一株马氏副球菌及其在促进聚球藻生长中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物工程技术领域，特别设及一株马氏副球菌及其在促进聚球藻生 长中的应用。
【背景技术】
[0002] 蓝藻是一类地球上古老的能够进行产氧光合作用的原核微生物，通过基因工程 改造，它们在医药、能源、环保等领域具有重要的应用优势，具体体现在（1)蓝藻能够吸收 太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝藻作为一类古老的微生 物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；（3)蓝藻遗传操作方 便，遗传背景清晰，并且许多种类的蓝藻的基因组测序工作也已经陆续完成，运使得利用基 因工程手段改造蓝藻非常方便。
[0003] 聚球藻7002作为一种单细胞海洋蓝藻，具有生长快、结构简单的特点，且全基因 组序列已破译，是一种表达外源基因的最理想基因研究材料和宿主之一，其基础研究已较 为成熟。当前通过基因工程改造，利用聚球藻7002在制备蜡醋、嗜铁素、人肿瘤坏死因子a 口服剂、W及通过微藻培养进行产氨与制备生物乙醇等方面已开展较多深入研究，并取得 关键进展，部分已进入中试放大阶段，在生物基因工程改造产业化应用方面具有十分重要 的潜力和价值。
[0004] 然而微藻相对于细菌等微生物而言，其培养周期较长，生长相对缓慢，成为实际生 产环节中影响时间和金钱成本的重要制约因素之一，如何有效改进聚球藻的培养方式，提 高藻体光合生长的效率，缩短其培养周期，具有重要的现实意义和应用前景。
[0005] 传统的微藻培养往往是通过改善光照条件与培养溫度、W及调节培养液中二氧化 碳浓度、抑值与营养盐成分等对藻类生长条件进行优化，然而，通过改进培养条件在一定程 度上虽然可提高微藻生长速度，但改进结果往往并不是十分理想。而在传统优化培养条件 的基础上，若能增加利用生物因子促进微藻生长，将是一种十分具有重要意义的创新方法。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，筛选出一株马氏副球菌，并发现其能明显地提高聚 球藻的光合生长速率，从而促进聚球藻生长。
[0007] 自然界中微藻自身周围总是附生大量细菌等微生物。藻类与细菌之间的关系错综 复杂，既对立又统一。一方面细菌可为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子，从而调节 藻类的生长环境；另一方面细菌也可通过直接的或间接的作用抑制藻细胞的生长，甚至裂 解藻细胞，主要体现在营养竞争、毒素释放W及溶藻酶类的产生等。
[0008] 细菌对藻类生长的促进作用主要集中在营养改善（生源要素的提供、生长因子的 转化）、信息素调节和协同保护。对生源要素的改善中，主要体现为通过固N作用、还原=价 铁为溶解度较高的二价铁、还原产生无机憐、产生和分泌维生素（如VBi2)等方式促进藻类 生长。在为藻类提供生长因子方面，主要体现为细菌可转化和加工各种激素和生长促进剂。 例如一些海洋细菌能产生植物激素（如植物细胞分裂素和巧长素）促进藻类生长。此外， 细菌对维持藻细胞个体形态也有调节作用。另外，细菌通过对毒物进行吸附、分解和转化， 可减少或消除重金属W及污染物对藻细胞的侵害，进行协同保护。
[0009] 本发明筛选出一株马氏副球菌，命名为ParacoccusmarcusiiSYN7002-084;于 2015年10月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNo. 11548。
[0010] 1)菌株的筛选及分离纯化
[0011] W城市滨海水体作为促生菌分离源，采用微藻选择压力法进行藻际细菌富集，随 后采用涂布平板及分区划线法经多次纯化分离，最终筛选出具有较高促进微藻生长效能的 菌株，编号SYN7002-084;将其接入斜面培养基，于冰箱4°C保存；细菌培养基采用2216E培 养基；
[0012] 2)菌株的分子生物学鉴定：
[0013]使用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R巧'-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3'），并应用PCR技术，从该菌株总DNA中扩增16SrDNA片段。经琼脂 糖凝胶电泳检测，发现具有一条约为1. 5化大小的PCR特征性条带，运与该菌株的16SrDNA 的理论估计值相符。进一步利用双向引物测序，最终得到菌株的16SrDNA的序列为：SEQ. ID.NO. 1。
[0014] 将SYN7002-084的测序结果提交到GenBank进行比对，发现SYN7002-0845和 Paracoccusmarcusii同源性为 99%，命名为ParacoccusmarcusiiSYN7002-084。
[0015] 该菌株为好氧、革兰氏阴性菌，短杆状，无鞭毛，细胞大小为0.5~0.9ym，在 2216E培养基上生长时，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘不整齐，黄色。电镜图片如 图1所示。
[0016] 本发明的另一个目的在于公开马氏副球菌在提高聚球藻产量中的应用。
[0017] 所述马氏副球菌的菌液浓度为2. 16XIO9个/111以按照5%的体积比添加到聚球藻 的培养液中。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019]W聚球藻培养液中的叶绿素巧光值与藻细胞密度为度量指标，结果表明该菌株具 有较强的促进微藻生长的作用，一定时间内可使聚球藻光合生长效率提高3. 19倍，大大缩 短微藻培养周期，单位时间内可明显提高微藻产量，节约时间和金钱成本，提高收益。
【附图说明】
[0020] 附图 1 为本发明ParacoccusmarcusiiSYN7002-084 电镜图片； 1^0021]附图2为聚球藻P(X7002培养液中加入促生菌Paracoccusmarcusii SYN7002-084后藻液中的叶绿素巧光值变化（可度量藻类光合生长效率）；
[0022] 附图 3 聚球藻PCC7002 培养液中加入促生菌ParacoccusmarcusiiSYN7002-084 后藻液中的藻细胞密度变化。
【具体实施方式】
[0023] 本发明的【具体实施方式】如下： 阳〇24] 实施例I:
[0025] 本实施例W青岛石老人城市滨海水体作为促生菌分离源，采用微藻选择压力法进 行藻际细菌富集，随后采用涂布平板及分区划线法经多次纯化分离，最终获得325株细菌 株系，分别将每株细菌至于50mL液体培养基中，25°C，200巧m条件下培养1-3天，然后从 中取出5mL分别加入到50mL聚球藻培养液中，考察、比较各菌对藻类生长的促进效果，最 终筛选出具有较高促进微藻光合生长能力的菌株SYN-084。经鉴定为马氏副球菌，命名为 ParacoccusmarcusiiSYN7002-084,将其接入斜面培养基，于冰箱4°C保存。 阳0%] 细菌培养采样2216E培养基。培养基配方构成为表1 :
[0027]表1Zobell2216E培养基配方
[0030] 固体2216E培养基需加入1.5%的琼脂粉，121°(：，2〇111111高溫高压灭菌后倒平板备 用。2216E液体培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司提供。
[0031] 将保藏培养基菌种活化后接种到装有培养基的50mL无菌S角瓶中，在25°C、 20化pm条件下震荡培养4化后，细菌进入对数增长期，将2血菌液化16XIO9个/Ml倒入 50ml含对数生长期聚球藻的A+培养液中（藻密度为1. 84XIO7个/Ml)，溫度为30°C，光照 强度：1化光照：1化黑暗，叶绿素巧光值为27. 446,设空白对照。
[0032]聚球藻PCC7002培养基mediumA
[0033] 主要成分如下：
[0034]聚球藻PCC7002培养基mediumA
[0035] Abase:配制10倍混合液，然后混合稀释成Ix工作浓度
[0037] *注：如果没有无水氯化巧，可用二水合氯化巧
[0038] D7 微量元素（1000Xg/L)
[0040]AFMBase: =ABase+Fe-邸TA+微量元素（1000血）
[0041 ]
阳O创完全A培养基：分别将下列溶液高压湿热灭菌，然后加到IxAFMBase,混匀。
[0044] 在光照培养条件下使用A+培养基培养藻种，培养条件如下，培养溫度：2(TC，光照 强度为3000LUX，光照间隙是白天12h:黑夜12h，每隔1天测定受试藻液的叶绿素巧光值和 藻细胞密度，连续监测8天。
[0045] 叶绿素巧光值采用检测藻液在激发波长440nm、发射波长680nm处的巧光强度，与 对照组比较，藻细胞密度采样流式细胞计数法（使用配有488皿氣激光器的化icsAltra II型流式细胞仪进行细胞计数，根据侧向散射光VS红色巧光和澄色巧光VS红色巧光来确 定聚球藻的位置，加入直径为1ym的巧光微球作为内参。 W46] 结果表明，如图1和2所示，叶绿素巧光值在添加马氏副球菌Paracoccus marcusiiSYN7002-084细菌后表现出明显的快速增高趋势，在培养六天时间内，其聚球藻 光合生长效率相对于对照组提高了 3. 19倍，藻细胞密度和藻细胞体积亦明显提高。
【主权项】
1. 一株马氏副球菌（fflarcysii)，它的保藏号是CGMCCNo. 11548。2. 如权利要求1所述的马氏副球菌，其特征在于，它的16SrDNA序列如SEQIDNO. 1 所示。3. -种如权利要求1所述的马氏副球菌在提高聚球藻产量中的应用。4. 如权利要求3所述马氏副球菌在提高聚球藻产量中的应用，其特征在于，所述马氏 副球菌的菌液浓度为2. 16X109个/mL，按照5%的体积比添加到聚球藻的培养液中。
【专利摘要】本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一株马氏副球菌及其在促进聚球藻生长中的应用。本发明筛选出一株马氏副球菌，命名为<i>Paracoccus</i><i>？marcusii</i>？SYN7002-084；于2015年10月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为？CGMCC？No.11548。该菌株具有较强的促进微藻生长的作用，一定时间内可使聚球藻光合生长效率提高3.19倍，大大缩短微藻培养周期，单位时间内可明显提高微藻产量，节约时间和金钱成本，提高收益。CGMCC No.1154820151028
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105296399
【申请号】CN201510829667
【发明人】张永雨, 唐丽丽, 梁彦韬, 解瑞泽
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月25日