一种提高转染效率的表达载体pEGFP-N1-p53/MAR、构建方法及转染方法
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种提高转染效率的表达载体pEGFP-Nl-p53/MAR，同时还涉及表达载 体pEGFP-Nl-p53/MAR的构建方法及转染方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 癌症是人类公认的最致命的杀手之一。根据国际癌症研究中心（IARC)报告，癌症 发病人数以年均3%~5%的速度递增，发病及死亡人数与10年前相比分别增长了 24.7%和 19.2%，预计到2020年全球将有2000万新发病例，死亡病例将达1200万例。但目前癌症的治 疗仍然是世界性难题，单一地手术治疗容易造成病灶的转移，而放化疗带给患者巨大痛苦 的同时会抑制骨髓功能，引起全血细胞减少，其中红细胞减少会引起贫血，白细胞减少会造 成感染，血小板减少会引起出血，这其中任何一项发生都可能危及生命。
[0003] P53是一种肿瘤抑制基因，基因全长约16_20kb，定位于人的17号染色体短臂1区 3.1带（17pl3.1)，片段共含有11个外显子和10个内含子。p53开始是作为一种癌基因出现， 但是最新资料表明，P53其实是一种抑癌基因。它不仅仅具有肿瘤抑制功能，能抑制细胞周 期和诱导细胞凋亡和衰老，而且还可以调节体内干细胞(SC)的动态平衡。尤其是，p53可以 抑制SC的自我更新能力，使SCs进行不对称分裂以及体细胞和原代细胞的程序重排。由于不 断的自我更新、对称分裂以及程序重排使得肿瘤干细胞CSCs不断扩张，从而发挥p53的抑癌 作用。
[0004] 核基质附着区(matrix attachment regions，MARs)是真核生物(从酵母到人的所 有真核生物)染色质中能够与核基质特异结合的一段DNA序列，通过与核基质的结合，锚定 在核骨架网状结构上，使染色质形成独立的环状结构，避免位置效应引起的基因沉默，调控 基因的转录和表达。MAR和染色体结合后，形成了一个结构区的边界，把转入基因的DNA以环 隔开，每一个环都是一个单独的转录单元，所以，MAR序列在转基因时可以使外源基因的稳 定性和独立性增加，使转入的外源基因的表达正常化，因此MAR在提高转基因的表达水平、 消除个体间表达差异、抑制转入的外源基因沉默等方面起着重要的作用。
[0005]鸡作为生物反应器，具有以下优点：第一:从鸡自身来讲，其输卵管本身是一个自 我封闭的系统，蛋黄中的蛋白质和脂肪在肝脏合成后，由血液直接送入输卵管，而输卵管的 漏斗部和膨大部具有丰富的腺体组织，尤其是膨大部，能够分泌大量的蛋白，这样的特殊结 构使输卵管内的蛋白和蛋黄不会回流到血液中，可以避免其他的外源性蛋白对鸡的机体造 成危害，因此鸡本身这个系统具有很高的安全性;第二:鸡的输卵管是有效的蛋白合成器， 其对新生蛋白的糖基化修饰接近人类;第三:卵清蛋白的启动子能够诱导很多人类珍稀蛋 白的表达，并能够对它们进行正确的修饰和加工，加工后的产物其生物活性接近天然产品； 第四，鸡输卵管内表达的外源蛋白能够稳定遗传;第五:就鸡蛋本身来讲，蛋清中的蛋白成 分是比较稳定的，而且成分比较简单，因此外源基因转入后，在鸡蛋中也能够稳定的存在较 长的时间产物易于分离，另外鸡的饲养成本相对其他动物来讲较低，费用消耗比较少;第 六:鸡的世代间隔比较短，从出生到性成熟大约只需六个月的时间，因此鸡作为转基因研究 的对象具有无法取代的优势。但是由于家禽生理发育的特殊性，鸡的转基因研究进展一直 较为缓慢。这是由于很多外源的基因在转入鸡时，出现了在一代或者几代后会不再表达或 者表达变弱的现象。这种也就很大程度上让转基因出现基因沉默的现象。转基因沉默将严 重阻碍转基因的商品化的进程，因此，解决转基因的沉默，提高外源基因的表达效率及其在 后代的稳定性是转基因过程中一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种提高转染效率的表达载体PEGFP-N1-P53/ MAR，表达载体pEGFP-Nl-p53/MAR的构建方法及转染方法，采用本发明的方法能够提高转基 因鸡的孵化率，并在成活的转基因鸡中检测到P53条带。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种提高转染效率的表达载体 pEGFP-Nl-p53/MAR，将人抑癌基因 p53和鸡的核基质附着区MAR基因插入表达载体中构建而 成。
[0008] 所述的提高转染效率的表达载体PEGFP-N1-P53/MAR，包括如SEQ ID N0.1所示的 核苷酸序列。
[0009] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种提高转染效率的表达载体pEGFP-Nl-P53/MAR的构建方法，包括以下步骤：
[0010] (1)抽取癌症病人的外周血液，提取外周血液总RNA，设计上下游引物Primer a、 Primer b，RT-PCR扩增人抑癌基因 p53，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；
[0011] RT-PCR反应体系为：2XPCR Buffer 22yL，上下游引物各 1.5yL，RT/Taq Master Mix 2yL，总RNA模板3yL; RT-PCR反应条件为：① cDNA合成和预变性：40°C、30min，94°C、 2min;②PCR扩增共40个循环:94°C预变性30s、前5个循环65°C退火30s，后35个循环68°C退 火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin，反应结束；
[0012] ⑵将质粒PMD18-T与人抑癌基因 p5316°C连接过夜，得到连接产物pMD18-T-p53; 将连接产物pMD18-T-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primer a、Primer b，挑取 单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pMD18-T-p53，再进行酶切鉴定和测序 鉴定，鉴定正确的为重组质粒pMD18-T-p53;
[0013] 所述连接的反应体系为:人抑癌基因 p538yL、质粒PMD18-T 2yL、solution〗 10yL; [0014] (3)提取鸡肝脏组织中的DNA，设计上下游引物Primer c、Primer d，PCR扩增鸡MAR 基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；
[0015] 所述PCR的反应体系为：10 XPCR Buffer 3yL、dNTP Mixture 2yL、总DNA模板 1·5μ L、上下游引物各lyL、TaqDNA聚合酶0.5yL，加灭菌去离子水补充至总体积20yL;
[0016] 所述PCR的反应条件为:①预变性:94°C、4min;②PCR扩增共40个循环，前5个循环： 94°C预变性30s、54°C退火40s、72°C延伸90s;中间五个:94°C预变性30s、56°C退火40s、72°C 延伸90s;最后30个循环：94°C预变性30s、60°C退火40s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸 lOmin，反应结束；
[0017] (4)将重组质粒PMD18-T-P53和载体pEGFP-Nl分别用Hindm和BamHI限制性内切酶 双酶切，纯化回收人抑癌基因 P53和载体pEGFP-Nl酶切产物，20°C连接5h，得到连接产物 pEGEP-Nl-p53;将连接产物pEGEP-Nl-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primer a、Primer b，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pEGEP-Nl-p53,再进 行酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pEGEP-Nl-p53;
[0018] 所述双酶切的反应体系为:重组质粒pMD18-T-p53或载体pEGFP-N120μL、BufferK 5yL、灭菌去离子水 51yL、Hindin 和 BamHI 各 2yL; 30°C 酶切 4h;
[0019] 所述连接的反应体系为:人抑癌基因 p535yL、载体pEGFP-Nl酶切产物lyL、T4连接 酶1以1^、10\140嫩1^〖&86 1311打612.5以1^，补加灭菌去离子水至总体积为2(^1^;
[0020] (5)将重组质粒PEGEP-N1-P53与MAR基因分别Xbal和Notl限制性内切酶双酶切，纯 化回收后25°C连接3h，得到连接产物pEGEP-Nl-p53/MAR;将连接产物pEGEP-Nl-p53/MAR转 化感受态细胞，培养，根据引物Primer a、Primer b、Primer c、Primer d，挑取单菌落进行 PCR检测人抑癌基因 p53和MAR基因，筛选出阳性菌落，提取连接产物pEGEP-Nl-p53/MAR，进 行酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序，酶切检测及测序正确的即为表达 载体 pEGFP-Nl-p53/MAR;
[0021 ] 双酶切的反应体系为：重组质粒pEGEP-Nl-p533μL、Buffer01μL、灭菌去离子水13μ L、Xba I 和 No 11 各 1 · 5yL; 30°C 反应 4h;
[0022] 所述连接的体系为:MAR基因3yL、重组质粒pEGEP-Nl-p532yL、T4连接酶0.5yL、10 XT4DNALigase Buffer 3yL;加灭菌去离子水至总体积20yL。
[0023] 所述上下游引物Primer a、Primerb为：
[0024] Primer a:5，-CCCA AGCT TATG GAGG AGCC GCAG TC-3，
[0025] Primer b:5，-CGCG GATC CCAG TCTG AATC AGGC CCT-3,〇
[0026] 所述上下游引物Primer c、Primer d为：
[0027] Primer c:5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'
[0028] Primer d:5，-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3，〇
[0029] 步骤（2)、（4)、（5)中的 PCR 检测的反应体系为：10XPCR Buffer 3yL、dNTP Mixture 2yL、菌落菌液1.5yL、上下游引物各lyL、TaqDNA聚合酶0.5yL，加灭菌去离子水补 充至总体积20yL。
[0030] 步骤（2)、（4)和（5)中人抑癌基因 p53的PCR检测的反应条件为：①94°C预变性 5min;②PCR扩增共40个循环:94°C预变性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸 10min〇
[0031 ] 步骤(5)中MAR基因 PCR检测的反应条件为:①94°C预变性5min;②PCR扩增共40个 循环:94°C预变性30s、54°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin。
[0032] 步骤(2)、（5)中的酶切鉴定的反应体系为：连接产物6yL、10XBuffer K3yL、灭菌 去离子水 8yL、Hindin 和 BamHI 各1.5yL，30°C 反应 4h。
[0033] 步骤(4)中的酶切鉴定的反应体系为:连接产物8yL、10XBuffer K 5yL、灭菌去离 子水 15yL、HindIII2yL，30°CiS4h。
[0034] 步骤(5)中酶切后的重组质粒pEGEP-Nl-p53与MAR基因的纯化回收方法为：
[0035] (1)取15yL重组质粒pEGFP-Nl-p53的溶液，加入3yL4mol/L的NaAc和55yL无水乙醇 分析纯沉淀DNA;
[0036] 取MAR基因的PCR产物30yL，加入6yL4mol/L的NaAc和110yL的无水乙醇分析纯沉淀 DNA；
[0037] (2) lOOOOr/min离心5min，弃上清，在重组质粒pEGFP_Nl_p53和MAR基因中分别加 入lOOyL和150yL质量分数75%的乙醇冲洗一次；
[0038] (3)重复步骤(2)-次；
[0039] (4) 10000r/min 离心 5min，弃上清，室温下干燥 5-lOmin;
[0040] (5)向重组质粒pEGFP-Nl-p53和MAR基因的离心管中分别加入10yL和20yL的灭菌 去离子水溶解DNA，所得溶液即为重组质粒pEGFP-Nl-p53和MAR基因的DNA溶液。
[0041 ]本发明所采用的技术方案还在于提供一种提高转染效率的表达载体PEGFP-N1-P53/MAR的转染方法，包括以下步骤：
[0042] (1)孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理
[0043]对孵化器进行消毒，种蛋进行预孵化处理，放入孵化箱内开始孵化；l-18d的孵化 温度为37.8°C，湿度为60%，19-21d的孵化温度为37°C，湿度为78% ;
[0044] (2)种蛋的开口
[0045]开口前将蛋壳开口器和无菌操作台进行消毒，将孵化12_24h的种蛋从孵化箱内取 出，在种蛋的赤道位置先用碘酊后用75%酒精擦拭消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一边 研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况；
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