一种鸡枞菌的dna条形码标准基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种鸡枞菌的DNA条形码标准基因及其应 用。
【背景技术】
[0002] 鸡枞，隶属真菌类担子菌纲伞菌目伞菌科。我们常说的鸡枞菌是一类与大白蚁亚 科(Macrotermitinae)的某些种特异性共生的真菌，故又名蚁巢伞或白蚁伞。鸡纵菌被称 为野生食用菌之王，其肉质肥厚、质细丝白、脆嫩爽□、清香鲜美、营养丰富，含有I丐、镁、铁、 蛋白质等多种营养成分，富含磷，含有20多种氨基酸。此外，鸡枞菌中还含有治疗糖尿病的 有效成分，对降低血糖有明显的效果。鸡枞菌是人们食用和送礼的首选，市场需要在逐年增 加。最新版的《真菌字典》（Ainsworth Bisby's Disctionary of the Fungi)共记录和描 述了全世界的40个鸡枞菌物种，而云南地区的鸡枞菌物种就达到20种，可见云南地区鸡 枞菌种类之丰富。据估计，云南每年的鸡枞菌产量在2000吨左右。但是，近年来由于市场 需求加大，鸡枞菌的自然群体面临着被过度采摘的威胁；加之随着生态环境的破坏，鸡枞菌 的栖息环境正在变得越来越少，野生鸡枞菌种质资源受到了严重的威胁，对野生鸡枞菌的 保护迫在眉睫。另一方面，由于对鸡枞种质资源缺乏系统的认知，鸡枞菌市场上种类鱼目混 杂，优劣不等，不良商贩以次充好、以假充真的现象屡见不鲜。民间多根据鸡枞的颜色，分为 黑皮、白皮、黄皮、花皮等许多类型，味道以黑皮(青皮）鸡枞最好，有人还根据鸡枞菌盖的形 状分类，认为质量最好的是蒜头鸡枞，次为开鸡枞，再次为火把鸡枞，但是这些形态特征多 受到鸡枞发育程度和生长环境的影响，带有极大的人为因素。另外，由于公众缺乏对野生鸡 枞菌的准确鉴别能力，食用毒蘑菇导致死亡的事件时有发生。因此，急需建立其分子鉴定方 法，通过形态型划分与分子数据分析相结合的方法来解决其鉴别和分类问题，并通过这些 分子数据研究其遗传多样性，揭示鸡枞菌在云南地区的遗传分布和群体结构，为鸡枞菌的 资源保护提供理论参考。
【发明内容】
[0003]为克服形态学鉴定鸡枞菌存在的缺陷，本发明提供了一种鸡枞菌分子鉴定的标准 基因序列及鉴定方法，可以快速准确地将该物种从易混淆物种或复合种中鉴定出来。
[0004]为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 一种鸡枞菌的DNA条形码标准基因序列SEQ ID NO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0005] 应用权利要求1所述的标准基因进行分子鉴定方法包括以下4个步骤： (1) 从样品组织中分离提取基因组DNA; (2) 以步骤（1)所提取的基因组DNA为模板，用鸡枞菌RPB2特异性引物，进行聚合酶 链式反应； (3) 对步骤（2)扩增得到的DNA产物进行测序； (4) 将测序结果进行手工拼接，与所述基因序列RPB2的进行同源性比对，若同源性在 99%以上，即可将该样品鉴定为鸡纵菌（cXrjOeaiiAs·)。
[0006] 进一步，所述的RPB2特异性引物的引物序列为： RPB2B-f: 5' -CCGCAAAGGCTGGTGTATC-3' ， RPB2B-r: 5? -TTCGAATGAGTTCAAGTGT-3?； 进一步，所述聚合酶链式反应，其扩增条件为95°C预变性3min，接下来94°C变性30s， 50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共进行30-35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0007] (1)根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法，确保条带的纯度及可靠性。测 序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的鸡枞菌样品提取基 因组DNA，利用引物进行聚合酶链式反应（PCR)扩增出样品的RPB2基因，将扩增产物测序后 分析比对，优选SEQIDNO. 1引物序列扩增样品的RPB2基因序列片段作为标准基因。为了 实现上述目的，一种用于鸡枞菌分子鉴定标准检测基因如下所述的基因序列SEQIDNO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0008] (2)样品的鉴别：通过将待鉴别的样品序列与标准基因进行比对，基于同源性和基 于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得序列间的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遗传距离最近的对应物种即为待鉴别的物种；具体如下： a.基于同源性鉴定规则来鉴别物种 根据测序结果，如果与所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判断所述 的待测样品为尖盾白蚁伞（c乂
[0009]b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种 将标准基因序列和待鉴定的样品序列与鸡枞菌其他种内的RPB2序列合并应用MEGA或 PAUP软件构建NJ系统发育树，检验未鉴定样品的DNA条形码序列与标准基因序列聚类在 一起的物种，若未知样品与数据库中的物种构成单支系，则鉴定为该物种。
[0010] 本发明的优点在于： 1、优选RPB2基因作为最适合鉴别尖盾白蚁伞（