一种检测混合肉制品中牛肉成分质量百分比的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种检测混合肉制品中牛肉成 分质量百分比的实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 食品的质量和安全一直是社会关注的焦点，随着人们生活水平的提高，肉制品消 费已成为食品消费的主流，要确保广大消费者的切身利益，就要保证各种肉制品质量可靠。 目前利用肉制品掺杂掺假欺骗消费者而牟取暴利的事件屡屡出现，而且如果清真食品中掺 有猪肉成分会涉及到宗教、民族问题，不利于社会和谐稳定。肉制品的"掺杂使假"不仅严 重扰乱市场正常的竞争次序，而且给消费者的身心健康带来许多负面影响，是一个世界性 的食品安全问题。因此快速准确科学检测混合肉制品中特定肉源成分的质量百分比，对食 品安全具有重要意义。
[0003]目前，肉种的鉴定技术以蛋白质结构或DNA序列特异性这两种主要方法。以蛋白 质为基础的鉴定技术有一定的局限性，尤其当肉类经过加工过程，改变了蛋白质的结构，从 而破坏了物种特有的蛋白质或抗原决定部位。DNA序列方面，特别是实时荧光PCR技术的出 现，实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且它采用了完全闭管检测，避免了交叉污染，可实 行自动化操作且耗时短，已成为分子生物学研究中的重要工具，亦被应用于食品监测中，是 现行的行业标准中指定的方法之一。该技术在一定意义上可对目标基因进行定量，从而实 现定量检测。当前实时荧光PCR技术在食品相关检测研究中主要还是运用在转基因成分的 定量，食品成分方面的应用局限于少数产品中，牛肉的定量检测方面目前在国内外报道较 少。现有检测标准主要是对食品中牛源性成分的定性检测，但是目前无针对肉制品中牛肉 成分含量（w/w)的定量检测标准，使得监管部门很难判定违法厂商的责任。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速测定混合肉制品 中牛肉成分质量百分比的试剂盒，所述试剂盒可以简便、快速、安全、特异性地定量检测出 混合肉制品中牛肉成分的质量百分比。本发明还提供用该检测试剂盒检测混合肉中牛肉质 量百分比的方法，对食品安全检测具有重要意义。
[0005]本发明的主要原理：以系列牛肉质量百分比的混合肉样基因组DNA模板作为标准 品。通过荧光PCR仪扩增标准样品中真核生物通用基因和牛特异性基因的荧光强度后，制 成牛肉质量百分比与ACt的标准曲线。最终在检测时将提取的待测样品DNA分别置于真 核生物通用检测体系和牛特异性检测体系中，经检测荧光强度得到ACt并对照标准曲线 实现牛肉成分质量百分比的定量检测。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本发明的第一方面，提供了一种检测混合肉制品中牛肉成分质量百分比的荧 光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：总DNA提取试剂，DNA纯化试剂，18S荧 光定量PCR预混液试剂，Beef荧光定量PCR预混液试剂，标准品；所述的18S荧光定 量PCR预混液试剂是真核生物通用基因检测的扩增反应液，其包括真核生物通用寡核 苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，具体为： 5' -CTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示，具体为： 5' -TAATTTGCGCGCCTGCTG-3' ；所述的Beef荧光定量PCR预混液试剂是牛特异性基因检测 的扩增反应液，其包括牛特异性寡核苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO: 3所示，具体为：5' -GGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3'，下游引物的核苷酸序列 物如SEQIDN0:4 所示，具体为：5' -GGATTGCTGATAAGAGGITGGTG-3'。
[0008] 所述真核生物的通用寡核苷酸引物是根据真核生物核糖体小亚基18SrRNA基因 序列的保守序列设计的。所述牛特异性寡核苷酸引物是根据不同动物物种之间线粒体细胞 色素b基因上的DNA序列多态性设计的。所述真核生物的通用寡核苷酸引物和牛特异性寡 核苷酸引物的组合使用是本发明试剂盒的关键，本发明的两组引物对具有相似属性，包括 引物Tm值、扩增产物长度等，从而最大限度地降低了测试过程中的系统误差。
[0009] 优选地，所述总DNA提取试剂包括TNE裂解液、盐酸胍溶液和蛋白酶K溶液；所 述TNE裂解液组成成分及终浓度为：10mmol/LTris，150mmol/LNaCl，2mmol/LEDTA， lg/100mLSDS;所述盐酸胍溶液的终浓度为5mol/L的；所述蛋白酶K溶液的终浓度为 20mg/mL〇
[0010] 优选地，所述DNA纯化试剂购于Promega公司的Wizar膽>DNAClean-UpSystem;
[0011] 优选地，所述18S焚光定量PCR预混液试剂每个检测单位由10IiL2xQuantiFast SYBRGreenPCRMasterMix，0.4yL上游引物，0.4yL下游引物，5.2yLCldH2O组成；所述 上游引物和下游引物的浓度均为10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBRGreenPCRMaster Mix购于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit〇
[0012] 优选地，所述Beef荧光定量PCR预混液试剂每个检测单位由10yL2x QuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix，0. 4yL上游引物，0.4yL下游引物，5. 2yL ddH20组成；所述上游引物和下游引物的浓度均为10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBR GreenPCRMasterMix购于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit0
[0013] 优选地，所述标准品由系列牛肉质量百分比的混合肉样基因组DNA模板组成； 所述系列牛肉质量百分比的混合肉样分别为牛肉质量百分比〇. 05%，0. 1 %，0. 5%，1 %， 2. 5%，5%，20%，45%，100% 的混合肉样。
[0014] 优选地，所述试剂盒中还含有阳性对照，所述阳性对照为纯牛肉基因组DNA。
[0015] 优选地，所述试剂盒中还含有阴性对照。所述阴性对照为非牛肉基因组DNA。
[0016] 优选地，所述试剂盒中还含有空白对照。所述空白对照不含DNA模板，可以CldH2O 代替。
[0017] 优选地，所述试剂盒中还含有使用说明书，便于本领域技术人员使用本发明的试 剂盒。
[0018] 进一步的，本发明的第二方面，还提供了一种采用前述试剂盒检测混合肉制品中 牛肉成分质量百分比的方法，包括下述步骤：
[0019] 1)待测样品前处理：称取2g待测样品至50mL离心管，加入20mLPBS缓冲液，研 磨仪研磨80s，每组样品设有6个平行样。所述的PBS缓冲液购于上海生工生物工程有限公 司，或由磷酸二氢钾（KH2PO4)、磷酸氢二钠（Na2HPO4)、氯化钠（NaCl)、氯化钾（KCl)自配成 PBS缓冲液；
[0020] 2)DNA提取和纯化：取IOOmg样品匀浆液与2.OmL离心管中，加入860 yL的TNE 裂解液、100 yL的盐酸胍溶液，40 yL的蛋白酶K溶液，充分混匀；60°C温浴4h;冷却至室 温，16700g离心15min，取500 yL的DNA上清液加入到2mL离心管中；加入ImL的WizarcT DNAClean-UpResin混合彻底，移至连接有'Wizard?'Minicolumn的5mL注射管中；按压注 射器的内芯，将混合物洗脱在Wizard8'Minicolumn并弃滤液；取下Wizard81Minicolumn后 拔出注射器内芯并重新连接到注射管，添加2mL的80%异丙醇，按压注射器内芯洗涤弃滤 液；将Wizard'8'Minicolumn转移到I. 5mL离心管，1000 Og离心 2min，静置 5min;将Wizard* Minicolumn移至新的I. 5mL离心管上，加入50yLpH8. 0的TE缓冲液静置lmin，1000 Og 离心30s洗脱得到纯化的DNA模板；提取的DNA质量用核酸蛋白分析仪进行测定，当OD26q/ OD28。比值在1. 7~2. 0之间时，适宜于PCR扩增，将DNA稀释至5ng/yL;所述的TNE裂解 液、盐酸胍溶液、蛋白酶K溶液包括在所述检测混合肉制品中牛肉成分质量百分比的荧光 定量PCR检测试剂盒的总DNA提取试剂中；所述的WizarcfDNAClean-UpResin和Wizarcf Minicolumn包括在所述检测混合肉制品中牛肉成分质量百分比的荧光定量PCR检测试剂 盒中的DNA纯化试剂中；所述的异丙醇溶