一枝蒿活性成分的制备方法及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种一枝蒿活性成分的制备方法及其用途。该方法是将干燥的一枝蒿药材粉碎，经乙醇水溶液提取，再经聚酰胺树脂柱分离纯化，将洗脱部位用有机溶剂萃取，收集三氯甲烷层获得的样品用硅胶柱进行二次分离纯化，重结晶，即获得3个单体化合物，得率和含量分别为紫花牡荆素0.30mg/g，96%?98%，6?去甲氧基?4′?O?甲基茵陈色原酮0.35 mg/g，97%?99%，艾黄素0.06 mg/g，95%?97%。经体外抗流感病毒的实验表明：通过本发明所述方法获得的一枝蒿活性成分具有一定的抗A/汉防/359/95(H3N2)流感病毒活性，是潜在的新型抗流感病毒先导化合物。本发明所述方法同时从一枝蒿中获取紫花牡荆素、6?去甲氧基?4′?O?甲基茵陈色原酮、艾黄素，其低成本、简便、高效、稳定。
【专利说明】
一枝蒿活性成分的制备方法及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一枝蒿抗流感病毒活性成分的制备及用途。
【背景技术】：
[0002] 新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.)为菊科（Compositae)蒿属（ArtemisiaL.) 植物，为新疆地产药材，维吾尔药名-孜伙艾密尼。主要分布于新疆，中亚、欧州等地亦有分 布。新疆主要分布沿天山山脉及阿尔泰山脉等地，一般生长在海拔1600~3000m的亚高山草 原、针叶林开阔地。新疆一枝蒿性寒，味辛苦，具有清热退烧，消炎止痛，凉血解毒等功能。新 疆一枝蒿具有较高的药用价值，民间多采用全草入药，具有抗过敏、抗氧化、抗病毒、保肝降 酶、诱导癌细胞凋亡、免疫调节多方面的作用。文献报道一枝蒿全草中含有黄酮类、酮酸类、 倍半萜类、氨基酸类、苷类、多糖类、挥发油类、多肽和生物碱等化学成分。前期研究发现一 枝蒿提取物酮酸类和黄酮类具有较强的抗流感病毒活性，我们前期比较了 26个新疆一枝蒿 不同提取物抗甲型流感病毒作用，结果发现4个新疆一枝蒿的提取物对流感病毒的抑制率 达到了50%以上；同时发现一枝蒿提取物酮酸类及黄酮类对呼吸道合胞病毒(RSV)及副流 感病毒(PIV)的体外作用非常明显。提示新疆一枝蒿抗病毒有效部位中主要化学成分具有 潜在的抗流感病毒活性。
[0003] 新疆一枝蒿药理作用广泛，临床应用价值正日益得到重视。针对一枝蒿抗流感病 毒作用的研究较为深入，但由于单体成分结构复杂，合成难度大，获得途径少，故对其药理 活性的研究多集中在有效部位上，对其单体成分的药理活性及其作用机制的研究尚不深 入，当前尚无对一枝蒿中除一枝蒿酮酸外的其他单体成分进行药理活性的研究。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于，提供一枝蒿活性成分的制备方法及其用途。该方法是将干燥 的一枝蒿药材粉碎，经乙醇水溶液提取，再经聚酰胺树脂柱分离纯化，将洗脱部位用有机溶 剂萃取，收集三氯甲烷层获得的样品用硅胶柱进行二次分离纯化，重结晶，即获得的3个单 体化合物，得率分别为紫花牡荆素〇. 30mg/g，6-去甲氧基-V -0-甲基茵陈色原酮0.35mg/g， 艾黄素〇.〇6mg/g，含量分别为紫花牡荆素96%-98%，6_去甲氧基-V -0-甲基茵陈色原酮 97 % -99 %，艾黄素95 % -97 %。经体外抗流感病毒的实验表明：通过本发明所述方法获得的 一枝蒿活性成分具有抗流感病毒活性，对流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)具有一定的活性， 是潜在的新型抗流感病毒先导化合物。本发明所述方法低成本、简便、高效、稳定的从一枝 蒿中提取紫花牡荆素、6-去甲氧基-f-O-甲基茵陈色原酮、艾黄素。
[0005] 本发明所述一种一枝蒿活性成分的制备方法，按下列步骤进行：
[0006] a.取干燥的一枝蒿药材，经粉碎，过10目筛，置于圆底烧瓶中，加入8-15倍重量的 体积浓度为30-75 %乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度50-80 °C，回流提取2-5次，时间为 1-3小时/次，提取后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.0-1.5，得到浸膏备用；
[0007] b.将步骤a中得到的浸膏，经真空干燥箱干燥，真空度-0.08MPa，温度45-70°C，得 到一枝蒿提取物，备用；
[0008] C.将步骤b得到的提取物与聚酰胺树脂为尼龙-6或尼龙-66或尼龙-610树脂按重 量比1:6-1:10进行吸附，树脂柱径高比为1:3-1:7，上样液提取物浓度为4%-10%，上样流 速为0.5-3BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰胺树脂5-10BV，洗脱流速0.5-3BV/h，再将水洗脱液 弃去后，用体积比浓度为10-95 %的乙醇水溶液洗脱5-10BV，流速为0.5-3BV/h，收集浓度为 30-60 %梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，再经真空干燥箱干燥，粉碎，即得一枝蒿纯 化物；
[0009] d.将步骤c得到的一枝蒿纯化物用水混悬，用石油醚萃取弃去石油醚层，水层用三 氯甲烷等体积萃取，收集三氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.0-1.2,得到 浸膏备用；
[0010] e.将步骤d得到的一枝蒿纯化物浸膏与硅胶以重量比1:1-1:3进行吸附并挥干，硅 胶柱径高比为1:5-1:10,湿法上样于硅胶柱，依次用体积比10:0-0:10的石油醚：乙酸乙酯 梯度洗脱，洗脱流速〇. 5-3BV/h，薄层色谱监测收集液，将同类物质合并，分别经旋转蒸发仪 浓缩至相对密度为1.0-1.5，压力为-0.08MPa，温度为40°C_60°C，溶剂常温挥干，加入甲醇 溶解，常温挥发至析出晶体，滤过，得单体化合物，经结构鉴定分别为紫花牡荆素含量在 96%-98%之间，6-去甲氧基-V -0-甲基茵陈色原酮含量在97%-99%之间，艾黄素含量在 95 %-97 % 之间。
[0011] 所述的方法获得的一枝蒿活性成分在制备预防和治疗抗流感病毒A/汉防/359/95 (H3N2)的药物中的用途。
[0012]所述的方法获得的一枝蒿活性成分在制备抗流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)的保 健品中的用途。
[0013] 本发明所述方法获得的紫花牡荆素、6-去甲氧基-f-O-甲基茵陈色原酮和艾黄素 具有抗病毒活性，是潜在的抗病毒药物的先导化合物。
[0014] 本发明所述的一枝蒿活性成分的制备方法及其用途，通过该方法获得的一枝蒿活 性成分，经结构鉴定分别为：
[0015] 紫花牡荆素，结构式为：
[0017] 6-去甲氧基-V -0-甲基茵陈色原酮，结构式为：
[0019]艾黄素，结构是为：
[0021] 本发明所述的一枝蒿活性成分的制备方法及其用途，该方法稳定、可靠、工艺简 单，可同时获得多个单体成分，纯度高，可批量制备。获得的化合物具有抗流感病毒活性，可 作为高效低毒的新型抗流感病毒先导化合物，是一类可以应用于预防、治疗感冒、咽喉肿痛 等疾病的药品、保健品或食品中的生产原料。
[0022] 本发明不仅揭示了有效部位的物质组成，更重要的是实际的解决了一枝蒿中复杂 化合物难以获取，获取成本高的问题，通过本发明所述方法获得的单体成分也为进一步整 体动物的抗流感病毒作用研究提供物质保障，是一类高效低毒的新型抗流感病毒先导化合 物。
【具体实施方式】
[0023] 本发明结合实施例作进一步的说明 [0024] 实施例1
[0025] a.取干燥的一枝蒿药材1kg，粉碎，过10目筛，置圆底烧瓶中，加入8倍重量的体积 浓度为30%乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度50°C，回流提取5次，时间为1小时/次，提取 后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.2，得到浸膏备用；
[0026] b.将步骤a中得到的浸膏，经真空干燥箱干燥，真空度-O.OSMPa，温度45°C，得到一 枝蒿提取物，备用；
[0027] c.将步骤b得到的提取物与聚酰胺树脂为尼龙-6树脂按重量比1:6进行吸附，树脂 柱径高比为1:3,上样液提取物浓度为4%，上样流速为0.5BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰胺 树脂10BV，洗脱流速0.5BV/h，再将水洗脱液弃去后，用体积浓度为10-95%的乙醇水溶液梯 度洗脱5BV，流速为0.5BV/h，收集浓度为30 %梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，再经 真空干燥箱干燥，粉碎，即得一枝蒿纯化物；
[0028] d .将步骤c得到的一枝蒿纯化物用水混悬，依次用等体积的石油醚:三氯甲烷萃 取，收集三氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1. 〇，得到浸膏备用；
[0029] e.将步骤d得到的一枝蒿纯化物浸膏与硅胶以重量比1:1进行吸附并挥干，硅胶柱 径高比为1:5,湿法上样于硅胶柱，依次用体积比10:0-0:10的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱， 洗脱流速〇. 5-3BV/h，薄层色谱监测收集液，将同类物质合并，分别经旋转蒸发仪浓缩至相 对密度为1.5，其压力为-0.08MPa，温度为40°C，溶剂常温挥干，加入甲醇使溶解，常温挥发 至析出晶体，滤过，得3个单体化合物，分别为紫花牡荆素321mg、6-去甲氧基-V-0-甲基茵 陈色原酮357mg和艾黄素63mg，含量分别为紫花牡荆素96.2%，6_去甲氧基-V-0-甲基茵陈 色原酮97.5%，艾黄素95.4%。
[0030] 实施例2
[0031 ] a.取干燥的一枝蒿药材lkg，粉碎，过10目筛，置圆底烧瓶中，加入10倍重量的体积 浓度为50%乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度60°C，回流提取3次，时间为2小时/次，提取 后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.3，得到浸膏备用；
[0032] b.将步骤a中得到的浸膏，经真空干燥箱干燥，真空度-O.OSMPa，温度50°C，得到一 枝蒿提取物，备用；
[0033] c.将步骤b得到的提取物与聚酰胺树脂为尼龙-66树脂按重量比1:8进行吸附，树 脂柱径高比为1:5,上样液提取物浓度为6%，上样流速为1.0BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰 胺树脂8BV，洗脱流速1. OBV/h，再将水洗脱液弃去后，用体积比浓度为10-95 %的乙醇水溶 液梯度洗脱8BV，流速为1. OBV/h，收集浓度为50 %梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩， 再经真空干燥箱干燥，粉碎，即得一枝蒿纯化物；
[0034] d.将步骤c得到的一枝蒿纯化物用水混悬，依次用石油醚、三氯甲烷等体积萃取， 收集三氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.1，得到浸膏备用；
[0035] e.将步骤d得到的一枝蒿纯化物浸膏与硅胶以重量比1:2进行吸附并挥干，硅胶柱 径高比为1:8,湿法上样于硅胶柱，依次用体积比10:0-0:10的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱， 洗脱流速〇. 5-3BV/h，薄层色谱监测收集液，将同类物质合并，分别经旋转蒸发仪浓缩至相 对密度为1.3，其压力为-0.08MPa，温度为50°C，溶剂常温挥干，加入甲醇使溶解，常温挥发 至析出晶体，滤过，得3个单体化合物，分别为紫花牡荆素311mg、6-去甲氧基K-甲基茵 陈色原酮363mg和艾黄素69mg，含量分别为紫花牡荆素97.8%，6_去甲氧基-V-0-甲基茵陈 色原酮98.9%，艾黄素96.7%。
[0036] 实施例3
[0037] a.取干燥的一枝蒿药材lkg，粉碎，过10目筛，置圆底烧瓶中，加入15倍重量的体积 浓度为75%乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度80°C，回流提取2次，时间为1小时/次，提取 后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.3，得到浸膏备用；
[0038] b.将步骤a中得到的浸膏，经真空干燥箱干燥，真空度-O.OSMPa，温度65°C，得到一 枝蒿提取物，备用；
[0039] c.将步骤b得到的提取物与聚酰胺树脂为尼龙-610树脂按重量比1:10进行吸附， 树脂柱径高比为1:7,上样液提取物浓度为10%，上样流速为3BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰 胺树脂5BV，洗脱流速3BV/h，再将水洗脱液弃去后，用体积比浓度为10-95 %的乙醇梯度洗 脱10BV，流速为3BV/h，收集浓度为60 %梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，再经真空干 燥箱干燥，粉碎，即得一枝蒿纯化物；
[0040] d.将步骤c得到的一枝蒿纯化物用水混悬，依次用石油醚、三氯甲烷等体积萃取， 收集三氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.1，得到浸膏备用；
[0041] e.将步骤d得到的一枝蒿纯化物浸膏与硅胶以1:3重量比实施吸附并挥干，硅胶柱 径高比为1:10,湿法上样于硅胶柱，依次用体积比10:0-0:10的石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱， 洗脱流速0.5-3BV/h，薄层色谱监测收集液，将同类物质合并，分别经旋转蒸发仪浓缩至相 对密度为1.4，其压力为-0.08MPa，温度为60°C，溶剂常温挥干，加入甲醇使溶解，常温挥发 至析出晶体，滤过，得3个单体化合物，分别为紫花牡荆素355mg、6-去甲氧基-V-0-甲基茵 陈色原酮378mg和艾黄素62mg，含量分别为紫花牡荆素97.1%，6-去甲氧基-4 /-0-甲基茵陈 色原酮98.2%，艾黄素96.3%。
[0042] 实施例4
[0043] 本发明所述方法获取一枝蒿活性成分的药效学研究：
[0044] 本实验以MDCK(狗肾）细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度 (CPE);
[0045] 材料和方法：
[0046] 病毒株:流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2013.9)，-80 °C保存；
[0047]样品处理：样品用稀释液配成适宜初始浓度，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释 度；
[0048]阳性对照药:病毒唑(RBV)，新乡制药股份有限公司（批号20081227)，达菲，中国食 品药品检定研究院(批号101096-200901);
[0049] 测试方法:MDCK细胞接种96孔培养板，置5 %⑶2，37 °C培养。24小时后感染流感病 毒1/310-5,吸附2小时，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时 设细胞对照孔和病毒对照孔，5% C02，温度37°C培养待病毒对照组病变(CPE)达4+时观察各 组细胞病变(CPE)(约40小时），计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC50)。
[0050] 实验结果：
[0051 ] 结果见表1;
[0052]表1抗流感病毒活性筛选结果
[0054]注：（1)表中表示样品在最大无毒剂量无抗流感甲型病毒活性。（2)TC5Q:药物半 数有毒浓度;IC5Q:药物对病毒半数抑制浓度;SI:选择指数，SI=TC5Q/IC 50。
[0055] 实验结论：
[0056] 该试验条件下，紫花牡荆素、6-去甲氧基-V-0-甲基茵陈色原酮和艾黄素对流感 病毒A/汉防/359/95(H3N2)有抑制活性。
[0057] 实施例5
[0058]通过本发明所述方法获得的一枝蒿活性成分的结构鉴定：
[0059]化合物紫花牡荆素的鉴定：紫花牡荆素为黄色无定形粉末，EI-MS m/z : 374，与分 子式Ci9Hi8〇8相符；1H-NMR(DMS0，500MHz)S: 7 ? 67(1H，d，J = 2Hz，H-2' )，7 ? 62(1H，dd，J = 8 ? 5， 1 .SHzj-e' ) j.geUHJ-e.SHzj-S' )，6.91(lH，s，H-8)，3.72~3.91(12H，br，4f-OCH3)。结合紫花牡荆素标准品HPLC比对结果和文献，确定该化合物为紫花牡荆素。其结构 式1:
[0061]化合物6-去甲氧基-0-甲基茵陈色原酮的鉴定：白色无定形粉末，EI-MS m/z: 300。与分子式Ci6Hi2〇6相符。1H-NMR(DMS0，500MHz)S: 7 ? 32(1H，d，J = 2 ? 5Hz，H-2' )，7 ? 31 (1H， d,J = 2Hz,H-6/ ) ,7.06(lH,d,J = 2Hz,H-5/ ), 7.05( lH,d, J = 2Hz ,H-37 ) ,6.34( lH,d, J = 2.5Hz，H-6)，6.19(lH，d，J = 2Hz，H-8)，5.04(lH，s，H-3)，3.78(lH，s，-0CH3)。结合 6-去甲氧 基-0-甲基茵陈色原酮标准品HPLC比对结果和文献，确定该化合物为6-去甲氧基-0-甲基茵陈色原酮。其构式2:
[0063]化合物艾黄素的鉴定:黄色针状结晶，EI-MS m/z:388。与分子式C2QH2Q〇8相符。111-NMR(DMS0,500MHz)S:7.75(lH，dd，J = 6.5,2Hz，H-6/ )，7.08(1H， d，J = 6.8Hz，H-5/ )，6.77(111，8，11-8)，3.78~3.92(1511，1^，5个-0〇13)。结合艾黄素标准品 HPLC比对结果和文献，确定化合物为艾黄素。其构式3:
[0065]经结构鉴定:分别为紫花牡荆素含量在96 %-98 %之间，6-去甲氧基-V-0-甲基茵 陈色原酮含量在97 % -99 %之间，艾黄素含量在95 % -97 %之间。
【主权项】
1. 一种一枝蒿活性成分的制备方法，其特征在于按下列步骤进行： a、 取干燥的一枝蒿药材，经粉碎，过10目筛，置于圆底烧瓶中，加入8-15倍重量的体积 浓度为30-75%乙醇水溶液进行提取，水浴加热温度50-80°C，回流提取2-5次，时间为1-3小 时/次，提取后的滤液经减压浓缩至相对密度为1.0-1.5，得到浸膏备用； b、 将步骤a中得到的浸膏，经真空干燥箱干燥，真空度-O.OSMPa，温度45-70°C，得到一 枝蒿提取物，备用； c、 将步骤b得到的提取物与聚酰胺树脂为尼龙-6或尼龙-66或尼龙-610树脂按重量比 1:6-1:10进行吸附，树脂柱径高比为1: 3-1: 7，上样液提取物浓度为4%-10%，上样流速为 0.5-3 BV/h，吸附后先用水洗脱聚酰胺树脂5-10BV，洗脱流速0.5-3 BV/h，再将水洗脱液弃 去后，用体积比浓度为10-95%的乙醇水溶液洗脱5-10BV，流速为0.5-3 BV/h，收集浓度为 30-60%梯度的乙醇洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩，再经真空干燥箱干燥，粉碎，即得一枝蒿纯 化物； d、 将步骤c得到的一枝蒿纯化物用水混悬，用石油醚萃取弃去石油醚层，水层用三氯甲 烷等体积萃取，收集三氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.0-1.2,得到浸膏 备用； e、 将步骤d得到的一枝蒿纯化物浸膏与硅胶以重量比1:1-1:3进行吸附并挥干，硅胶柱 径高比为1:5-1:10,湿法上样于硅胶柱，依次用体积比10:0-0:10的石油醚：乙酸乙酯梯度 洗脱，洗脱流速0.5-3 BV/h，薄层色谱监测收集液，将同类物质合并，分别经旋转蒸发仪浓 缩至相对密度为1.0-1.5，压力为-0.08MPa，温度为40°C-60°C，溶剂常温挥干，加入甲醇溶 解，常温挥发至析出晶体，滤过，得单体化合物，经结构鉴定分别为紫花牡荆素，得率 0.30mg/g，含量在96%-98%之间；6-去甲氧基-V -0-甲基茵陈色原酮，得率0.35mg/g，含量在 97%-99%之间；艾黄素，得率0.06mg/g，含量在95%-97%之间。2. 根据权利要求1所述的方法获得的一枝蒿活性成分在制备预防抗流感病毒A/汉防/ 359/95(H3N2)的药物中的用途。3. 根据权利要求1所述的方法获得的一枝蒿活性成分在制备抗流感病毒A/汉防/359/ 95 (H3N2)的保健品中的用途。
【文档编号】C07D311/30GK105820147SQ201610281770
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】顾政, 顾政一, 贺金华, 戎晓娟, 刘君琳, 茹仙古丽·依明
【申请人】新疆维吾尔自治区药物研究所