随时间检测疾病中的突变的制作方法
【专利说明】随时间检测疾病中的突变
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年10月19日提交的美国临时申请号61/893，216、2014年4月8日 提交的美国临时申请号61/977，085、2014年4月9日提交的美国临时申请号61/977,609和 2014年8月21日提交的美国临时申请号62,040,363的权益，其全部被W引用的方式全文并 入本文。
[0003] 发明背景 (1)发明领域
[0004] 大体上，本发明设及癌症突变。更具体地，本发明提供了用于随时间监测癌症突变 的方法，其可用于评价治疗选择。
[00化](2)相关技术的描述
[0006] 癌性组织中的核酸、循环细胞和存在于体液中的无细胞(Cf)核酸可辅助鉴定和选 择患有与此类遗传改变相关的癌症或其他疾病的个体。参见，例如，Spindler等人，2012; Benesova 等人，2013; Dawson 等人，2013; !^rshew等人，2012;化aw等人，2012。一些数据表 明，血液中突变DNA的量与肿瘤负荷相关联并可用于鉴定抗性突变的出现(Forshew等人， 2012 ;Murtaza 等人，2013 ;Dawson 等人，2013 ;Diaz 等人，2012 ;Misale 等人，2012 ;Diehl 等 人,2008)。但是，尚不知道对血液或尿液中的CfDNA的定量或半定量测量是否足够准确地反 映肿瘤负荷W在做治疗决策时利用。
[0007] 对通过随时间监测肿瘤负荷确定治疗的有效性的另外的非侵入性方法存在需求。 本发明解决了该需求。
[000引发明简述
[0009] 本发明部分地基于W下发现:在治疗的过程中，可W通过在不同时间点测量尿液 或血液中的Cf DNA来监测癌症治疗。
[0010] 因此，在一些实施方案中，提供了用于随时间监测患者中与癌症相关的基因突变 的方法。所述方法包括：
[0011] (a)从患者获得体液的样品；
[0012] (b)定量或半定量地确定样品中的无细胞DNA( CfDNA)中的突变的量;和
[OOK] (C化较后的时间重复(a)和(b)。
[0014]还提供了为受试者选择和/或应用治疗或疗法的方法。所述方法包括通过W上方 法监测基因突变，W及基于检测选择和/或应用治疗或疗法。
[001引附图简述
[0016] 图1示出了针对祀基因序列中的28-3化P足迹的示例性两步测定设计。
[0017] 图2是显示用于BRAF V600E突变的鉴定的阳性对照和阴性对照的实验结果的图。
[0018] 图3是显示治疗前、治疗期间和治疗后对转移性黑素瘤患者的BRAF V600E监测的 结果的图。未观察到明显的疾病复发。
[0019] 图4是显示治疗前、治疗期间和治疗后对转移性结肠直肠癌患者的BRAF V600E监 测的结果的图。观察到疾病的复发。
[0020] 图5是显示治疗前和治疗期间对患有阔尾癌患者的BRAF V600E监测的结果的图。
[0021] 图6是显示治疗期间对转移性非小细胞肺癌患者的BRAF V600E监测的结果的图。 观察到对该疗法的抗性。
[0022] 图7是显示对未受治疗的转移性非小细胞肺癌患者的BRAF V600E监测的结果的 图。观察到疾病进展。
[0023] 图8是显示在晚期结肠直肠癌患者的尿液、血浆和组织样品之间KRAS状态的高度 一致性的实验结果的示意图。
[0024] 图9是显示监测与对转移性癌症患者的治疗或疗法的响应有关的包含BRAF V600E 突变的CfDNA的实验结果的示意图。CtDNA表示存在于CfDNA中的"循环肿瘤DNA"。
[00剧发明详述
[0026] 如本文使用的，单数形式"一 (a)"、"一 (an)"和"该(the)"意欲也包括复数形式，除 非上下文另有明确说明。另外，"或"的使用意欲包括"和/或"，除非上下文另有明确说明。
[0027] 如本文使用的，术语"样品"指可能包含对于其的分析物测定是期望的分析物的任 何事物。在许多情况中，所述分析物是Cf核酸分子，例如编码BRAF的全部或部分的DNA或 CDNA分子。所述样品可W是生物样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿 液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、疲、脑脊液、泪液、黏液、羊水等。包括结缔组织、上皮 组织、肌肉组织和神经组织的生物组织通常是特定类型的细胞连同其细胞间质的聚集体， 所述细胞间质形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一。生物组织的实例 还包括器官、肿瘤、淋己结、动脉和单独的一个或更多个细胞。
[0028] 如本文使用的，"患者"包括哺乳动物。所述哺乳动物可为例如任何哺乳动物，例如 人类、灵长类、鸟类、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。在很多情况中， 所述哺乳动物是人类。
[0029] 本发明部分地基于W下发现:可通过在治疗的过程中在不同的时间点测量尿液或 血液中的CfDNA来准确地监测与癌症和其他疾病有关的基因突变。在实施例中展示了该发 现的有效性，其中在治疗的不同时间点对尿液和血液中Cf DNA中的突变的定量测量与如通 过射线照相术测量评估的肿瘤负荷W及如通过失效时间对疗法评价的治疗响应相关联。此 类测量可用于评价治疗选择。
[0030] 因此，在一些实施方案中，提供了用于随时间监测患者中的基因突变的方法，所述 方法包括：
[0031] (a)从患者获得体液的样品；
[0032 ] (b)定量或半定量地确定样品中的DNA中的突变的量;和
[0033] (C)在较后的时间重复(a)和化）。
[0034] 在多种实施方案中，基因突变与癌症相关。
[0035] 在运些方法中，预期具有DNA的任何体液可被利用。体液的非限制性实例包括但不 限于外周血、血清、血浆、尿液、淋己液、羊水和脑脊液。在某些特定的实施方案、诸如实施例 中例证的那些实施方案中，所述体液是血清、血浆或尿液。
[0036] 在一些情况中，所述方法被定量地进行，W使得基因改变的量被定量地确定，并可 W与另一测量值定量地比较。在其他情况中，所述方法半定量地进行，W使得基因改变的量 被确定，并随后与另一测量值简单地比较，W确定相对于彼此的相对升高或降低。
[0037]运些方法不狭窄地局限于任何特定癌症中的任何特定的基因突变，因为与任何癌 症相关的任何突变将被预期通过运些方法被准确地监测。此类基因的非限制性实例是APC、 BRAF、CDK4、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、肥 R3、PDGFR1、PDGFR2、AKT1、雌激素受体、雄 激素受体、EZH2、化 T3、HER2、IDHl、IDH2、JAK2、KIT、KRAS、c-Myc、N0TCHl、NRAS、PIK3CA、 PTEN、p53、pl6或Rbl基因。在一些实施方案中，突变位于BRAF基因或KRAS基因中。运些基因 中的示例性突变是BRAF V600E和KRAS突变6124、612(：、6120、6121?、6125、612￥和6130。
[003引对于多种人类肿瘤，已经报道了与BRAF V600E的关联，包括黑素瘤（-50%) (Davies等人，2002; Cudin等人，2005)、乳头状甲状腺癌(-40% )(化xeddu等人，2004)、朗 格汉斯细胞组织细胞增生症(57% KBadalian-Ve巧等人，2010)和多种实体瘤（W较低的频 率 KDavies 等人，2002;化 ose 等人，2002 ;Tie 等人，2011)。
[0039] 丝氨酸/苏氨酸激酶RAF家族的成员，BRAF蛋白是在调节细胞存活、增殖和分化中 发挥重要作用的RAS-RAF-MAPK信号转导通路的一部分化eshet和Seger，2010)DBRAF突变组 成性地激活MEK-E服通路，引起增强的细胞增殖、存活W及最终的致瘤性转化(Wel Arock和 Hurlstone ,2010;Niault和Baccarini ,2010)。所有的BRAF突变的毛细胞白血病化CL)病例 携带V600E模拟憐取代（phospho-mimetic substi1:ution)，其出现于BRAF活化片段中并W 组成性的方式显著增强其激酶活性(Wan等人，2004)。
[0040] 在许多情况中，BRAF突变是BRAF V600E突变，其中在SEQ ID NO: 2的位置或氨基酸 残基600处谷氨酸(Glu或E)取代了鄉氨酸(Val或V)残基。可选地，或另外地，BRAF突变为在 SEQ ID NO: 1的位置1860处腺嚷岭(A)取代了胸腺喀晚(T)核巧酸。
[0041 ] 智人￥-脚。氧肉瘤病毒