一种用srap分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种用SRAP分子标记对扁 穗雀麦品种进行鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 扁穗雀麦（BromuscatharticusVahl.)属于禾本科雀麦属植物，冷季型一年生或 越年生优质禾草，在我国西南、华中、华北等地大多作为一年生或越年生牧草加以利用。该 草种具有产量高、冬春季生长快、分蘖多、适应性强的特性，是冬春季的优良补饲牧草，还具 有营养价值较高、叶量丰富、适口性好、种子成熟后仍能保持青绿等特点，是冬春季的优良 补饲牧草，同时由于其根系发达还被广泛用于水土流失治理。基于上述原因，扁穗雀麦在长 江中上游地区愈来愈受到育种家和牧草种植者的重视。扁穗雀麦为自花授粉植物，种质群 体内部的一致性较高，目前国内外育种主要是对野生或逸生种质资源利用混合选择，选育 出表现优良后代群体，如国审品种"黔南"和"江夏"等，国外利用混合选择或综合品种选育 法登记的品种约为26个。近年来草地畜牧业的不断发展和壮大，扁穗雀麦等一年生饲草品 种在南方农区得以大面积推广，草种子需求量日益增加。由于生产、管理、经营不规范，不合 格种子甚至假种频繁混入市场，不仅对养殖场和农户造成了一定损失，同时损害了品种权 拥有者的利益和广大农民的经济利益，破坏了市场秩序。因此，建立扁穗品种快速可靠的鉴 定技术体系对于其品种和种质资源的研究与保护及草种和畜牧业的持续发展均具有重要 的意义。
[0003]目前对于扁穗雀麦等牧草品种的鉴定仍只是传统形态鉴定法，这依赖于品种之间 的表型差异，而形态性状受到气候、环境、营养状态和物候期等多种因素影响，且形态鉴定 法工作量大、鉴定周期长、成本很高。而同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶 有组织特异性、稳定性差，这对于扁穗雀麦品种鉴定、推广利用和育种等工作造成不利影 响。
[0004]分子标记能反映生物个体或种群基因组中具有差异特征的DNA片段，具有丰富的 多态性和环境稳定性，且操作简便，近年来已经广泛应用到植物品种鉴定和种质资源分类 等研究领域。目前，应用较多的是ISSR、SSR、AFLP和SRAP等分子标记。相关序列扩增多态 性（sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)是由美国加州大学Li和Quiros 于2001年提出的一种基于PCR的通用型分子标记方法。SRAP通常为显性标记，呈Mendel 式遗传，具有很好的稳定性和多态性，因而是非常理想的分子标记。其技术的原理是使用一 个17碱基正向引物和一个18碱基反向引物扩增基因的开放阅读框（openreadingframe， 0RF)。因为正反引物分别扩增基因组的不同区域，充分利用了非编码区和编码区的碱基序 列差异，因此SRAP标记在基因组中是均匀分布，可以覆盖整个基因组，利用少数的引物就 可以进行不同组合的扩增，这将大大提高引物的多态性扩增丰富度和使用率，同时也节约 合成引物的成本。由于SRAP标记具备RAH)标记操作的简易性和AFLP分子标记的高扩增 多态性，目前SRAP分子标记已经在各个领域已有广泛的应用，如植物的遗传多样性、品种 鉴定、指纹图谱绘制、连锁图谱构建等方面。。但在扁穗雀麦中，应用SRAP分子标记技术进 行品种或种质资源鉴定、构建品种指纹图谱的方法尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法使该 方法能够利用SRAP分子标记技术准确、简便的鉴定扁穗雀麦品种和其它种质资源。
[0006] 为实现上述目的，本发明技术方案如下：
[0007] -种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，包括如下步骤：
[0008]S1、以10个常用的扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取 无病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总 DNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各 品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。取各品种少量原始DNA 溶液稀释至lOng/uL，于-20°C保存备用；
[0009]S2、以步骤S1所得的DNA进行SRAP-PCR扩增，扩增产物用6 %的聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离；200V电压预电泳30min，每孔上样6yL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部 3-5cm，停止电泳；用0. 1%AgN03染色，在NaOH溶液中显影，照相观察并记录结果；
[0010]S3、根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，以扁穗雀麦品种编号 为横行，以每条谱带的位点编号及其分子量为纵行，在每一横纵坐标交结处，有扩增谱带就 标记为" 1"，无扩增谱带就标记为"0"，分别绘制每对引物对供试品种的DNA指纹图谱表；
[0011] S4、利用Freetree软件计算供试扁穗雀麦品种之间的Dice遗传距离系数，进行类 平均法（UPGMA)聚类分析，获得能反映获知供试品种间的亲缘关系的树状图（含bootstrap 支持率），获知供10个常见扁穗雀麦新品种间的亲缘关系。
[0012] 其中，所述扁穗雀麦品种包括国内审定的2个品种-"黔南"和"江夏"。
[0013] 其中，所述的步骤S2中SRAP-PCR扩增采用15yLPCR反应体系，2XTaqPCR Mix(400yMdNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、2.0mMMgCl2)7.5yl、模板DNA3yl(10ng/ yL)、上下游引物均为0? 9yL(5yM)、TaqDNA聚合酶0? 2yL(5U/iiL)，灭菌水补足15yL;
[0014] 其中，所述的步骤S2中PCR扩增程序为：94°C变性5min，1个循环；94°C变性lmin， 35°C退火lmin，72°C延伸90s，共5个循环；之后35个循环：94°C变性lmin，51°C退火lmin， 72°C延伸90s;最后72°C延伸lOmin;4°C保存。
[0015] 其中，所述SRAP-PCR扩增中采用的引物共14对，包括SEQIDNO. 1~NO. 14。
[0016] 上述方法可用于获知未知材料与已知常见的扁穗雀麦品种之间的亲缘关系，鉴定 扁穗雀麦种子的真假。
[0017]本发明选取10个在生产中常用的扁穗雀麦品种为供试材料，采用400对SRAP 引物（上下游各20条）分别扩增上述扁穗雀麦品种的DNA，根据10个扁穗雀麦品种的 SRAP-PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行筛选，筛选出在不同品种 间能够扩增出多态性丰富、带型清晰而且能够稳定重复的特征谱带的引物对，共计14对， 并经Freetree软件检验无重合。在本发明所述方法的指纹图谱构建过程中，所述将有扩增 条带标记为1、无扩增条带标记0,以便用于相关分析软件，提高数据分析效率。此外，品种 编号为横坐标、条带编号为纵坐标，或者采取相反的做法，这属于数据格式的不同，本发明 不做具体限制。采用本发明构建的扁穗雀麦DNA指纹图谱，可以根据扁穗雀麦品种数量增 加及品种的更新换代等需要不断增加和更新，以满足草地畜牧业生产中扁穗雀麦品种真实 性鉴定的需要。除此之外，按照本发明所述方法还可以将表1常用扁穗雀麦品种外的其他 种质资源构建SRAP指纹图谱，如此便可鉴定更多的待测扁穗雀麦品种或种质。同时，待测 扁穗雀麦品种SRAP指纹图谱与已经构建的SRAP指纹图谱比对时，需要计算出品种间的遗 传距离或相似系数，来判定品种间的亲缘关系和区分品种。
[0018] 本发明的有益效果在于：
[0019] 本发明选取适合于扁穗雀麦的高多态性SRAP引物，应用SRAP分子标记技术构建 常用扁穗雀麦品种的DNA指纹图谱，有利于对扁穗雀麦品种及种质资源进行快速、准确的 鉴定，且操作简单实用，结果稳定可靠，为扁穗雀麦品种和其它种质资源的准确鉴定、育种 利用和新品种知识产权保护提供了重要依据，为扁穗雀麦种质资源标准指纹库的构建初步 奠定了技术基础。
【附图说明】
[0020] 图1为引物组合11F6R对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图（M: marker50bp;1-10 :表1中所列的10个扁穗雀麦品种）。
[0021] 图2为引物组合18F10R对10个国内外主要扁穗雀麦品种的扩增结果电泳图（M: marker50bp;1-10 :表1中所列的10个扁穗雀麦品种）。
[0022] 图3为本发明实施例1中构建的品种间的亲缘关系的树状图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0024] 本发明实施例提供了一种用SRAP分子标记对扁穗雀麦品种进行鉴定的方法，包 括如下步骤：
[0025]Sl、DNA提取：以扁穗雀麦品种幼苗植株为材料，每个品种选取10株，每株选取无 病害幼嫩叶片1片，将10片分别来自不同植株的叶片等重量混合，提取每个品种的总DNA， 用1 %琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度以及完整性，用紫外分光光度计测定各品种 总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。取各品种少量原始DNA溶 液稀释至lOng/uL，于-20°C保存备用；
[0026]S2、SRAP-PCR扩增及电泳检测：
[0027] 15 y L PCR反应体系中，2XTaq PCR Mix(400 yM dNTPs、15mMTris-HCl、75mMKCl、 2. OmM MgCl2) 7. 5y1、模板DNA3y1 (lOng/L)、上下游引物均为0?9yL(5yM)、Taq DNA聚 合酶0. 2 y L (5U/ y L)，灭菌水补足15 y L。
[0028]PCR扩增程序：94°C变性5min，1个循环；94°C变性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸 90s，共5个循环；之后35个循环：94°C变性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸90s;最后72°C 延伸lOmin;4°C保存。
[0029] PCR扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。200V电压预电泳30min，每孔 上样6yL，400V恒压电泳，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳；用0. 1 %AgN03染色，在NaOH溶液中显影；照相