CRISPER-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，设及CRISPER-化s9系统 介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法。
【背景技术】
[0002] CRISPR-Cas9基因编辑系统是由规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palin化omic repeats,CRISPR)W及CRISPR相关蛋白9 (CRISPR-associated protein 9，Cas9)组成，是继锋指核酸酶（znic finger nuclease， ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广 泛应用。CRISPR-Cas9通过小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)识别祀序列并引导Cas9蛋 白对祀位点进行切割，使DNA发生双链断裂化NA double-strand break，DSB)，断裂的DNA为 防止被降解会自动启动内源性修复机制，而内源修复机制通常有两种，在非同源末端连接 (Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制下修复时并不是非常精确，在断裂缺口处 往往随机的插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区（codingsequence，CDS)，将转录 错误mRNA，而导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除；而在同源重组化omologons recombination,皿)修复机制W及修复模板存在的条件下，也可W实现定点的单个碱基或 者长片段的插入、删除或者突变，形成基因的敲入与敲除。
[0003] 肌细胞生长抑制素(MSTN，Myostatin)是一类重要的肌细胞生长负调控因子，它通 过抑制MRFs家族成员转录活性负向控制肌细胞的生长发育，MSTN功能缺失后会刺激肌细胞 数量增加而出现"双肌现象"。因此人们通常采用突变、缺失、敲除等基因打祀技术对家畜 MSTN基因进行修饰，然后借助胚胎工程手段获得产肉性能高的转基因家畜。
[0004] Fat-1基因来源于秀丽线虫（Caenorhabditis elegans)四号染色体上，该基因编 码 ω -3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs)脱氨酶，可 W将PUFAs从 ω -6转化为ω -3形式，ω -3对维持机体的正常发育和生长至关重要，但人体内缺乏从ω -6 转化为ω-3形式的脱氨酶基因，所W每天必须摄入一定的ω-3。人们通过转基因的方法在 山羊细胞表达hfat-1基因，培育富含不饱和脂肪酸的高品质保健羊肉，使肉品质得到改善， 从而提高人们ω -3PUFAS日常摄入量。
[0005] 利用CRIS阳R-化s9系统敲除羊MSTN基因，同时在排ΝΑ识别位点定点整合hfat-1基 因的研究未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供CRISPER-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源 基因的方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供的CRISPER-化s9系统介导的羊MSTN基因敲除和 定点整合外源基因的方法，其是根据羊的MSTN基因序列（Gene ID 100860887)，构建基于 CRISPER-化s9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可W整合 至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRIS阳R-Cas9载体、上述构建的排NA表达载体 和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基 因的细胞。
[000引本发明中述及的羊包括但不限于阿尔己斯绒山羊。
[0009]本发明中述及的外源基因包括脂肪酸去饱和酶化t-1基因，或fat-1基因经过人源 化修饰后的基因 hfat-1等。
[0010 ] 前述的方法，gRNA作用位点位于羊MSTN基因的巧外显子上。排NA作用位点的DNA 序列为5' -CGATGACTACCACGTTACGA-3'或5' -CGTTACGACGGAAACGGTCA-3'。优选地，gRNA作用 位点的DNA序列为5^ -CGTTACGACGGAAACGGTCA-3/。
[0011]前述的方法，所述供体质粒中含有如下顺次连接的表达元件:根据gRNA作用位点 设计的羊MSTN基因5'同源臂一CAG启动子一脂肪酸去饱和酶化t-1基因或化t-1基因经过人 源化修饰后的基因一ployA-根据gRNA作用位点设计的羊MSTN基因3'同源臂。其中，根据 曲NA作用位点设计的羊MSTN基因5'同源臂和3'同源臂大小约1.0化。
[001 ^ 前述的方法，所述优化的CRI SPER-Cas 9载体（即hCa S 9质粒）的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示化化s9质粒图谱见图1);所述排NA表达载体的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所 示;所述供体质粒的核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0013] 本发明还提供根据上述方法获得的羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。
[0014] 本发明进一步提供上述方法在生产羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆 羊中的应用。该应用是指将所述羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体 细胞，离体的羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得羊克隆胚胎，然后将克隆 胚胎通过非手术法移入羊子宫内进行妊娠，获得转基因羊。
[0015] 本发明的目的还可W采用W下的技术措施来进一步实现。
[0016] 1)CRIS阳R-Cas9载体的优化；2)根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPER-Cas9 系统的排ΝΑ表达载体;3)根据排ΝΑ作用位点构建含有外源基因 fat-1 at-1)的且可W整 合至宿主基因组中的供体质粒;4)将上述优化的CRIS阳R-化s9载体、gRNA表达载体和线性 化的供体质粒共同转染到阿尔己斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，通过口吸管法和流式细胞仪 筛选单克隆细胞系；5)通过PCR技术鉴定筛选单克隆细胞系，获得敲除MSTN基因同时在MSTN 基因组断裂位置定点整合化t-1 Afat-l)基因的单克隆细胞系。
[0017] 其中，步骤4)中利用口吸管法挑取单克隆细胞系是指用玻璃管拉制成保证可W使 单个细胞通过的合适直径口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种于预先平衡后 含有细胞培养液的96孔细胞培养板中，进行细胞培养。待细胞生长呈簇后，分别用0.25%膜 酶消化，将细胞集落转移至24孔细胞培养板中继续扩大培养。待细胞继续生长需要再次传 代时，将细胞编号后一半细胞冻存，一半细胞用于基因组DNA的提取。
[0018] 步骤4)中利用流式细胞仪筛选单克隆细胞系是指当细胞转染24h后，用膜蛋白酶 消化细胞并将细胞重悬于PBS中，使用流式细胞仪将细胞筛选成单个细胞接种于96孔板。 7化后换培养液一次;第7天对形成单细胞克隆群的孔进行换液操作;在第10天时，在显微镜 下观察，将汇合度较高的细胞克隆传代至24孔板中继续扩大培养。
[0019] 步骤5)中鉴定敲除MSTN基因同时定点整合化t-1基因的单克隆细胞系主要采用设 计跨上游同源臂的PCR引物的方法，通过PCR技术扩增出包含基因组部分序列、上游同源臂 全部序列、CAG启动子部分序列的产物，目的是确定外源基因整合到MSTN基因组断裂处。
[0020] 本发明共成功获得156株单克隆细胞，鉴定MSTN基因敲除细胞系55株，其中通过同 源重组修复的单克隆细胞系有40株，通过非同源重组修复的细胞有15株，即发生同源重组 同时又发生非同源重组修复的单克隆细胞有4株。
[0021] 本发明具有W下优点：
[0022] (一) CRISPR-化s9基因编辑技术与常规的同源重组技术、TALEN技术和ZF化技术相 比，基因敲除效率显著提高。
[0023] (二)与传统的同源重组技术TALEN技术和ZF化技术相比，由CRISPR-Cas9介导的同 源重组使外源基因的整合效率显著提高。
[0024] (Ξ)由CRISPR-化s9介导的同源重组的同源臂（约1. Okb)与传统同源重组使用的 同源臂(约3.0-4.0化)相比长度大大减少，更加有利于后续检测工作的进行。
[0025] (四）通过CRISPR-Cas9系统的介导，实现了不加任何筛选标记即可筛选出MSTN基 因敲除且定点整合外源基因的转基因细胞系，运是传统同源重组技术、TALEN技术和ZF化技 术无法实现的，很大程度提高了转基因动物的安全性。
[00%](五)通过体细胞核移植技术制备MSTN基因敲除且定点整合外源基因 hfat-1的转 基因羊(例如转基因阿尔己斯绒山羊），为构建成熟的基因修饰动物研究和生产奠定基础。
【附图说明】
[0027] 图巧本发明实施例1中hCas9质粒图谱。
[0028] 图2为本发明实施例3中利用Surveyor突变检测试剂盒检测祀位点的电泳结果;其 中，Μ: 1 OObp marker; 1:排NA1 (666bp); 2 :酶切后的排NA1; 3:排NA2 (66化P); 4:酶切后的 gRNA2;5:阳性对照。
[00巧]图3为本发明实施例3中5'h-pCAGDNA3-hFat-1-3'h质粒酶切图；其中，Μ分别为 lOObp marker和Ikb marker; 1 :NdeI单酶切；2 :MluI和xholl双酶切；3 :EcoRI单酶切；4:质 粒。
[0030] 图4为本发明实施例4中供体质粒hfat-1的构建流程示意图。
[0031] 图5为本发明实施例6中MSTN基因敲除检测图；其中，M:DL1000bp;l-9为目的条带， 大小为66化P。
[0032] 图6为本发明实施例6中MSTN基