠定理论基础。
【附图说明】
[0012]图1本发明对小麦白粉菌分生孢子单孢菌株交配型的检测电泳图。M代表Marker-DL2000;泳道1_10为小麦白粉菌分生孢子单孢菌株；泳道11为清水空白对照。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
根据小麦白粉菌交配型基因MATH-1Wlf DNA序列GeneBank登录号:HQ 171902和拗77-之-7基因部分序列(GeneBank登录号:HQ171899)设计引物:
SEQ ID N0.1:
BOX1-F: 5' -CAGGGGTATGCCAAGCAATA-3'
SEQ ID N0.2BOX1-R: 5' -GGATCCTTGTTCCATAGGATTG-3'
SEQ ID N0.3
HMG2-F: 5' -TCAACATAAGCACGCCAAAA-3'，
SEQ ID N0.4
HMG2-R: 5' -TTATAGCGATAGCCAGGGTTG-3'
实施例2
利用多重PCR检测方法判断小麦白粉菌交配型；
收集小麦白粉菌单孢菌株的分生孢子。采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。
[0014]利用多重PCR扩增体系检测小麦白粉菌交配型。扩增引物分别为:BOXl-F为SEQID N0.1，BOXl-R 为 SEQ ID N0.2，HMG2-F 为 SEQ ID N0.3，HMG2-R 为 SEQ ID N0.4。
[0015]多重PCR 的扩增体系为:10 X Buffer 2.5yL，2.5Mm dNTPs 2.0yL, 5U/μ L TagDNA 聚合酶 0.125 μ L，10 μ M 引物 B0X1-F/B0X1-R 和 HMG2-F/HMG2-R 各 1.0 μ L，10 ng/ μ LDNA模板1.0 μ L，ddH20补足至25 μ L。PCR扩增程序为95°C预变性5min，然后进行35个循环，95°C变性15 s、56°C退火30 s、72°C延伸40 S，最后72°C延伸5min。4°C保存。
[0016]取5 μ L PCR扩增产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电压为lOv/cm，电泳30min后将凝胶置于溴化乙锭溶液中5min，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用DNA marker判断DNA片段的大小。
[0017]当检查结果可以扩增到140bp左右的条带，即表明被检测样品存在姻77-7-7交配型基因座，分生孢子单孢菌株为姻77-7-7交配型；当检查结果可以扩增到220bp左右的条带，即表明被检测样品存在姻77-J-7交配型基因座，分生孢子单孢菌株为姻77-J?-7交配型，检测结果见图1。
【主权项】
1.一种快速区分小麦白粉菌(graminis f.sp.1riiici)交配型的姻77-7-7和姻77-J-7的分子检测方法，包括收集待检测样品单孢分生孢子，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，PCR扩增，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段大小，诉述的PCR为多重PCR扩增，多重PCR扩体系中涉及的两对扩增引物是 BOX1-F/BOX1-R 和 HMG2-F/HMG2-R，其中 BOXl-F 为 SEQ ID N0.1，BOXl-R为 SEQ ID N0.2，HMG2-F 为 SEQ ID N0.3，HMG2-R 为 SEQ ID N0.4。
2.根据权利要求1所述的一种快速区分小麦白粉菌交配型的姻77-7-7和MAT1-2-1的分子检测方法，其特征在用于，多重PCR扩增体系为:10XBuffer 2.5yL,2.5Mm dNTPs2.0yL, 5U/μ L Taq DNA 聚合酶 0.125 μ L，10 μ M 引物 B0X1-F/B0X1-R 和 HMG2-F/HMG2-R各1.0 μ L，10 ng/ μ L DNA模板1.0yL, ddH20补足至25 μ L ；PCR扩增程序为:95°C预变性5min，然后进行35个循环，95°C变性15 s、56°C退火30 s、72°C延伸40 S，最后72°C延伸5min，4°C 保存。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速区分小麦白粉菌交配型的姻77-7 -7和姻77-J?-7的分子检测方法，其特征在于，姻77-7-7交配型小麦白粉菌分生孢子单孢菌株可得到140bp左右的DNA条带，姻/7交配型小麦白粉菌分生孢子单孢菌株可得到220bp左右的DNA条带，据此获得被测小麦白粉菌分生孢子单孢菌株的交配型。
【专利摘要】本发明涉及一种快速区分小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici）交配型的MAT1-1-1和 MAT1-2-1的分子检测方法，包括收集待检测样品分生孢子，采用CTAB法提取所需检测样本的基因组DNA，PCR扩增，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用标记判断DNA片段大小，诉述的PCR为多重PCR扩增，多重PCR扩体系中涉及的两对扩增引物是BOX1-F/BOX1-R和HMG2-F/HMG2-R，其中BOX1-F为SEQ ID NO.1，BOX1-R为SEQ ID NO.2，HMG2-F为SEQ ID NO.3，HMG2-R为SEQ ID NO.4。本发明减少了检测步骤并节约检测成本，适用于大批量的小麦白粉菌样本交配型的快速检测，较传统的交配型检测方法省时、结果稳定可靠，同时为后续研究有性生殖的遗传变异奠定理论基础。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-645
【公开号】CN104862412
【申请号】CN201510314577
【发明人】喻大昭, 史文琦, 向礼波, 龚双军, 杨立军, 张学江, 曾凡松, 薛敏峰, 汪华
【申请人】湖北省农业科学院植保土肥研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月10日