长链非编码rna以及检测细胞及组织中该长链非编码rna表达水平的引物对及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的长链非编码RNA以及用于检测细胞及组织中的该长链非编 码RNA表达水平的引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 根据2012年全球肿瘤流行病统计数据（GL0B0CAN2012)，在2012年大约有100万 胃癌新发病例（952000, 6. 8% )，为全球第五位常见恶性肿瘤；胃癌在全球致死癌症中为第 三位（723000,8. 8% )。多于70%的胃癌病例发生在发展中国家，世界范围总数的50%胃 癌发生在东亚地区，主要在中国。胃癌在中国是发病率第二致死率第二的恶性肿瘤（Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray, F.
[0003] GL0B0CAN 2012vl. 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11[Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer ；2013.Available from:http://globocan. iarc. fr, accessed on day/month/ year.)胃癌的高发病率和高致死率严重威胁着人类的健康，很多胃癌患者在确诊时便已 处于进展期，目前手术切除是唯一根治胃癌的手段。早期筛查和诊断成为胃癌预测的核 心手段，同时胃镜检查合并组织活检有助于对早期胃肿瘤类型的诊断，但由于胃镜检查的 昂贵使其无法成为胃癌的广泛筛查手段。当前所应用的筛查胃癌的肿瘤标志物分析方法 简单快速，但是其灵敏度和特异性低（Ming-Ming Tsai, Chia-Siu Wang, etc, Potential prognostic, diagnostic and therapeutic markers for human gastric cancer, World J Gastroenterol 20140ctober 14 ;20 (38) :13791-13803)。因此发现胃癌的早期诊断和治疗 的有效方法具有十分重要的意义。
[0004] 结直肠癌在全球范围男性中为第三位常见癌症（746, 000例，占总数的10. 0% )， 在女性中为第二常见癌症（614, 000例，占总数的9.2% )，大约55%的病例发生在发达 国家。结直肠癌的死亡率占总癌症死亡率的8. 5%，结直肠癌导致死亡多发生在欠发达 地区，而且预后差（Ferlay J，Soerjomataram I，Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C1Rebelo M1Parkin DM1Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012vl. 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide:IARC CancerBase No.11 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer ；2013.Available from:http://globocan. iarc. fr, accessed on day/month/year·)。近些年来由于肿瘤筛查的普及及诊断手段的发展， 结直肠癌的新发病例及死亡病例均有所下降，但是全球每年仍有约783000新的结直肠癌 病例被诊断，大约一半的结直肠癌患者会发生局部复发和远处转移。结直肠癌主要的治疗 手段为化疗，而进展期结直肠癌长久以来被认为更加耐受化疗（MyoungSookKim, JunaLee andDavidSidransky. DNAmethylationmarkersi ncolorectalcancer. CancerMetastasisR ev (2010) 29:181 - 206)。因此结直肠癌早期诊断标志物的发现以及有效的治疗的发现具有 重要的意义。
[0005] 人类基因组中只有不到2%的序列可以编码蛋白质，但70%~90%的人类基因组 DNA是被转录的，其转录产物在过去被认为是"暗物质"或"垃圾"，近年来人们发现这些转录 产物可参与细胞的分裂、分化等生命活动，有着重要的生物学功能。非编码RNA包括miRNA、 PiRNA以及长链非编码RNA等许多类型，其中长链非编码RNA逐渐受到人们的关注。长链 非编码RNA即长度大于200nt且缺乏开放阅读框的RNA，大多数长链非编码RNA具有polyA 尾(Kung, J. T. , D. Colognorij and J. T. Lee, Long noncoding RNAs: past，present，and future.Genetics. 193(3):p. 651-69, 2013. Estellerj M. , Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12(12) :p. 861-74, 2011. Mercer, T. R. , Μ. E. Dinger, and J. S.Mattickj Long non-coding RNAs: insights into functions.Nat Rev Genet. 10(3) :p. 155-9, 2009.)。LncRNA可以在转录、翻译和转录后水平对基因的表达进行 调控（Gutschner，T. and S. Diederichsj The hallmarks of cancer:a long non-coding RNA point of view. RNA Biol. 9(6) :p. 703-19, 2012·)。
[0006] 随着高通量测序技术的发展和RNA芯片技术的成熟，越来越多的IncRNA被发现， 但是大部分IncRNA的功能并不明确。有研究显示，IncRNA在细胞增殖、细胞周期、凋亡、 侵袭迀移等生理和病理过程中发挥重要作用（Maruyama，R. and H. Suzuki，Long noncoding RNA involvement in cancer. BMB Rep. 45(11) :ρ· 604-11，2012.) D 与肿瘤相关的研究比较 成熟的 IncRNA 主要有 MALAT1，PANDA，PCAT-I 等。MLATl (Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1)在多种恶性肿瘤如肝癌、子宫内膜间质肉瘤及肺癌中均 表达上调，在转移的肺癌中MLATl的表达量是非转移肺癌的三倍，是评估早期肺腺癌生 存时间的独立预后指标（Ji，P.，et al.，MALAT_l，a novel noncoding RNA，and thymosin beta4predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene.22 (39):p. 8031-41, 2003. Yamadaj K. , et al. , Phenotypic characterization of endometrial stromal sarcoma of the uterus. Cancer Sci.97 (2):p. 106-12, 2006. Lin，R.，et al. ,Alarge noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and a spectrum of human carcinomas. Oncogene. 26 (6):p. 851-8, 2007.)〇 PANDA在人类乳腺癌中高表达，是乳腺癌化疗耐药的标志物（Hung，T.，et al.，Extensive and coordinated transcription of noncoding RNAs within cell-cycle promoters. Nat Genet. 43 (7) :p. 621-9, 2011) 〇 PCATl (prostate cancer associated transcript-1)是在 前列腺癌病例中通过高通量转录本测序技术获得的在前列腺癌中特异性高表达的IncRNA， 另一个 IncRNA PCA3(The prostate cancer antigen_3gene)已被美国食品和药品管理局 (FDA)于2012年批准用于前列腺癌的早期检测和预后评估（Prostate cancer:Biomarkers PCA3and TMPRSS2_ERG:better together. Nat Rev Urol，2014. Porpiglia，F.，et al·，The roles of multiparametrie MRIj PCA3, and PHI:which is the best predictor of prostate cancer after a negative biopsy ? Results of a prospective study. J Urol, 2014. Schroder, F. H. , et al. , Prostate cancer antigen 3: diagnostic outcomes in men presenting with urinary prostate cancer antigen 3scores>/ = 100. Urology. 83 (3) :p. 613-6, 2014.)。但与胃癌发生发展相关的IncRNA的研究尚少，IncRNA在 胃癌中的作用机制以及临床价值尚有待深入研究。
【发明内容】
[0007] 本发明所涉及的碱基序列如SEQ ID NO :1所示的长链非编码RNA (Long noncoding RNA, LncRNA)(以下记作Lnc21q22. 11)是通过对正常胃黏膜及3株胃癌细胞 系（AGS，SGC7901，BGC823)所提取的总RNA进行高通量转录本测序并通过生物信息学分 析得到差异表达的IncRNA中新的首次发现的在胃癌组织中表达降低的IncRNA。通过 3' RACE(rapid_amplification of cDNA ends)和 5' RACE 获得 Lnc21q22. 11 的全长序列 为1202bp，位于人类21号染色体长臂。预实验结果提示细胞Lnc21q22. 11可能是胃癌中新 的抑癌基因，在胃癌组织中对Lnc21q22. 11表达量的检测可能是一个崭新的肿瘤分子标记 物。在此基础上，本发明人应用半定量RT-PCR方法对大量胃癌组织标本以及癌旁组织标本 进行检测，以明确Lnc21q22. 11在胃癌中的表达量的改变。
[0008] 本发明首次通过5'RACE和3'RACE技术鉴定Lnc21q22. 11全长1202bp，全长序列 如SEQ ID NO :1所示，即：
[0009] GCTCAACGGGTTGACGGCGCCCGACGGCCAGGTCCAGCAGGGGCGCCCCGCAGGTGGGGCCTGGCGGCC TTCACCTTCCGGATCCCCGACCCGGCGCGACCGGGAGCCGGCAGACTTTTGTCTAGGAGGGAAAACCCGAGCGCGGG GCCGGCCGCGACATCGCAGCATCCCAAAGAGCTTTTGGAATTTGGGTCACTCCCTTCTACCCCGACGTCACACACTT ACTGCTCCCGGCAGCGGAGGCTCCAGCGCCTGGCCGCGCACAAACCACGACTTCTACCGTCCTGCCGGGGAAAACTA CAGGTCCCGAAATGCACCGCTACGTGCTCAGGCGCAGTGGGCCGGTGCCGCCGACGAGAGTGCACTACTCCGTGCGC AGGCGCAGTGGGCCCGGGCAGAAGACCTGGGGCGCGCTGCTCACTGCGCAGGCGCAGTGAGCCCAGGCGGGCAGCCC TGGCCAGCAGCTCTTGTCCCTGTGGCTGGAGGCTGAAGTCCACGTAGGCCCCGGCGGGGAGCCGCTGGGGTGTAGGC CGGGTGCCTTTGTCCAAGCCTGGCGCCACTGCCCAGACACTTTACTTCAAATTTGGCTTTATTTTCATCATTGATAT TGATTAAAATGACATTCACTTGCCCGGAAAGTAAAAGAGGTCTTCAGCACAAAATATTGCTCCAACAAGCAAGCATA AATCACTGAGATTGAAATGTCATCTATCTTTATTGGCCAACCACATAATCTCCATGAAAATTCTCAACAGAGAGCAA GGAACTCACTTTCTTCTAAGCAAAGACAATTTGGATTTGCCTCGTGGCACTGGCATCTCTTCATGTCTGGACGTCAG ATGTTAGCTTGGTGCCTTTCTCCCTTATCAGGGGGACATTTTGAACCCAGCCGCACCAATGTTCTCATGGATGGTGG CCTTCGATTCTTCTAGATTCAAGATTTGGCTCTTGTACTTTTCCTGCCAGTCCTCTACAATGTACTGGTGGTAGGGG TCATTGGAGTGTTCCCGTCTCTTGGATTTCACAGTGCTCACCAGGATGGCCACGATGATGAAAGAGAACATTCCAAT CATCACCATGAGGTACAGGATGACATAGTAGAAGTTCTCAGCATCAACTTTGGCTTGGAGGGCCTCTTGCTCAGCTG TTGTGTTCTGGCGCCAATTGTCCATATAAGTAATAAAAATCCTTCGGAAGACGTC。
[0010] 本发明还提供一种检测胃癌细胞和组织中的长链非编码RNALnc21q22. 11表达水 平的特异性半定量RT