一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]进入新世纪，我国的老龄化问题日见突出，一些老年性疾病开始增多，小脑萎缩就是其中之一，目前的治疗手段主要还是药物治疗，采用干细胞治疗小脑萎缩的案例较少，多数采用的是细胞移植，细胞移植的治疗方法不仅治疗效果不好，会给患者的身体健康带来副作用，而且成本较高，患者在治疗过程中所随的痛苦较大，而且对于医生的医术也要求较高，这给患者和医生都带来了极大的不便。
[0003]通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献:
[0004]1、一种治疗小脑萎缩的药物(CN1600326)，公开一种治疗小脑萎缩的药物，它是由下列重量配比的原料制成的药剂:当归3 — 10克、党参10 — 15克、黄芪10 — 15克、冬虫夏草3 — 10克、白术3 — 10克、升麻3 — 10克，柴胡3 — 10克、陈皮3 — 10克、甘草1.5 —10克。探索脑萎缩的发病机理，治疗小脑萎缩应以补肾填精、通气血为原则。根据以上原贝1J，结合当归、党参、黄芪、冬虫夏草等中药的药理作用，经过精心配制，采用君、臣、佐、使的配伍原则制成了本发明治疗小脑萎缩的药物。该药物对脊髓有选择性兴奋作用，对大脑皮层亦有一定兴奋作用，主要作用于中枢神经系统，能兴奋神经，增加抵抗力，免疫力，对中气下行神经衰弱的表现，能提高疗效，能克服其它兴奋剂的痹病，本品常用有保健，长寿的作用，特别是小脑萎缩，橄榄桥萎缩，能起到治疗的效果，消除一切症状，恢复健康。本发明的药物经80例临床统计结果如下:有效75例、治愈50例、无效5例，总有效率达93.7 %，治愈率达62.5%。
[0005]2、一种治疗小脑萎缩的中药组合物及其制备方法(CN101757570A)，公开了一种新的治疗小脑萎缩的中药组合物及其制备方法，本发明中药组合物主要由以下原料药组成:生黄芪、白芷、当归、葛根、菊花、香附、枳实、神曲、丹参、红花、益母草、牛膝、苏合香、安息香、石菖蒲、人参、西洋参、党参、白芍、益智仁、熟地黄、何首乌、枸杞子、补骨脂、菟丝子等。本发明中药组合物可按照常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服制剂。本发明可显著改善因小脑萎缩引起的记忆力减退、失眠、头昏，耳鸣，懈怠，头晕眼花，四肢乏力，少气懒言，动作笨拙，步履蹒跚，思维迟钝，表情呆板，智能低下等症状，临床疗效确切，疗效显著，见效迅速。
[0006]3、一种治疗小脑萎缩的中药组合物(CN104758641A)，涉及一种治疗小脑萎缩的中药组合物，该组合物包括:天麻、钩藤、白芷、葛根、全虫、僵蚕、枳实、神曲、五味子、当归、益母草、香附、丹参、石决明、甘草。本配方组方简单，对改善小脑萎缩的症状有明显的效果。
[0007]通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种制备方法简单、成本低廉的治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法，该方法制备得到的再生修复细胞的纯度高、杂质少，该产品能够通过改变人体内细胞的大环境，提高体内的细胞的质量，使失去活性的细胞获得新的生命，大大减小了该制剂对人体的副作用，大大提高了该制剂对小脑萎缩病人的疗效，其可直接给病人进行注射治疗。
[0009]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
[0010]一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法，步骤如下:
[0011]制备间充质干细胞后，经过培养细胞、传代细胞、扩增细胞、收获细胞、纯化细胞，即得治疗小脑萎缩的再生修复细胞。
[0012]而且，步骤如下:
[0013]⑴间充质干细胞的制备:
[0014]选择脐带、剪切、处理组织、消化、分离、培养，制备间充质干细胞；
[0015]⑵细胞的换液:
[0016]取培养24小时以上的原代细胞按体积比1:3的比例加入新的培养液继续培养；
[0017]⑶细胞的传代:置显微镜镜下观察长满单层的细胞，可进行传代时即进行传代，传代之后培养5天，期间换液一次；
[0018]⑷细胞的扩增:
[0019]在无菌条件下对步骤⑶的细胞进行扩增，选出长满致密单层的细胞进行扩增，培养4天收获；
[0020](5)收获细胞:
[0021]在无菌条件下将步骤⑷扩增后的细胞，消化之后收集到1个离心管中；
[0022](6)纯化细胞
[0023]在无菌条件下将步骤(5)收获的细胞，进行离心；
[0024](7)分装
[0025]在无菌条件下将步骤(6)离心后的细胞进行分装，即得治疗小脑萎缩的再生修复细胞。
[0026]而且，所述步骤⑴中的间充质干细胞来源于剖腹产新生儿的脐带，所述脐带无菌保存于PBS溶液中。
[0027]而且，所述步骤⑵培养细胞的条件是37°C 5% C02 ;或者，所述步骤⑵中培养液为含质量百分数10% FBS的培养液。
[0028]而且，所述步骤(5)中对消化之后收集到1个离心管中的细胞再进行细胞计数操作。
[0029]而且，所述步骤(6)离心为高速离心。
[0030]而且，所述步骤(7)中分装为将细胞按体积分装在EP管中。
[0031]而且，具体步骤如下:
[0032]⑴细胞制备:
[0033]选择良好的脐带:取正常剖腹产新生儿脐带，放入含有庆大霉素的PBS溶液中备用；
[0034]剪切:先将脐带取出，用剪刀把脐带剪成几段，用PBS清洗，洗掉血污，反复洗2次，再用眼科剪把脐带切成1-2毫米大小的块，以便于消化；
[0035]消化:将已剪碎的组织块倒入一个干净的离心管中，其中加入I型胶原酶，胶原酶的体积没过组织块，将其置入37°C摇床中，消化100分钟；
[0036]离心:消化之后，将含有组织块的离心管放入离心机中，低速500?1000转/分离心8分钟，离心之后倒掉上清；
[0037]培养:用含质量百分数10% FBS的培养液吹起沉淀，加入到两个T75细胞培养瓶中 37°C 5% C02培养；
[0038]⑵细胞换液:
[0039]培养24小时之后的原代细胞要进行换液，先倒掉培养液，加入新鲜的含有质量百分数10% FBS的培养液，放37°C 5% 0)2培养箱继续培养；
[0040]⑶细胞传代:
[0041]将已培养5天的细胞，从培养箱中取出，将原来的培养液倒掉，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入质量百分数0.25%的胰酶3ml，消化细胞时间以细胞分裂为准，用PBS液将细胞吹散，放入离心机中1500rpm离心5min，去除残留的胰酶，用培养液吹起细胞，制成细胞悬液，吸取一管细胞悬液，放入另一个T75瓶中，就完成一次传代，放37°C 5%C02培养箱培养，此细胞为P1代细胞；
[0042]⑷细胞扩增:
[0043]取来培养6天的P1代细胞，按照步骤⑵的步骤进行，细胞分装入3-4个T75瓶中，即为P2代细胞，依次以相同的培养方式培养，至细胞传到P5和P6代，得再生修复细胞；
[0044](5)细胞收获:
[0045]将再生修复细胞收获；
[0046](6)细胞纯化:
[0047]先将细胞经过0.22um的筛网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm时间lOmin，纯化后准备分装；
[0048](7)细胞分装:
[0049]将纯化好的细胞按每2ml —个单位的体积加入到无菌的EP管中，封口贴签，即得治疗小脑萎缩的再生修复细胞。
[0050]而且，所述步骤⑶细胞传代的消化时间是2-3分钟，待等细胞开始分散就开始吹散。
[0051]本发明取得的优点和积极效果是:
[0052]本发明再生修复细胞的纯度高、杂质少，该产品能够通过改变人体内细胞的大环境，提高体内的细胞的质量，使失去活性的细胞获得新的生命，大大减小了该制剂对人体的副作用，大大提高了该制剂对小脑萎缩病人的疗效，制备方法简单，成本低廉。
【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0054]本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0055]实施例1
[0056]—种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法，步骤如下:
[0057]一、细胞制备:
[0058]选择良好的脐带:正常剖腹产新生儿脐带一根，放入含有庆大霉素的PBS溶液中备用Ο
[0059]剪切:先将脐带取出，用剪刀把脐带剪成几段，用PBS清洗，洗掉血污，反复洗2次，再用眼科剪把脐带切成1?2毫米大小的块，以便于消化。
[0060]消化:将已剪碎的组织块倒入一个干净的离心管中，其中加入I型胶原酶，胶原酶的体积没过组织块。将其置入37°C摇床中，消化100分钟。
[0061]离心:消化之后，将含有组织块的离心管放入离心机中，低速(500?1000转/分)
离心8分钟。离心之后倒掉上清。
[0062]培养:用含10% FBS的培养液吹起沉淀，加入到两个T75细胞培养瓶中37°C 5%C02培养。
[0063]二、细胞换液:
[0064]培养24小时之后的原代细胞要进行换液，先倒掉培养液，加入新鲜的含有10%FBS的培养液，放37°C 5% C02培养箱继续培养。
[0065]三、细胞传代:
[0066]将已培养5天的细胞，从培养箱中取出，将原来的培养液倒掉，加