一种用于去除重金属的好氧异养菌特异胞外聚合物胁迫产生及制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物工程技术和废水处理技术领域，特别涉及胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法。该胞外聚合物的制备方法为：在培养好氧异养菌时，对好氧异养菌进行重金属胁迫应激处理，去除培养基和重金属，去除菌体，获得胞外聚合物。本发明提供的胞外聚合物具有突出的去除特定重金属能力，可用于重金属废水的处理。
【专利说明】
一种用于去除重金属的好氧异养菌特异胞外聚合物胁迫产生及制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术和废水处理技术领域，特别涉及胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法。
【背景技术】
[0002]重金属污染指由重金属或其化合物造成的环境污染，主要由采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属超标制品等人为因素所致。重金属是指比重大于5的金属，包括金、银、铜、铁、铅等。重金属在人体内能和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等，对人体会造成很大的危害，例如，日本发生的水俣病(汞污染)和骨痛病(镉污染)等公害，都是由重金属污染引起的。重金属具有富集性，不会环境中降解。重金属污染是当今我国环境领域中的突出问题。
[0003]重金属废水通常采用化学沉淀等技术处理，但当重金属浓度较低时，效率将大为降低且衍生二次污染。近十几年来，胞外聚合物在处理重金属废水方面的具大潜力逐渐引起人们关注。
[0004]胞外聚合物(ExtracellularPolymeric Substances，EPS)是在一定环境条件下由微生物，主要是细菌，在细胞外产生的高分子聚合物。主要成分与微生物的胞内成分相似，是一些高分子物质，如多聚糖、蛋白质和核酸等聚合物。胞外聚合物中的多聚糖和蛋白质含有丰富的官能团，如羧基、氨基、羟基和羰基等，可以和水中的金属元素进行络合、鳌合，捕捉和吸附水中的重金属。好氧异养菌是一类可以利用多种有机物作为碳源的细菌，广泛存在于土壤和水体中，其胞外聚合物含量丰富。申请号为201010211401.3的专利公布了一种黄孢原毛平革菌胞外聚合物的提取方法，通过培养离心、过滤分离、透析等步骤，基本实现了黄孢原毛平革菌胞外聚合物的提取。
[0005]目前，由菌体直接提取到的胞外聚合物对重金属的去除能力较弱。因此，急需提供一种重金属去除能力强的胞外聚合物及其制备方法。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明提供了一种胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法。该胞外聚合物具有突出的去除特定重金属的能力，可用于重金属废水的处理。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]本发明提供了一种胞外聚合物，其制备方法为:在培养好氧异养菌时，对好氧异养菌进行重金属胁迫应激处理，去除培养基和重金属，去除菌体，获得胞外聚合物。
[0009]本发明利用重金属胁迫机制，有针对性地提高胞外聚合物中某一种或几种化学成分和特定官能团浓度/密度，使其提供大量与重金属结合的配体，形成配合物固定重金属，从而有目的性、方向性地使细菌定向产生具有突出的去除特定重金属能力的胞外聚合物，可用于重金属废水的处理。
[0010]在本发明中，重金属为铜、锌、铅、镉、铬中的一种或几种。但本发明并非限定于此，本领域技术人员认为可行的重金属离子以及重金属化合物均在本发明的保护范围之内。[0011 ]在本发明提供的实施例中，重金属为铜和锌。
[0012]作为优选，重金属的浓度为I?1000mg/L。
[0013]在本发明提供的实施例中，重金属的浓度为5?20mg/L。
[0014]本发明中，胁迫应激处理是指在菌株培养过程中任一时刻加入重金属离子。
[0015]作为优选，胁迫应激处理的时间为I?48h。
[0016]在本发明提供的实施例中，胁迫应激处理的时间为20?24h。
[0017]作为优选，好氧异养菌为死谷芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌。但本发明并非限定于此，本领域技术人员认为可行的好氧异养菌种类均在本发明的保护范围之内。
[0018]作为优选，以体积比计算，好氧异养菌的接种量为I%?10%。
[0019]作为优选，培养好氧异养菌采用的培养基成分包括胰蛋白胨、牛肉浸膏和氯化钠，或者是其它能够为好氧异养菌提供适合生长条件的培养基。
[0020]培养基的pH值为7.2?7.4。
[0021]作为优选，好氧异养菌的培养条件为:培养温度为20?40°C，振荡速度为120?180rpmo
[0022]在本发明提供的实施例中，好氧异养菌的培养条件为:培养温度为35°C，振荡速度为150rpmo
[0023]为了将残留在菌体上的培养基和重金属去除，作为优选，去除培养基和重金属采用离心清洗的操作。
[0024]作为优选，离心清洗为:第一次离心将培养基与菌体分离，取固体部分，用pH低于3.0的水(或具有洗脱重金属功能的其他液体)振荡分散菌体，然后进行第二次离心，取固体部分，用PH为7的水振荡分散菌体，然后进行第三次离心。
[0025]在本发明提供的实施例中，离心清洗具体方法为:第一次离心将培养基与菌体分离，取固体部分，用pH为2.5的蒸馏水振荡分散菌体，然后进行第二次离心，取固体部分，用PH为7的蒸馏水振荡分散菌体，然后进行第三次离心。
[0026]作为优选，离心的温度为O?4°C，转速为4000?6000rpm，离心时间为10?15min。上述离心清洗的目的在于去除残留在菌体上的培养基和重金属，具有相同功能的操作方法视为此方法的变形，同样在本发明保护范围之内。
[0027]在本发明提供的实施例中，离心的温度为4°C，转速为4000rpm，离心时间为lOmin。
[0028]作为优选，去除菌体采用微盐浴热方法，结合高速离心，实现胞外聚合物与菌体的分呙。
[0029]作为优选，去除菌体为:将重金属胁迫应激处理后的好氧异养菌置于盐浓度为
0.5%?1.0%、温度为70?80°C的条件下处理100?120min，离心，盐为氯化钠。
[0030]作为优选，温度为70?80°C的条件采用水浴加热的方式获得。
[0031]在本发明提供的实施例中，去除菌体为:将重金属胁迫应激处理后的好氧异养菌置于盐浓度为0.85%、温度为80°C的条件下处理120min，离心。
[0032]作为优选，去除菌体过程中的离心的温度为O?4°C，转速为10000?15000rpm，离心时间为15?20min。
[0033]在本发明提供的实施例中，去除菌体过程中的离心的温度为4°C，转速为12000rpm，离心时间为20min。
[0034]上述盐、热及离心的目的在于实现胞外聚合物与菌体分离，具有相同功能的操作方法视为此方法的变形，同样在本发明保护范围之内。
[0035]作为优选，在去除菌体后还包括过滤、浓缩、真空冷冻干燥的步骤。
[0036]作为优选，过滤是用孔径小于或等于0.45μπι微孔滤膜过滤。
[0037]在本发明提供的实施例中，微孔滤膜的孔径为0.22μπι。
[0038]作为优选，浓缩的温度不超过80°C。
[0039]在本发明提供的实施例中，浓缩至原体积的1/10。
[0040]作为优选，真空冷冻干燥的干燥压力小于0.2Mpa，干燥温度为_40?-60 °C。
[0041]在本发明提供的实施例中，真空冷冻干燥的干燥压力为0.1Mpa，干燥温度为-50Γ。
[0042]本发明还提供了一种重金属处理剂，包括本发明提供的胞外聚合物。
[0043]本发明还提供了一种重金属的处理方法，包括将本发明提供的胞外聚合物或本发明提供的重金属处理剂添加到含重金属的废水中。
[0044]作为优选，废水中的重金属为铜、锌、铅、镉或铬中的一种或几种。
[0045]本发明提供了一种胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法。该胞外聚合物的制备方法为:在培养好氧异养菌时，对好氧异养菌进行重金属胁迫应激处理，去除培养基和重金属，去除菌体，获得胞外聚合物。与现有技术相比，本发明具有如下优势之一:
[0046]1、以重金属为胁迫因子，有效诱导好氧异养菌产生特异胞外聚合物。重金属胁迫因子可以改变好氧异养菌胞外聚合物的产生机制，导致好氧异养菌产生不同于常规培养得到的胞外聚合物，主要表现在胞外聚合物产量的增加及其化学成分的改变，其中多聚糖与蛋白质的比例不同于未受重金属胁迫的菌体，所产生的胞外聚合物能够结合更多重金属，这类胞外聚合物具有突出去除特定重金属的功能；
[0047]2、本发明制备胞外聚合物的方法具有操作简单、可靠、有效、环境友好等优点，可制成生物制剂用于重金属废水的处理；
[0048]3、本发明提供的胞外聚合物中的化学成分还因所用重金属胁迫因子的种类和浓度而异。
【附图说明】
[0049]图1为本发明实施例1中死谷芽孢杆菌胞外聚合物产量随Cu2+胁迫浓度变化的柱状图；
[0050]图2为本发明实施例2中铜绿假单胞菌胞外聚合物产量随Zn2+胁迫浓度变化的柱状图。
【具体实施方式】
[0051 ]本发明公开了胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明之内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，实现和应用本发明技术。
[0052]本发明中好氧异养菌是指:一方面这类菌在同化作用的过程中，不能直接利用无机物制成有机物，只能把从外界摄取的现成的有机物转变成自身的组成物质，并储存了能量，这种新陈代谢类型叫做异养型。另一方面，这类菌为好气性细菌，必须在有氧环境中生存，产能代谢过程以分子氧为最终电子受体，进行有氧呼吸。培养时需进行振荡，搅拌或通气，以供给充足的氧气。
[0053]本发明提供的胞外聚合物、重金属处理剂及重金属处理方法中所用菌株、金属化合物、培养基、其它试剂等均可由市场购得。
[0054]本发明所需器皿和试剂均需灭菌处理，所用溶液均用无菌水配置。
[0055]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0056]实施例1胞外聚合物的制备
[0057]本实施例中选用死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis sp.，属于好氧异养菌，由实验室分离纯化获得)。胞外聚合物的具体制备步骤如下:
[0058]将保存在-20°C的死谷芽孢杆菌取出，解冻，经活化并富集制成死谷芽孢杆菌悬液。按5 %接种量将菌悬液分别接种到5只含有I OOmL液体培养基(液体培养基在121°C下高压灭菌30min)的锥形瓶中，同时向液体培养基注入一定体积已灭菌的Cu2+母液，使5只锥形瓶中的Cu2+浓度分别为O、5、10、15、20mg/L，并于35°C、150rpm条件下进行Cu2+胁迫培养24h。将上述不同Cu2+浓度胁迫培养后的死谷芽孢杆菌培养物进行第一次离心将营养分与菌体分离，取固体部分，加入pH为2.5的无菌水，振荡分散菌体，进行第二次离心，取固体部分加入PH为7的无菌水，振荡分散菌体，进行第三次离心；上述三次离心的温度为4°C，转速为4000rpm，离心时间为I Omin。将第三次离心得到的不同Cu2+浓度胁迫后的菌体沉淀物分别溶于一定体积的无菌水，得到的死谷芽孢杆菌悬液，加入微量NaCl，轻轻搅拌，使各菌悬液中的NaCl浓度为0.85%，在80°(:的热水中加热12011^11后在4°(:、12000印111下离心201^11，收集到的上清液用0.22μπι滤膜过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，浓缩液进行真空冷冻干燥，最终得到死谷芽孢杆菌在不同Cu2+浓度胁迫后产生的特异胞外聚合物。
[0059]用蒸馏水溶解本实施例制备的特异胞外聚合物，用蒽酮比色法测定多聚糖含量，用考马斯亮蓝G-250法蛋白质含量，多聚糖和蛋白质共同表征胞外聚合物的组成，测定结果如图1所示。
[0060]由图1可以看出，与没有Cu2+(0mg/L)胁迫得到的胞外聚合物相比，在不同浓度的Cu2+胁迫下，死谷芽孢杆菌产生的特异胞外聚合物中，蛋白质含量均随Cu2+胁迫浓度增加，但多聚糖的变化趋势则不明显，总体而言，特异胞外聚合物总量随胁迫因子浓度呈上升趋势。
[0061 ]量取上述死谷芽孢杆菌在20mg/LCu2+胁迫下产生的特异胞外聚合物溶于5mL去离子水中，加到10011^、(]112+浓度为6511^凡的废水中，在150rpm下振荡3h，然后将混合物装进截留分子量为1000kDa透析袋中用去离子水透析12h，实验用相同量的没有经过Cu2+胁迫的死谷芽孢杆菌所产生的胞外聚合物做空白样，用火焰原子吸收分光光度计测定透析后的Cu2+浓度。
[0062]结果显示，死谷芽孢杆菌在Cu2+胁迫下产生的特异胞外聚合物对Cu2+的去除率达到96%，而空白样的去除率仅为62%。可见，死谷芽孢杆菌在Cu2+胁迫下产生的胞外聚合物对低浓度的Cu2+表现出良好的去除效果。
[0063]实施例2胞外聚合物的制备
[0064]本实施例中选用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，属于好氧异养菌，由市场购得)。胞外聚合物的具体制备步骤如下:
[0065]将保存在-20°C的铜绿假单胞菌取出，解冻，经活化并富集制成铜绿假单胞菌悬液。按5 %接种量将菌悬液分别接种到5只含有I OOmL液体培养基(液体培养基在121°C下高压灭菌30min)的锥形瓶中，培养4h后，同时向液体培养基注入一定体积已灭菌的锌离子母液，使5只锥形瓶中的锌离子浓度分别为0、5、10、15、20mg/L，并于35°C、150rpm条件下进行的锌离子胁迫培养20h。将上述不同的锌离子浓度胁迫培养后的铜绿假单胞菌培养物进行第一次离心将营养分与菌体分离，取固体部分，加入pH为2.5的无菌水，振荡分散菌体，进行第二次离心，取固体部分加入pH为7的无菌水，振荡分散菌体，进行第三次离心;上述三次离心的温度为4°C，转速为4000rpm，离心时间为lOmin。将第三次离心得到的不同的锌离子浓度胁迫后的菌体沉淀物分别溶于一定体积的无菌水，得到的铜绿假单胞菌悬液，加入微量NaCl，轻轻搅拌，使各菌悬液中的NaCl浓度为0.85%,在80 °C的热水中加热120min后在4 °C、12000rpm下离心20min，收集到的上清液用0.22μηι滤膜过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，浓缩液进行真空冷冻干燥，最终得到铜绿假单胞菌在不同锌离子浓度胁迫后产生的特异胞外聚合物。
[0066]用蒸馏水溶解本实施例制备的特异胞外聚合物，用蒽酮比色法测定多聚糖含量，用考马斯亮蓝G-250法蛋白质含量，多聚糖和蛋白质共同表征胞外聚合物的组成，测定结果如图2所示。
[0067]在Zn2+浓度为O?20mg/L范围内，EPS产量随Zn2+胁迫浓度逐渐增加，与没有经过Zn2+胁迫的空白样相比，产量最高增长了57.71%。当Zn2+胁迫浓度超过15mg/L后，EPS产量有下降趋势。EPS中蛋白质数量变化不明显，但变化趋势与多聚糖相似，含量最高同样出现在Zn2+胁迫浓度为15mg/L时。纵观Zn2+胁迫浓度对铜绿假单胞菌胞外聚合物产量的影响，在一定胁迫浓度范围内，Zn2+对胞外聚合物的产量有促进作用。
[0068]量取上述铜绿假单胞菌在15mg/LZn2+胁迫下产生的特异胞外聚合物溶于5mL去离子水中，加到100mL、Zn2+浓度为50mg/L的废水中，在150rpm下振荡3h，然后将混合物装进截留分子量为1000kDa透析袋中用去离子水透析12h，实验用相同量的没有经过Zn2+胁迫的铜绿假单胞菌所产生的胞外聚合物做空白样，用火焰原子吸收分光光度计测定透析后的Zn2+浓度。
[0069]铜绿假单胞菌在Zn2+胁迫下产生的特异胞外聚合物对Zn2+的去除率达到91.5%，没有进行胁迫培养得到的胞外聚合物对Zn2+的去除率为68%。
[0070]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种胞外聚合物，其特征在于，其制备方法为:在培养好氧异养菌时，对好氧异养菌进行重金属胁迫应激处理，去除培养基和重金属，去除菌体，获得胞外聚合物。2.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述重金属为铜、锌、铅、镉、铬中的一种或几种，重金属浓度为I?1000mg/L。3.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述胁迫应激处理的时间为I?48h04.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述好氧异养菌为死谷芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌。5.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述好氧异养菌的培养条件为:培养温度为20?40°C，振荡速度为120?180rpm。6.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述去除培养基和重金属采用离心清洗，所述离心清洗为:第一次离心将培养基与菌体分离，取固体部分，用PH低于3.0的蒸馏水振荡分散菌体，然后进行第二次离心，取固体部分，用PH为7的蒸馏水振荡分散菌体，然后进行第三次离心。7.根据权利要求1所述的胞外聚合物，其特征在于，所述去除菌体为:将重金属胁迫应激处理后的好氧异养菌置于盐浓度为0.5%?1.0%、温度为70?80°C的条件下处理100?120min，离心。8.根据权利要求1至7中任一项所述的胞外聚合物，其特征在于，在去除菌体后还包括过滤、浓缩、真空冷冻干燥步骤。9.一种重金属处理剂，其特征在于，包括如权利要求1至8中任一项所述胞外聚合物。10.—种重金属废水处理方法，其特征在于，包括将权利要求1至8中任一项所述胞外聚合物或权利要求9所述重金属处理剂添加到含重金属的废水中，废水中的重金属为铜、锌、铅、镉或铬中的一种或几种。
【文档编号】C02F3/34GK105886580SQ201610317365
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】宋卫锋, 简静仪, 李海宇, 董明, 杨梓亨
【申请人】广东工业大学