一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌及其应用
【专利摘要】一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌新种及其应用，所述溶杆菌命名为白粉菌溶杆菌(L.erysipheresistens)RS?Lyso?3，该菌株已于2015年2月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.10517。所述白粉菌溶杆菌RS?Lyso?3应用于烟草白粉病致病菌二孢白粉菌的防治。本发明提供了一直安全高效的可防治烟草白粉病病原菌二孢白粉菌的生防菌，为烟草白粉病的防治提供了可行的生物防治方法。CGMCC No.1051720150204
【专利说明】
一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别是具有烟草白粉病抗性的溶杆菌技术领域。
【背景技术】
[0002] 白粉病由白粉菌科(Erysiphaceae)的微生物浸染植物，并在其表面产生一层"白 粉"而得名。白粉菌科的真菌是植物专性寄生菌，在全世界范围内均有分布，可浸染多种植 物。
[0003] 浸染烟草的白粉病由二孢白粉菌(Erysiphecichoracearum DC)引起。该病多危害 成熟老叶，严重时危害嫩叶，病株茎上也布满白粉。病叶烘烤后薄如纸，色暗褐色，丧失经济 价值。中国各烟区均有发生，其中以华南、西南和华中烟区最为普遍。二孢白粉菌存在着不 同的致病株系，除为害烟草外，还浸染萌芦科、茄科、菊科、蔷薇科、豆科和旋花科等约115个 属的植物。
[0004] 烟草白粉病的防治主要依靠选种、田间管理和化学防治。选种需要较长的开发周 期和高昂的研发费用，田间管理需要农业从业人员具有较高的操作水平，化学农药的使用 则会给环境和其他生物的健康带来巨大的风险。而利用有益微生物防治植物病害的生物农 药具有安全、有效、无污染等特点。目前国家正大力提倡绿色环保的农业种植模式，因而开 发安全高效的抑制烟草白粉病的生物农药具有极大的应用前景。
[0005] 目前用于开发利用的生防菌包括木霉菌属、毛壳菌属、酵母菌属、菌根真菌属、芽 孢杆菌属、假单胞菌属、巴氏杆菌属、链霉菌属及一些病原菌的无致病力菌株。生防菌的生 防作用多种多样，如产生抗菌素、重寄生、溶菌作用、竞争作用和诱导抗性等。因而，不仅可 以将生防菌直接用作生物农药，还可以研究其代谢产物开发新一代生物农药。
[0006] 采用生防菌和白粉寄生孢防治黄瓜白粉病的方法有大量的文献报道，同时已有市 售的商品。说明采用生防菌的方式抑制白粉病对植物的浸染是一种可行的方法。但是对于 烟草白粉病的生物防治却少有报道。溶杆菌属(Lysobacter spp.)的细菌被发现能抑制水 稻白叶枯病、辣椒疫霉病、高羊茅草褐斑病、菜豆锈病、甜菜猝倒病、黄瓜猝倒病和小麦赤霉 病等真菌和细菌浸染的疾病。同时溶杆菌属细菌也被发现能抑制土壤根结线虫。然而溶杆 菌属抑制烟草白粉病的研究也未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于寻找一种能防治烟草白粉病病原菌二孢白粉菌的生防菌，为烟 草白粉病的防治提供一种安全高效的生物防治途径。
[0008] 本发明所述的溶杆菌新种命名为白粉菌溶杆菌RS-LyS〇-3,该菌株已于2015年2月 4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 10517。
[0009] 本发明所述的白粉菌溶杆菌新种RS-Lyso-3应用于烟草白粉病致病菌二孢白粉菌 的防治。
[0010]本发明所述的白粉菌溶杆菌新种RS-Lyso-3的16S rDNA全长1410bp，登录号为 KT001243。
[0011] 本发明提供了一直安全高效的可防治烟草白粉病病原菌二孢白粉菌的生防菌，为 烟草白粉病的防治提供了可行的生物防治方法。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明所述的白粉菌溶杆菌RS-LyS〇-3在2261E培养基上的菌落特征；
[0013]图2为本发明所述的白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0014]本发明采用分离自云南省楚雄市植烟区土壤的一株生防菌一一白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3 作为发酵菌株，进行烟草白粉病的致病菌二孢白粉菌防效的测定。通过液体发酵，实 验室盆栽方式评价白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3对被二孢白粉菌浸染的烟草K326的防效。
[0015] 本发明的溶杆菌命名为白粉菌溶杆菌(L.erysipheresistens)RS-Lyso_3,已经保 藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2015年2月4 日，保藏号是CGMCC No.10517。
[0016] 1、白粉菌溶杆菌新种RS-Lyso-3的鉴定
[0017] 白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的菌落形态:菌体杆状，0.2~0.5μL? X 1.0~2. ΟμL?，革兰 氏阴性，单个或成对排列;菌落浅黄色，极小圆形，半透明，表面有光泽。
[0018] 白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的生理生化特征：生长温度为10~35°C，pH范围是6~8， 在浓度为0~5%的NaCl中能生长。RS-Lyso-3能利用D-葡萄糖作为碳源，对菊糖、苯乙酸和 D-蔗糖的碳源利用实验则呈弱阳性。
[0019] RS-Lyso-3能产生类脂酯酶(C8)、胱氨酸芳胺酶、萘酚-AS-ΒΙ-磷酸水解酶、胰蛋白 酶、氧化酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶和白氨酸芳胺酶;能产生少量的缬氨酸芳胺酶、酸性磷 酸酶、胰凝乳蛋白酶;能水解Tween80和明胶。
[0020] RS-Lyso-3醌组份为：Q-8 (100 % )。极性脂为：心肌磷脂（diphosphatidyl glycerol，DPG)，脑磷脂（phosphatidyl ethanolamine，PE)，磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol，PG)，未知磷脂（unidentif ied phospholipids，UPL)。菌株主要脂肪酸成分（> 10%)*:Ci6:Qiso:34.54%、Ci6:()10-methylSCi7 :iisow9c:13.87%、Ci5:()iso:11.38% 〇(G+ C)mol% :68·0%〇
[0021 ] RS-Lyso-3 的 16S rDNA 全长 1410bp，与亲缘最近的 1^8〇匕&(^618口〇即;[;[(301&1(113291'的同源性仅43 ·6%。
[0022] RS-Lyso-3的生理生化特征、细胞壁组成、GC含量及与亲缘属细菌的DNA杂交数据 表明其代表了溶杆菌属的新种。（Christensen，P.&Cook，F.D · (1978) .Lysobacter，a new genus of nonhiting,gliding bacteria with a high base Ratio.Int J SystEvolMicrobio128,367-393.Lyudmila,A.R.,Masataka,U.Naoto,T.,Galina,M.F.& Valery,V.M.(2008).Lysobacterspongiicola sp.nov., isolated from a deep-sea sponge.Int J SystEvolMicrobiol 58,370-374.Stackebrandt,E.&Goebel,B-M.(1994) .Taxonomic note : a placefor DNA-DNAreassociation and 16S rRNA sequence analysis inthe present species definition in bacteriology.Int J SystBacteriol 44,846-849)
[0023] 2、白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的制备
[0024] 将保存于斜面上的白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3于无菌条件下接种于高压灭菌的装有 固体培养基的试管上（1L的培养基配方为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，硝酸胺 33g，硝酸钾38g，二水合氯化钙8.8g，七水合硫酸镁7.4g，磷酸氢二钾3.4g)，于培养箱中30 °(：活化培养3~4天。
[0025]将活化好的菌种于无菌条件下接种于50mL高压灭菌的上述液体培养基中。30°C 下，摇床培养3~4天。摇床转速200rpm。
[0026]取lmL种子液于无菌条件下接种于200mL高压灭菌的上述液体培养基中，摇床培养 24~36h，转速200rpm，至对数生长期(0D66Q: 0.78)，将菌悬液在室温下，4000rpm离心10min， 分离上清液和菌体，将上清液和重悬于等体积无菌水中的菌体用于生测实验。
[0027] 3、白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的生测实验
[0028] 称取lKg土壤置于内径15cm，高10cm的盆钵中，移栽大棚中生长55~60天的K326烟 苗，同时表施烟草专用复合肥(N-P-K:12-10-24)4g/盆，置于人工气候箱内。培养条件为:光 照时间12h，强度8000lux，温度：白天28 ± 2°C，夜晚22 ± 2°C。
[0029]移栽7天后用采自大田的白粉病病叶接种盆栽烟苗。
[0030]在成功接种白粉病的实验烟上分别叶施等量清水(〇〇、0.04%化学诱导剂3-丙酮 基-3-羟基吲哚(具有较强的白粉菌的抑制作用)水分散粒剂水溶液(AS)、REAS(CM)、经过高 压灭菌的RS-Lyso-3发酵上清液(SQ)、重悬于无菌水中的RS-Lyso-3菌体(G)、重悬于无菌水 中并经过高压灭菌的RS-Lyso-3菌体(CG)，在7天、14天和21天后调查白粉病的发病情况，统 计烟株病叶数及病叶等级，计算防效(调查及计算方法参见GBT 23222-2008)。实验设置6个 处理，每个处理20盆。
[0031] 4、实验结果
[0032] 生测实验表明，RS-Lyso-3的活菌体和上清液对二孢白粉菌（E · cichoracearum DC)均有良好的抗性。在叶面分别喷施活菌体和发酵上清液后，其对白粉菌7天的防效分别 达到74.05%和74.75%，而培养基和灭活的菌体对白粉菌的防效则较弱。另外，白粉菌的防 效会随时间减弱，AS、SQ和G处理至21天时防效降幅达到42~55% (表1)。
[0033]表1不同处理对二孢白粉菌的防效-时间变化表
[0034]
[0035] 白粉菌溶杆菌RS-Lys〇-316S rDNA序列如下：
【主权项】
1. 一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌新种，其特征在于，所述溶杆菌命名为白粉菌溶 杆菌(L. erysipheresistens)RS-Lyso_3，该菌株已于2015年2月4日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 10517。2. 根据权利要求1所述的一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌新种，其特征在于，所述白 粉菌溶杆菌RS-Lyso-3的16S rDNA全长1410bp，登录号为KT001243。3. 根据权利要求1所述的一种具有烟草白粉病抗性的溶杆菌的应用，其特征在于，所述 白粉菌溶杆菌RS-Lyso-3应用于烟草白粉病致病菌二孢白粉菌的防治。
【文档编号】A01P3/00GK105886424SQ201610117840
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月2日
【发明人】吴景强, 谢冰, 刘维娟, 林鑫, 吕春华, 陈云娇, 和忠宏, 张晓龙, 周丽娟, 子瑾
【申请人】云南瑞升烟草技术（集团）有限公司