遗传不育动物的制作方法

遗传不育动物的制作方法
【专利说明】
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年5月31日提交的美国临时申请号61/829,672和2013年8月27日 提交的美国临时申请号61 /870，558的优先权，其各自通过提述并入本文。
[0003] 政府支持声明
[0004] 本文所述工作的方面由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health) 的基金1R43RR033149-01 Al和USDA-美国国立粮食和农业研究所(National Institute of Food and Agriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号2012-33522-19766支持。 美国政府可以拥有这些发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本技术领域涉及创建经遗传修饰的动物，例如，具有配子发生基因敲除的家畜动 物。
[0006] 背景
[0007] 家畜通常通过有性繁殖创建并使用传统的放牧和饲养方法，或通过集约化的养殖 方法在农场养育到性成熟，其中后者对于猪越来越普遍。对于农场主来说有性繁殖是一种 有成本效益和有效率的过程。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含遗传修饰以破坏 选择性地参与配子发生的靶基因，其中所述靶基因的破坏阻止所述动物功能性配子的形 成。
[0010] 本发明的一个实施方案是制备家畜动物细胞的方法，包括向选自家畜细胞和家畜 胚胎的生物体引入试剂，所述试剂特异性结合细胞的染色体靶位点并导致双链DNA断裂来 破坏基因，来选择性破坏配子发生，其中所述试剂选自下组:靶向性核酸内切酶，RNA，重组 酶融合蛋白。
[0011] 本发明的一个实施方案是体外细胞，包含特异性结合所述细胞的染色体靶位点并 导致双链DNA断裂来破坏基因从而选择性破坏配子发生的试剂，所述试剂选自下组:靶向性 核酸内切酶和重组酶融合蛋白。
[0012 ]本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，包含对Y染色体的基因组修饰， 其中所述修饰包括插入，删除，或取代所述染色体的一个或多个碱基。
[0013] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含染色体上的外源 基因，所述基因在配子发生中选择性活化的基因表达元件的控制下。
[0014] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的动物，包括遗传不育的雄性家畜动物，其 产生功能性的供体精子而不产生功能性的天然精子。
[0015] 本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括染色体上的外源 基因，所述基因表达控制所述动物后代性别的因子，其中所述动物产生仅一种性别的后代。
[0016] 本发明的一个实施方案是畜群，包含复数个的所述动物。
[0017] 以下专利申请再次通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明 书为准：US 2010/0146655，US 2010/0105140，US 2011/0059160,和US 2011/0197290。
[0018] 附图简述
[0019] 图1是制造和使用遗传不育动物来传播供体基因的方法的图解。
[0020] 图2是通过在配子发生期间由Y染色体表达因子来控制性别和生育力的方法的图 解。
[0021] 图3A描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3'UTR的microRNA控制。
[0022]图3B描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3'UTR的microRNA和后期精 子发生启动子控制。
[0023]图4描述了修饰脊椎动物Y染色体的实验结果。
[0024]图5是实施例6和7的实验结果的图组，示出了CRIPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣 猪的P65S531P突变基因渗入到常规的猪中。组a)S531P错义突变；组b)对转染的长白猪 (Landrace)成纤维细胞的SURVEYOR试验；组c和d)示出了对第3天和第10天取样的细胞的 RELP分析。组a中顶部和底部的序列行为向导RNA(gRNA)(具有SEQ ID N0:1的P65_G1S和具 有SEQ ID N0:2的P65_G2A)。第二行为野生型(Wt)P65序列，SEQ ID N0:3。第三行为实验中 使用的HDR模板，SEQ ID NO:4。示出了左TALEN(SEQ ID NO:5)和右TALEN(SEQ ID NO:6)。
[0025] 图6是实验结果的图组，示出了TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR在猪APC的比较。 组a)描述了 APC 14.2TALENS和相对于野生型APC序列的gRNA序列APC 14.2Gla。下方，示出 了HDR寡聚物，其递送4bp插入(下划线文本)产生新的HindIII位点。组b)示出了展示RFLP和 SURVEYOR试验结果的图表。组a的顶行是APC 14.2TALENS序列，SEQ ID N0:7。第二行是野生 型APCS序列，SEQ ID N0:8。第三行示出了gRNA序列Gla，SEQ ID N0:9。底部序列是HDR模板， SEQ ID N0:10〇
[0026] 图7示出了使用TALENs和质粒同源性模板，基因靶向脊椎动物Y染色体两个位点 (AMELY和SRY)。使用同源臂外的基因座特异性引物和同源模板内的转基因特异性引物筛选 集落个体集落。所述同源模板的基因座和方向在它们对应的孔上指示而阳性对照指示为 ⑴。
[0027]图8表格示出了使用TALENs和质粒同源性基因盒的克隆中Y靶向的分析结果。
[0028]图9是泛素 EGFP对Y染色体中的3个位点的短同源性靶向。有和没有TALENs时，针对 SRY的3'接合处(junction)的引物也给出了非特异性条带模式。
[0029]图10柱状图示出了使用对AMELY和SRY位点特异性的TALENs和短同源模板处理的 细胞中EGFP标志物的表达。
[0030]图11是对表达EGFP标志物的克隆的接合分析。
[0031]图12是实验结果的图组，示出了具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪。组a)是 对分别从DAZL-和APC-修饰的长白猪和Ossabaw成纤维细胞衍生的克隆小猪的RFLP分析。组 b)是序列分析，确认在八个DAZL建立者(founder)中的三个以及六个APC建立者中的六个中 HDR等位基因的存在。供体模板(HDR)中的阻断突变(意图抑制HDR等位基因的再切割)标在 方框中，而插入的碱基圈出。顶部WT序列中加粗的字体指示TALEN结合位点。组c)提供了 DAZL(左）和APC(右）建立者动物的照片。有14行比对序列，其中每一行分别为编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24的独立序列。
[0032]图13是图像的显微照片图组，示出了缺乏精子发生并没有精子细胞的DAZL敲除 (KO)猪。组a是来自睾丸内部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，其示出了精原细胞的完全不存 在。组b是来自睾丸外部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，也示出了精原细胞的完全不存在。 组c使用了泛素羧基末端水解酶LI(UCH-LI)，一种存在于野生型猪睾丸中的精原细胞标志 物。组d中，UCH-LI不存在于DAZL KO睾丸中，指示精原细胞的不存在。组e中，乙酰化的a-微 管蛋白存在于野生型猪睾丸的曲细精管中，指示精原细胞的存在。组f中，DAZL KO猪的曲细 精管是乙酰化a-微管蛋白阴性的，证明了这些动物中精子细胞的缺乏。
[0033] 发明详述
[0034] 本文列出了实施方案以制造和使用遗传不育动物，或能够产生仅一种性别的后代 的动物。如本文所列出的遗传不育动物以及用于创造它们的简易技术的可用性提供了产生 经遗传修饰的动物和常规家畜的新方法和新的机会。一些实施方案涉及将供体组织置于遗 传不育的受体雄性中，使得所述受体雄性产生供体精子，并可以用做种畜（stud)来制造所 述供体动物的后代。这一技术允许使用有性繁殖来传播所需的遗传性状，包括遗传工程化 性状。
[0035] 其它的实施方案用于保护有价值的性状:例如，繁殖和/或遗传修饰以具有一种或 多种所需性状的动物也可以经修饰使其不育，或具有仅一种性别的后代，从而确保这些有 价值的性状将不会被滥用或脱离遏制。
[0036]常规的动物生产和遗传修饰的动物生产方法强调生育力（fertility)和存活性 (viability)。家畜繁殖效率低下对于家畜生产具有重大的负面影响。尽管越来越多的技术 可以用于增加繁殖成功，生殖周期中的损失是常见的。复杂的技术，包括克隆，是已知的，但 比有性繁殖的效率低得多，并不适合家畜的大规模生产。在具有很高价值的遗传学的动物 中，有时使用人工受精或胚胎转移来最大化它的基因向后代传递。克隆技术，例如体细胞核 转移或染色质转移具有低的效率，其不能与有性繁殖相比，并不适合用于经遗传修饰的动 物的常规生产。使用胚胎干细胞的克隆（其被称为核移植来源的胚胎干细胞(NTESC))目前 不可能用于家畜，因为至今家畜胚胎干细胞的衍生不成功。
[0037]使用遗传工程化来创造经遗传修饰的家畜将加速创造具有所需性状的家畜。传统 的家畜繁殖是一个昂贵并费时的过程，其涉及对遗传性状的谨慎选择和对世代繁殖的漫长 等待。即使谨慎选择性状，有性繁殖的变异对培养和传代所需的性状组合提出了相当大的 挑战。
[0038]本文提出了用于动物繁殖的实施方案，其允许所需遗传性状的快速传播，以及用 于对所述性状的专用控制和遏制的保护。实施方案包括生产遗传和基因组不育动物，其可 以作为提供的遗传材料的宿主。所述宿主的性交将导致供体遗传材料的复制。可以使用一 群遗传不育动物来通过有性繁殖广泛传播来自单个供体的相同种质，使得可以快速生成许 多供体后代。实施方案包括经修饰产生仅一种性别的动物的供体，使得接收所述动物的使 用者将不能滥用具有所述性状的动物，或失去对它们的遏制。
[0039]基因组不育的动物是一贯不育的，表示其遗传上不能产生后代。术语不育，在本文 的语境中，表示不能使用有性繁殖来产生具有其遗传组成的后代。因此产生供体动物后代 的动物称作不育，虽然它活跃地产生另一个动物的功能性配子。在一些情况下，所述不育动 物产生它自己的配子，可以将其移出并用于人工繁殖过程;例如，可以通过胞浆内精子注射 (ICSI)繁殖制造不能游动的精子的宿主动物，或者可以通过克隆繁殖宿主动物。功能性配 子是对于成功的有性生殖有用的配子。可以制备基因组不育动物，其进行供体配子发生细 胞的配子发生。术语配子发生表示产生单倍体性细胞(卵子和精子），其各自携带来自每个 亲本生殖系的一半遗传补充。精子的产生是精子发生(spermatogenesis)。受精期间精子和 卵子的融合产生具有二倍体基因组的合子细胞。术语配子发生细胞指代卵子或精子的祖细 胞，通常是生殖细胞，卵原细胞，或精原细胞。
[0040] 本发明的实施方案包括基因组不育动物，其具有对染色体的遗传修饰，所述修饰 阻止该动物中的配子发生或精子发生。所述染色体可以是X染色体，Y染色体，或常染色体。 所述修饰可以包括对存在的基因的破坏。可以通过改变存在的染色体基因使得其不能表 达，或通过遗传地表达将抑制基因的转录或翻译的因子，来创建所述破坏。一些用于制造遗 传不育动物的技术也可以应用于制造产生仅雄性或雌性后代的动物，对半传递他们的遗传 材料或供体的遗传材料。
[0041] 遗传不育动物的实施方案包括对编码选择性参与配子发生的因子的基因的基因 组破坏，其中当对于所述破坏为半合或纯合示于图1中时，所述动物不育。术语破坏和失活 在本文中可替换使用。对细胞或胚胎制造遗传修饰来使对于精子活性选择性的基因失活。 一种遗传修饰的过程涉及引入TALEN对的mRNA，所述TALEN对特异性结合并打断基因。从所 述细胞将动物克隆成胚胎，或经修饰的胚胎直接在代孕母亲中养育。所述动物可以是家畜 动物或其它动物。被破坏的精子活性对于生育力是必不可少的，但对于所述动物其他方面 不是必要的。因此所述动物是不育的，因为它不能有性生殖，然而，可以使用ARTs来从修饰 的精子创建后代。选择具有所需遗传性状的供体动物(作为繁殖和/或遗传工程化的结果）。 该图示出了双肌型的比利时(Belgian Blue)蓝牛供体。从所述供体取出精原细胞和/或精 原组织并移植到受体不育动物中。在曲细精管处的移植允许供体细胞和组织复制以制造功 會泛性精子（Brinster 和 Avarbock，Spemiatogenes i s following male germ-cel I transplantation.PNAS, 1994,91:11298-11302)。因此，所述遗传不育动物被制成用于传播 供体的遗传材料的工具，且所述动物与复数个雌性交配提供了所需遗传性状的快速传播。
[0042] 经遗传修饰的家畜动物的实施方案示于图2中，其中所述动物包括包含染色体的 细胞，所述染色体包含在配子发生中选择性活化的启动子控制下的外源基因。如图1所解释 的，通过对细胞或胚胎的遗传修饰创建动物。在该图的实施方案中，所述染色体是Y染色体。 由外源基因表达的因子在对于配子发生，或精子发生的阶段选择性的启动子的控制下。所 述因子可以破坏靶基因，例如对于雌性动物的发育必要但对于雌性动物的发育不必要(或 反之亦然）的基因。或者，可以将所述基因置于启动子的转录控制下，所述启动子在配子发 生或精子发生中选择性活化，其中所述因子对于细胞是破坏性或致命的，从而仅阻止雄性 配子的发育，或将其破坏，借此仅产生雌性后代，或反之亦然。所述启动子可以在对于配子 发生，精子发生，或卵子发生特异的细胞内或组织中活化，例如选自下组的组织：睾丸，曲细 精管，或附睾，或在卵子发生的情况下为卵巢，卵泡，卵母细胞，颗粒细胞，或黄体。雌性配子 发生的启动子包括，例如，如1??，0(^4,8111?15,6(^9 = ?6〇8，卵生蛋白1和卵生蛋白2。
[0043]图3A和3B描述了对以上的进一步修饰，其中外源因子也在置于3'UTR中的 microRNA结合序列的控制下，使得所述因子在表达所述microRNA的组织中不翻译，但在不 表达所述microRNA的组织中，例如选自下组的组织中所述因子将被翻译：睾丸，曲细精管， 或附睾。该方法可以使用普遍存在的或组织特异性启动子。在第二个实施方案中，3 ' UTR将 包括靶向对于精子或配子发育必要的基因的microRNA序列。一个实施方案是经遗传修饰的 家畜动物，所述动物包括包含染色体的细胞，所述染色体包含外源基因表达元件，其表达为 mRNA时可以作为配体结合的靶标，所述配体减弱转录，降解/稳定mRNA，使mRNA局限于某处， 或可以抑制或活化翻译。配体可以包括RNA结合蛋白（其也含有或不含有蛋白结合结构域） 例如RNA结合蛋白数据库(RBPDB)中的那些，包括但不限于含有以下项的蛋白：核酸识别结 构域，RNA识别基序(RRM)，K-同源性结构域(KH结构域），锌指结构域，TALE样重复，PumiIio 和FBF同源性(PUF)重复，或三角状五肽(pentatricopeptide)重复（PPR)蛋白。配体还可以 包括调控RNA，例如转运RNA，反义RNA，CRISPR RNA，长非编码RNA，Mi croRNA，Piwi-相互作用 RNA，小干扰RNA，反式作用s i RNA，重复相关的s iRNA。所述靶标或调控配体的表达可以在配 子发生，卵子发生，或精子发生中选择性地活化或抑制。
[0044] 用于修饰的基因
[0045] 在一个家畜物种中的基因在其它家畜物种以及人和小鼠中一致地具有直系同源 物。人和小鼠基因一致地在家畜中具有直系同源物，特别是在牛，猪，绵羊，山羊，鸡和兔中。 依赖于所述基因的功能，这些物种和鱼之间的基因直系同源物通常是一致的。生物学家熟 悉这些用于寻找基因直系同源物的方法，因此基因在本文中可以根据一个物种描述而不列 出直系同源物。因此，描述对基因破坏的实施方案包括对其它物种中具有相同或不同名称 的直系同源物的破坏。存在综合的基因数据库以及那些专门为鉴定基因直系同源物的数据 库。用于破坏的基因包括对于配子发生，特别是精子发生选择性的基因。用于使精子发生失 能而不破坏精子的配子的基序将干扰精子的运动性，顶体融合，或融合生殖（syngamy)。靶 基因可以包括选自下组的那些：TENR,ADAMla,ADAM2,ADAM,alpha4，ATP2B4基因，CatSperl, CatSper2，CatSper3，Catsper4，CatSperbeta，CatSpergamma，CatSperdelta，KCNUl，DNAH8， Clamegin，Complexin-I，塞尔托利氏细胞雄激素受体，Gasz，Ral75，Cibl，Cnot7，Zmyndl5， CKs2，PIWIL4，PIWIL2jPSmcp。
[0046] 可以破坏以干扰精子运动型的基因的实施方案是TENR(Connolly CM;Dearth AT; Braun RE Disruption of murine Tenr results in teratospermia and male infertility,Dev.BioI.,2005,278(1):13-21)；ADAMla(Nishinmra H；Kim E；Nakanishi T；Baba T Possible function of the ADAMla/ADAM2FertiI in complex in the appearance of ADAM3on the sperm surface .,J. Biol.Chem.,2004,279(33):34957-34962);和ADAMS(Shamsadin R;Adham IM;Nayernia K;Heinlein UA;0berwinkler H; Engel W Male mice deficient for germ-celI cyritestin are infertile， J.Biol .Reprod.，1999,61(6): 1445-1451) Dalpha4(Atpla4，ATPase，Na+/K+转运，alpha4多 肽）的敲除使得动物完全不育并导致精子运动性的严重降低（Jimenez T;MCDenn〇tt JP; Sanchez G ； Blanco G Na,K-ATPase alpha4isoform is essential for sperm fertility，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2011，108(2) :644-649)。具有在精子尾部高度富集 的质膜钙/钙调蛋白依赖性钙ATPase的同等型4(PMCA4,由ATP2B4基因编码）的靶基因删除 的雄性小鼠由于严重受损的精子运动性而不育aSchuh K;Cartwright EJ; Jankevics E; Bundschu K；Liebermann J；ffiIliams JC；Armesilla AL；Emerson M；Oceandy D； Knobeloch KP；Neyses L Plasma membrane Ca2+ATPase 4is required for sperm motility and male fertility,J.Biol.Chem.,2004,279(27):28220-28226)〇 [0047]可以破坏以干扰精子顶体融合和/或精子获能(capacitation)的基因的实施方案 为：ADAM2或ADAM3，（Nishimura H;Cho C;Branciforte DR.;Myles DG;Primakoff P Analysis of loss of adhesive function in sperm lacking cyritestin or fertilin beta，Dev · Biol ·，2001，233( I): 204-213) 的敲除（上文引用的）也导致来自这些小 鼠的精子不能在体外使卵子受精。可以选择性地破坏CatSper家族的基因以创建不能通过 有性繁殖创造后代的雄性动物。CATSPER家族基因提供跨膜钙通道蛋白，其包埋于精子细胞 的膜中。钙阳离子是超活化(hyperactivation)所需的，其对于受精期间精子穿过卵细胞的 膜是必要的。可以破坏由CatSper基因或由Catsper编码的通道亚基来创建不育雄性。破坏 CatSper2的雄性完全不育且它们的精子不能穿透卵子(Quill TA; Sugden SA;Rossi KL; Doolittle LK；Hammer RE；Garbers DL Hyperactivated sperm motility driven by CatSper2is required for fertilization,Proc.Natl.Ac