一种利用纳米铬生产酵母铬的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用纳米铬生产酵母铬的方法。该方法以纳米铬为铬源，利用酵母发酵技术，通过生物转化将纳米铬转变成酵母铬，具体可包括以下步骤：(1)将酵母于32℃?36℃的温度下，根据发酵体系中乙醇和溶解氧的变化，通过补料?分批操作对酵母进行高密度发酵培养。(2)通过补铬?分批操作添加纳米铬，控制发酵培养基中纳米铬的浓度为100?500mg/L。(3)发酵结束后，将含有酵母的发酵液离心收集菌体，洗涤菌体，采用多联酶解和高压匀浆等技术对酵母进行破壁，将破壁后的酵母经提纯干燥即获得酵母铬。本工艺生产的酵母铬有机铬含量达5000?9000mg/kg，适用于畜牧业，其生产方法实用性强，易于产业化生产。CGMCC No.1145320150923
【专利说明】
一种利用纳米铬生产酵母铬的方法
技术领域
[0001]本发明属于饲料添加剂领域，涉及一种利用纳米铬生产酵母铬的方法。
【背景技术】
[0002]络是动物的必需微量元素，是葡萄糖耐量因子(Glucose Tolerance Factor，GTF)的重要活性成分，能协助胰岛素维持正常糖耐量，参与了机体的糖类代谢和脂类代谢，进而影响动物的生长、繁殖和胴体品质，具有降低热应激，改善饲料转化率，提高畜禽生产性能和繁殖力等功效。因此，动物补铬很有必要。
[0003]作为饲料添加剂的铬一般分为无机铬和有机铬两大类，无机铬为氯化铬、硫酸铬等;有机铬在农业部《饲料添加剂品种目录》中允许添加的有烟酸铬、酵母铬、蛋氨酸铬、吡啶甲酸铬和丙酸铬共5个品种，瑞士联邦学院畜牧所的Gebert和Wenkin发现酵母铬的效果最好。酵母铬是利用酵母具有富集微量元素的能力，将无机铬吸收转化为有机铬，与无机铬相比，有机铬毒性低，动物更容易吸收利用。
[0004]酵母铬作为饲料添加剂使用，添加量为200_800g/吨，三价铬的毒性远低于六价铬，有机铬毒性低于无机铬。大量试验表明，日粮中添加铬可提高特定组织器官中铬的含量如肝和肾。Brockman (1986)报道，三价铬的用量与中毒量之比是1:1000，可见三价铬的使用是非常安全的。wayne等(1988)报道，大鼠日粮中添加5%氧化铬持续饲喂SOd未见引起毒性效应。健康大鼠每天饲吡啶羧酸铬含量为10mg/kg的日粮5个月，结果发现肝脏含有近750ug/kg的铬，但未发现任何组织学和生化的毒性证据。严乾临等(2000)报道，给20-25kg猪饲喂铬浓度为500ug/kg的烟酸铬日粮105d后，未发现对猪产生毒性作用，特别是铬沉积量较多的器官如肝脏，试验组铬沉积量与对照组相比，有升高的趋势，但差异不显著。AnderSon(1997)给猪日粮添加浓度为300ug/kg的吡啶羧酸铬，增加了肝脏和肾脏中的铬含量，但心脏和其他组织铬不受影响。董晓慧(2001)用氯化铬、蛋氨酸铬及烟酸铬等3种铬源对280只14日龄AA肉仔鸡进行为期3w的饲养试验，结果表明不同形式和水平的铬不影响心脏、肝脏和胰脏相对重量。沈建忠(2002)以吡啶羧酸铬对Wi star大鼠进行毒性试验，其口服半数致死量(LD5q)大于5000mg/kg BW，说明吡啶羧酸铬安全性大，对动物无明显毒性。
[0005]当前酵母铬的生产效率低下，无法做到高密度发酵。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是介绍利用纳米铬生产酵母铬的方法。
[0007]本发明要求保护一种酵母菌菌株(Saccharomyces boulardii)GB15，其保藏编号为CGMCC N0.11453，保藏日期为2015年9月23日。
[0008]该菌株的保藏单位为隶属中国微生物菌种保藏馆里委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所，邮编为100101。
[0009]该菌株是铬的耐受菌株且富铬能力强。
[0010]另外，由上述本发明提供的酵母菌菌株GB15发酵培养而得的酵母铬产品，也属于本发明的保护范围。
[0011]具体的，所述酵母铬产品中，每kg产品中含酵母铬5000-8000mg。
[0012]本发明还提供了两种制备所述酵母铬产品的方法。
[0013]其中，方法一包括如下步骤:
[0014]I)将所述酵母菌菌株GB15活化后于一级种子培养基中进行发酵培养，发酵完毕得到一级种子液；
[0015]所述一级种子培养基由铬液a和下述两种培养基中的任意一种组成:麦芽汁培养基或YI3D培养基；
[0016]其中，所述铬液a为浓度为50_80mg/L的纳米铬的水溶液；
[0017]2)将步骤I)所得一级种子液加入到二级种子培养基中进行发酵培养，得到二级种子液；
[0018]所述二级种子培养基由铬液b、碳源、氮源和无机盐组成；
[0019]其中，所述铬液b为浓度为50_80mg/L的纳米铬的水溶液；
[0020]3)将步骤2)所得二级种子液加入到由铬液C、碳源、氮源和无机盐组成三级培养基中进行发酵培养，发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加补料培养基，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升控制流加的营养物质，当溶解氧低至15%-35% (具体可为15-25 %或25-35 %或20_30 % )时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升，在发酵8-12h(具体可为Sh或1h)时补加所述铬液C，发酵完毕后，将所得发酵液离心，收集酵母菌体，破壁，干燥得到所述酵母铬产品；
[0021]所述铬液c为浓度为50-250g/L的纳米铬的水溶液，具体为200或250g/L的纳米铬的水溶液；
[0022]所述补料培养基由糖蜜和淀粉酶解产生的葡萄糖液组成，且所述糖蜜中的还原糖含量占总还原糖含量的20-60 %，具体可为20-30 % ,40-50%或50-60 % ;总还原糖的浓度为400-800g/L，具体可为 500-600g/L、600-700g/L 或 700-800g/L ；
[0023]所述铬液c的补加量为使发酵体系中纳米铬的终浓度为100_500mg/L，具体可为400-500mg/L、350-450mg/L或400-450mg/L。
[0024]上述方法的步骤I)-步骤3)所述络液a至络液c中，纳米络的粒径均为40-70nm;该纳米铬可通过可变电流激光离子束气相法工艺生产，纯度高，粒度均匀，表面结构完整，易分散，比表面积大，表面活性高。
[0025]所述步骤I)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C;培养方式为振荡培养;培养时间为 16-20h; pH 值为 5.0-6.0；
[0026]该步骤所用一级种子培养基可按照如下方法制得:将大麦芽粉与水混合、保温糖化、过滤澄清后加水将浓度调节至10° Bx，纳米铬120mg，将此培养基定容到2400ml，调节pH5.0-6.0，用12个1000ml的三角瓶各装培养基200ml，115°C灭菌30min而得；
[0027]所述步骤2)发酵培养步骤中，培养温度为32_36°C;培养时间为10-15h;pH值为5.0-6.0 ；转速为 200-350r/min ；
[0028]该步骤所用培养基中，碳源选自葡萄糖、糖蜜、玉米粉和淀粉水解糖中至少一种；氮源选自尿素、玉米浆和花生饼粉中至少一种;无机盐选自磷酸、磷酸二氢钾和硫酸镁中至少一种；
[0029]具体的，该步骤所用培养基可按照如下方法制得:
[0030]在Im3种子罐上培养，葡萄糖12kg，糖蜜3kg，玉米浆1kg，尿素2kg，kH2P040.6kg，MgS04.7H2O0.3kg，纳米络20g，调节pH5.0-6.0，定容400L，实罐灭菌，121 °C灭菌20min，冷却32°C而得;或者，
[0031 ] 在2m3种子罐上培养，葡萄糖37kg，糖蜜1kg，玉米浆20kg，尿素4kg，kH2P04l.2kg，MgSO4.7H200.6kg，消泡剂0.1kg，纳米铬50g，调节pH5.0-6.0，定容800L，实罐灭菌，121°C灭菌20min，冷却32°C而得；
[0032]所述步骤3)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C，pH值为5.0-6.0;搅拌转速为250-350r/min，具体为 300r/min 或 350r/min ；
[0033]该步骤中，所用糖蜜为经过稀释、调酸、煮沸、加碱中和和澄清处理的糖蜜;所述总还原糖的浓度具体可为400-500g/L、500-600g/L或700-800g/L;
[0034]该步骤中所用培养基具体可按照如下方法制得:
[0035]将葡萄糖600kg，糖蜜4kg，玉米楽10kg，kH2P047kg，MgS04.7H207kg，纳米络300g，消泡剂0.3kg，调节pH5.0-6.0，定容6m3，实罐灭菌，121°C灭菌30min而得；
[0036]铬液的添加方式为周期补铬；
[0037]所述补加铬液步骤中，补加时间在5_7h内完成，具体可为6h或7h;
[0038]所述离心步骤中，转速为8000-8500r/min，离心力为7000-8000g;
[0039]所述破壁的方法包括如下步骤:
[0040]先用复合酶解所述酵母菌体的细胞壁，再进行高压匀浆；
[0041]所述复合酶具体为由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种组成，均可购自诺维信公司；
[0042]所述复合酶的用量为每kg酵母菌体用0.1-0.5g所述复合酶；
[0043]所述复合酶可为由质量比为1:4:4的葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶或由质量比为1:8:4:4的葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶；
[0044]所述葡聚糖酶的酶活为30000u/g;该酶活的定义为:在50°C、pH4.8条件下，I分钟水解大麦β-葡聚糖产生Iymol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为I个酶活单位(U);
[0045]所述溶菌酶的酶活为500000u/g;该酶活的定义为:在25°C、pH6.2条件下，于450nm处每分钟使吸光度值降低0.001为I个酶活力单位(U);
[0046]所述木瓜蛋白酶的酶活为lOOOOOu/g;该酶活的定义为:在25°C下、pH6.2条件下，每分钟内能催化分解IumolN-苯甲酰-L-精氨酸乙酯所需的酶量，称为I个酶活力单位(U);
[0047]所述碱性蛋白酶的酶活为200000u/g;该酶活的定义为:Ig固体酶粉(或Iml液体酶)在40°C、pH10.5下，Imin水解酪蛋白产生Iug酪氨酸，定义为I个蛋白酶活力单位(U)；
[0048]所述高压匀浆步骤中，压力为40_80Mpa，具体为55或60MPa;匀浆的次数为1-5次；具体可为2次；
[0049]所述干燥步骤中，干燥的方法为冷冻干燥，温度具体为O至-50°C，真空度为1Pa，时间为2-4小时，具体为2小时或4小时。
[0050]方法二包括如下步骤:
[0051]I)将所述酵母菌菌株GB15活化后于一级种子培养基中进行发酵培养，发酵完毕得到一级种子液；
[0052]所述一级种子培养基由铬液a和下述两种培养基中的任意一种组成:麦芽汁培养基或Yro培养基；
[0053]其中，所述铬液a为浓度为50_80mg/L的纳米铬的水溶液；
[0054]2)将步骤I)所得一级种子液加入到由碳源、氮源和无机盐组成的二级培养基中进行发酵培养，发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加补料培养基，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升来控制流加的营养物质，当溶解氧低至15%_35% (具体可为15-25 %或25-35 %或20_30 % )时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升;在所述发酵培养的同时将铬液d以对数关系递增的速度流加，流加的速度与酵母的生长速度相同，在对数生长期结束时停止流加，将所得发酵液离心，收集酵母菌体，破壁，干燥得到所述酵母铬
τ?: 口广PR ；
[0055]所述铬液d为浓度为10_20g/L的纳米铬的水溶液，具体为15g/L的纳米铬的水溶液；
[0056]所述补料培养基由糖蜜和淀粉酶解产生的葡萄糖液组成，且所述糖蜜中的还原糖含量占总还原糖含量的20-60 %，具体可为20-30 %、40-50%或50-60 % ；所述总还原糖的浓度具体可为400-500g/L、500-600g/L 或 700-800g/L ；
[0057]所述铬液d的补加量为使发酵体系中纳米铬的终浓度为100_500mg/L，具体可为400-500mg/L、350-450mg/L或400-450mg/L。
[0058]上述方法的步骤I)-步骤2)所述络液a和络液d中，纳米络的粒径均为40-70nm;该纳米铬可通过可变电流激光离子束气相法工艺生产，纯度高，粒度均匀，表面结构完整，易分散，比表面积大，表面活性高。
[0059]所述步骤I)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C;培养方式为振荡培养;培养时间为16-20h ;pH值为5.0-6.0；该步骤所用一级种子培养基可按照如下方法制得:将大麦芽粉与水混合、保温糖化、过滤澄清后加水将浓度调节至10° Bx，纳米铬60mg，将此培养基定容至Ijl200ml，调节pH5.0-6.0，用6个1000ml的三角瓶各装培养基200ml，115°C灭菌30min而得；
[0060]所述步骤2)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C，pH值为5.0-6.0;转速为200-350r/min，具体为 300r/min ；
[0061]该步骤中，所用糖蜜为经过稀释、调酸、煮沸、加碱中和和澄清处理的糖蜜;所述总还原糖的浓度具体可为400-500g/L、500-600g/L或700-800g/L;
[0062]具体的，该步骤所用培养基可按照如下方法制得:
[0063]将葡萄糖6000g，糖蜜40g，玉米楽80g，85%H3P0440g，MgS04.7H2044g置于 100L全自动发酵罐中，调节pH5.0-6.0，定容35L，实罐灭菌，121°C灭菌20min，冷却32°C而得；
[0064]离心步骤中，转速为8000-8500r/min，离心力为7000-8000g;
[0065]所述破壁的方法包括如下步骤:
[0066]先用复合酶解所述酵母菌体的细胞壁，再进行高压匀浆；
[0067]其中，所述复合酶具体为由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种组成，均可购自诺维信公司；
[0068]所述复合酶的用量为每kg酵母菌体用0.1-0.5g所述复合酶；
[0069]所述复合酶具体为由质量比为2:1的溶菌酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶；
[0070]所述葡聚糖酶的酶活为30000u/g;该酶活的定义为:在50°C、pH4.8条件下，I分钟水解大麦β-葡聚糖产生Iymol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为I个酶活单位(U);
[0071]所述溶菌酶的酶活为500000u/g;该酶活的定义为:在25°C、pH6.2条件下，于450nm处每分钟使吸光度值降低0.001为I个酶活力单位(U);
[0072]所述木瓜蛋白酶的酶活为100000U/g;该酶活的定义为:在40°C下、pH7.5条件下，每分钟内能催化分解酪蛋白生成Iug酪氨酸所需的酶量，称为I个酶活力单位(U);
[0073]所述碱性蛋白酶的酶活为200000u/g;该酶活的定义为:Ig固体酶粉(或Iml液体酶)在40°C、pH10.5下，Imin水解酪蛋白产生Iug酪氨酸，定义为I个蛋白酶活力单位(U)；
[0074]所述高压匀浆步骤中，压力为40_80Mpa，具体为55MPa;匀浆的次数为1-5次；具体可为2次；
[0075]所述干燥步骤中，干燥的方法为冷冻干燥，温度具体为O至-50°C，真空度为1Pa，时间为2-4小时。
[0076]所述方法二在所述步骤2)中还包括:在所述发酵培养过程中，采用流加氨水的方式补充氮源并控制发酵pH为5.0-6.0，控制搅拌转速为250-350r/min ；
[0077]另外，可根据泡沫情况添加消泡剂控制泡沫。
[0078]另外，上述两方法步骤I)之前，可对按照常规方法对酵母菌菌株GB15进行活化;如可按照如下方法进行活化:将酵母菌菌株GB15接种在含有I %酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、铬(纳米铬)浓度为50-10(^111、？!14.5-6.0的固体培养基上，32°(:培养3211。
[0079]所述经过高密度发酵后酵母菌的湿重为200-300g/L。
[0080]本发明将酵母细胞培养在含铬的培养基中，通过生物转化将无机铬转转变成有机络，采用的络源为纳米络(CrNano，纳米级氯化络，粒径40-70nm)，纳米络由于具有更小的粒径，更多的表面活性中心和比表面积，与氯化铬相比，更容易实现跨膜运输，可以更好的被酵母吸收，在酵母体内有更高的生物转化率和酵母铬产量。
[0081]酵母铬产品由于酵母的细胞壁较厚较坚韧，很难被动物消化，被富集的铬也很难被动物吸收利用，本发明在制得酵母铬产品后采用多联酶解和高压匀浆等技术对酵母进行破壁，将酵母内的有机铬被释放出来，同时释放出来的还有酵母本身的蛋白质、核糖核酸、B族维生素和多种氨基酸等，这些都是动物很好的营养来源。将破壁后的酵母经提纯干燥即获得最终的酵母铬产品，从而使得本发明提供的酵母铬产品同时具有补铬和补酵母营养的双重功效。
【具体实施方式】
[0082]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0083]实施例1、在100L发酵罐上发酵(方法二)
[0084]斜面菌种培养:将保藏编号为CGMCC N0.11453的酵母菌菌株(Saccharomycesboulardii )GB15接种在含有I %酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、络(纳米络)浓度为80ppm、PH4.5-6.0的固体培养基上，在32°C培养32h。
[0085]—级摇瓶种子的培养:将大麦芽粉与水混合、保温糖化、过滤澄清后加水将浓度调节至10° Bx，纳米铬60mg，将此培养基定容到1200ml，调节pH5.0-6.0，用6个1000ml的三角瓶各装培养基200ml，115°C灭菌30min。冷却32°C时接入新鲜斜面菌种，于32°C、200r/min下振荡培养20h。
[0086]补料培养基的配置:取经过稀释、调酸、煮沸、加碱中和和过滤处理的糖蜜与淀粉酶解产生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的还原糖占总还原糖的50 %，加水或浓缩控制总还原糖的浓度为600g/L，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0087]补铬培养基的配置:将纳米铬配成15g//L的水溶液，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0088]在100L发酵罐上发酵:葡萄糖6000g，糖蜜40g，玉米浆80g，85%H3P0440g,MgSO4.7H2044g置于10L全自动发酵罐中，调节pH5.0-6.0，定容35L，实罐灭菌，121°C灭菌20min，冷却32°C时接入6个一级摇瓶种子开始发酵，发酵初始体积约为40L。发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加总还原糖浓度为600g/L的混合糖液，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升来控制流加的营养物质，当溶解氧低至25%时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升。整个铬液在发酵开始以后以对数关系递增的速度流加，流加速度与酵母的生长速度一致，在对数生长期结束时完成流加，发酵液最终纳米铬浓度为400mg/L。采用流加氨水的方式补充氮源并控制发酵pH为5.0-6.0，控制搅拌转速为300r/min，根据泡沫情况添加消泡剂控制泡沫。发酵38h时停止补料、补铬，发酵40h时结束，此时酵母产量为240g/Lo
[0089]发酵结束后，将含有酵母的发酵液8000r/min离心20min收集菌体，洗涤菌体，先用质量比为2:1的由溶菌酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶在现在25°C酶解2小时，然后升温至40°C酶解I小时。然后再用高压均质机在55Mpa压力下匀浆两次对酵母进行破壁，将破壁后的酵母经冷冻干燥(真空度为10Pa，温度为O至-50°C)2小时即获得酵母铬。该酵母铬产品中有机铬的含量达6700mg/Kg。
[0090]实施例2、在1m3发酵罐上发酵(方法一)
[0091 ]斜面菌种培养:同实施例1
[0092]—级摇瓶种子的培养:将大麦芽粉与水混合、保温糖化、过滤澄清后加水将浓度调节至10° Bx，纳米铬120mg，将此培养基定容到2400ml，调节pH5.0-6.0，用12个100ml的三角瓶各装培养基2001111，115°(:灭菌301^11。冷却32°(:时接入新鲜斜面菌种，于32°(:、20(^/1^11下振荡培养20h。
[0093]二级种子培养:在Im3种子罐上培养，葡萄糖12kg，糖蜜3kg，玉米浆10kg，尿素2kg，kH2P040.6kg,MgSO4.7H200.3kg，纳米铬20g，调节pH5.0-6.0，定容400L，实罐灭菌，121°C灭菌20min，冷却32°C时接入2400ml—级摇瓶种子，转速控制为200r/min，温度控制为32°C，培养 15h0
[0094]补料培养基的配置:取经过稀释、调酸、煮沸、加碱中和和过滤处理的糖蜜与淀粉酶解产生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的还原糖占总还原糖的40 %，加水或浓缩控制总还原糖的浓度为700g/L，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0095]补铬培养基的配置:将纳米铬配成200g/L的水溶液，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0096]在1m3发酵罐上发酵:葡萄糖600kg，糖蜜4kg，玉米浆1kg，kH2P047kg，MgSO4.7H207kg，纳米络300g，消泡剂0.3kg，调节pH5.0-6.0，定容6m3，实罐灭菌，121°C灭菌30min，冷却32°C时接入二级种子液开始发酵。发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加总还原糖浓度为700g/L的混合糖液，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升来控制流加的营养物质，当溶解氧低至30 %时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升。在发酵8h时补加铬液，整个补铬在6h内完成，发酵液最终纳米铬浓度为450mg/L。采用流加氨水的方式补充氮源并控制发酵pH为5.0-6.0，控制搅拌转速为300r/min，根据泡沫情况再添加消泡剂控制泡沫。发酵36h时停止补料、补铬，发酵40h时结束，此时酵母产量为280g/L。
[0097]发酵结束后，将含有酵母的发酵液8000r/min离心力7000g离心20min收集菌体，洗涤菌体，先用质量比为1:4:4的由葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶先在40°C酶解2小时，然后升温至50 °C酶解I小时，然后再用高压均质机在50Mpa压力下匀浆两次对酵母进行破壁，将破壁后的酵母经冷冻干燥(真空度为10Pa，温度为O至-50°C)4小时即获得酵母铬。该酵母铬产品中有机铬的含量达7000mg/kg。
[0098]实施例3、在25m3发酵罐上发酵(方法一)
[0099]斜面菌种培养:同实施例1
[0?00] —级摇瓶种子的培养:方法同实施例2，制备2400ml—级摇瓶种子备用。
[0101 ] 二级种子培养:在2m3种子罐上培养，葡萄糖37kg，糖蜜1kg，玉米浆20kg，尿素4kg，kH2P0U.2kg, MgSO4.7H200.6kg，消泡剂 0.lkg,纳米铬 50g，调节 pH5.0-6.0，定容 800L，实罐灭菌，121°C灭菌20min，冷却32 V时接入2400ml—级摇瓶种子，转速控制为250r/min，温度控制为32°C，培养15h。
[0102]补料培养基的配置:取经过稀释、调酸、煮沸、加碱中和和过滤处理的糖蜜与淀粉酶解产生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的还原糖占总还原糖的30 %，加水或浓缩控制总还原糖的浓度为800g/L，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0103]补铬培养基的配置:将纳米铬配成250g/L的水溶液，121°C灭菌15min，冷却32°C备用。
[0104]在25m3发酵罐上发酵:葡萄糖22200kg，糖蜜14kg，玉米浆28kg，kH2P04l5kg，MgSO4.7H2015kg，纳米铬500g，消泡剂0.6kg，调节pH5.0-6.0，定容 12m3，实罐灭菌，121°C灭菌30min，冷却32°C时接入二级种子液开始发酵。发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加总还原糖浓度为800g/L的混合糖液，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升来控制流加的营养物质，当溶解氧低至20%时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升。在发酵1h时补加铬液，整个补铬在7h内完成，发酵液最终纳米铬浓度为500mg/L。采用流加氨水的方式补充氮源并控制发酵pH为5.0-6.0，控制搅拌转速为350r/min，根据泡沫情况再添加消泡剂控制泡沫。发酵35h时停止补料、补铬，发酵38h时结束，此时酵母产量为320g/L。
[0105]发酵结束后，将含有酵母的发酵液8000r/min离心20min收集菌体，洗涤菌体，先用质量比为1:8:4:4的由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶先在25°C酶解I小时，然后在40°C酶解2.5小时，然后升温至50°C酶解0.5小时，然后再用高压均质机在60Mpa压力下匀浆两次对酵母进行破壁，将破壁后的酵母经冷冻干燥(真空度为1Paj^度为O至-50 0C) 2小时即获得酵母铬。该酵母铬产品中有机铬的含量达7400mg/kg。
【主权项】
1.一种酵母菌菌株(Saccharomycesboulardii)GB15，其保藏编号为CGMCC N0.11453。2.由权利要求1所述酵母菌菌株GB15发酵培养而得的酵母铬产品。3.根据权利要求2所述的酵母铬产品，其特征在于:所述酵母铬产品中，每kg酵母铬产品中含酵母铬5000-8000mg。4.一种制备权利要求2或3所述酵母铬产品的方法，包括如下步骤: 1)将权利要求1所述酵母菌菌株GB15活化后于一级种子培养基中进行发酵培养，发酵完毕得到一级种子液； 所述一级种子培养基由络液a和下述两种培养基中的任意一种组成:麦芽汁培养基或Yro培养基； 其中，所述铬液a为浓度为50-80mg/L的纳米铬的水溶液； 2)将步骤I)所得一级种子液加入到二级种子培养基中进行发酵培养，得到二级种子液； 所述二级种子培养基由铬液b、碳源、氮源和无机盐组成； 其中，所述铬液b为浓度为50-80mg/L的纳米铬的水溶液； 3)将步骤2)所得二级种子液加入到由铬液C、碳源、氮源和无机盐组成三级培养基中进行发酵培养，发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加补料培养基，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升控制流加的营养物质，当溶解氧低至15%_35%时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升，在发酵8_12h时补加所述铬液C，发酵完毕后，将所得发酵液离心，收集酵母菌体，破壁，干燥得到所述酵母铬产品； 所述铬液c为浓度为50-250g/L的纳米铬的水溶液； 所述补料培养基由糖蜜和淀粉酶解产生的葡萄糖液组成，且所述糖蜜中的还原糖含量占总还原糖含量的20-60%，总还原糖的浓度为500-800g/L; 所述铬液c的补加量为使发酵体系中纳米铬的终浓度为100-500mg/L。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤I)-步骤3)所述铬液a至铬液c中，纳米络的粒径均为40-7 Onm ； 所述步骤I)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C ;培养方式为振荡培养;培养时间为16-20h;pH{tS5.0-6.0; 所述步骤2)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C;培养时间为10-15h;pH值为5.0-6.0；转速为 200-350r/min ； 所述步骤3)发酵培养步骤中，培养温度为32-36 °C，pH值为5.0-6.0; 所述补加铬液步骤中，补加时间在5_7h内完成； 所述离心步骤中，转速为8000-8500r/min，离心力为7000_8000g； 所述破壁的方法包括如下步骤: 先用复合酶解所述酵母菌体的细胞壁，再进行高压匀浆； 所述复合酶具体为由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种组成； 所述复合酶的用量为每kg酵母菌体用0.1-0.5g所述复合酶； 所述复合酶具体为由质量比为1:4:4的葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶或由质量比为1:8:4:4的葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合酶；所述葡聚糖酶的酶活为30000u/g; 所述溶菌酶的酶活为500000u/g; 所述木瓜蛋白酶的酶活为100000u/g; 所述碱性蛋白酶的酶活为200000u/g; 所述高压匀浆步骤中，压力为40-80Mpa; 所述干燥步骤中，干燥的方法为冷冻干燥，温度具体为O—-50°C，真空度为lOPa，时间为2-4小时。6.—种制备权利要求2或3所述酵母铬产品的方法，包括如下步骤: 1)将权利要求1所述酵母菌菌株GB15活化后于一级种子培养基中进行发酵培养，发酵完毕得到一级种子液； 所述一级种子培养基由络液a和下述两种培养基中的任意一种组成:麦芽汁培养基或Yro培养基； 其中，所述铬液a为浓度为50-80mg/L的纳米铬的水溶液； 2)将步骤I)所得一级种子液加入到由碳源、氮源和无机盐组成的三级培养基中进行发酵培养，发酵开始后，当有乙醇生成，溶解氧上升的时候开始补加补料培养基，并以维持乙醇的量不上升、溶解氧不上升来控制流加的营养物质，当溶解氧低至15%-35 %时，控制营养物质流加量，维持溶氧不上升;在所述发酵培养的同时将铬液d以对数关系递增的速度流加，流加的速度与酵母的生长速度相同，在对数生长期结束时停止流加，将所得发酵液离心，收集酵母菌体，破壁，干燥得到所述酵母铬产品； 所述铬液d为浓度为10-20g/L的纳米铬的水溶液； 所述补料培养基由糖蜜和淀粉酶解产生的葡萄糖液组成，且所述糖蜜中的还原糖含量占总还原糖含量的20-60%，总还原糖的浓度为500-800g/L; 所述铬液d的补加量为使发酵体系中纳米铬的终浓度为100-500mg/L。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述步骤I)-步骤2)所述铬液a和铬液d中，纳米络的粒径均为40-7 Onm ； 所述步骤I)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C ;培养方式为振荡培养;培养时间为16-20h;pH{tS5.0-6.0; 所述步骤2)发酵培养步骤中，培养温度为32-36°C，pH值为5.0-6.0；转速为200_350r/min； 所述离心步骤中，转速为8000-8500r/min，离心力为7000_8000g； 所述破壁的方法包括如下步骤: 先用复合酶解所述酵母菌体的细胞壁，再进行高压匀浆； 所述复合酶具体为由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少两种组成； 所述复合酶的用量为每kg酵母菌体用0.1-0.5g所述复合酶； 所述复合酶具体为由质量比为2:1的溶菌酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶； 所述葡聚糖酶的酶活为30000u/g; 所述溶菌酶的酶活为500000u/g; 所述木瓜蛋白酶的酶活为100000u/g; 所述碱性蛋白酶的酶活为200000u/g; 所述酶解步骤中，酶解的温度为20-500C，时间为1-4小时； 所述高压匀浆步骤中，压力为40-80Mpa;匀浆的次数为1-5次； 所述干燥步骤中，干燥的方法为冷冻干燥，温度具体为O至-50°C，真空度为lOPa，时间为2-4小时。
【文档编号】C12N1/18GK105861347SQ201610349440
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】薛新升, 余奎, 谯仕彦, 张海燕
【申请人】北京龙科方舟生物工程技术有限公司