一种地衣芽孢杆菌的提纯方法
【专利摘要】本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：(1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种，制成均匀菌悬液，5?7℃保存备用；(2)将第一培养基加入二号三角瓶中，摇床培养，得到菌种；(3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5?10min，冷却到室温，凝固待用；(4)第二培养基融化，并涂布于平板上，再将菌种在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；(5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。本发明对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长性能。
【专利说明】
_种地衣芽孢杆菌的提纯方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及微生物技术领域，具体为一种地衣芽孢杆菌的提纯方法。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌属(Bacillus Cohn ,1872)，细胞呈直杆状，0.5~5μπιΧ 1.2~ΙΟμπι，常 以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生 鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被 氧所抑制;好氧或兼性厌氧，具有对热、Ρ Η和盐等不同环境的耐受性。它属于化能异养菌， 具发酵或呼吸代谢类型，通常接触酶阳性。芽孢杆菌属发现于不同的环境，少数种对脊椎动 物和非脊椎动物致病。芽孢杆菌属是一群好氧和兼性厌氧生活，产耐热性内生孢子的杆状 细菌。它的营养细胞具有活跃的酶活性和多样的代谢类型，从而被广泛应用于生产各种酶 制剂、杀虫剂、抗生素和生物添加剂等。它还具有处于休眠期的内生孢子和营养细胞交替的 生长周期，可作为研究细菌分化的重要材料，而作为典型种的枯草芽孢杆菌又是分子生物 学研究的重要材料之一。
[0003] 芽孢杆菌属中存在很多特殊功能的菌株，在工业、农业、医学、军事和科学研究中 都有广泛的应用价值。有的可以在高渗、高酸、高碱、高温、高寒的环境下良好生长，有较大 的生态学价值;有的可分泌多种酶类，应用于酶制剂工业;有的可作为多种蛋白基因表达受 体，在基因工程和生物学研究领域中有较高的应用价值;除极个别的菌种外，多数菌种与动 物，植物关系密切并与其形成良好的共生体系，可以将其应用于益生菌制剂，微生物肥料的 生产;有的菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白，用于微生物农药的生产;炭疽芽孢杆菌用于 生物武器显示其重要的军事意义。
[0004] 但是，目前并没有一种合理的方法实现地衣芽孢杆菌的提纯，导致微生物菌的纯 度很低，影响了后续的使用。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题在于提供一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，从而解决上述
【背景技术】中的问题。
[0006] 本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
[0007] -种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
[0008] (1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35Γ培养19_25h，然后取培 养好的斜面，加入10_15mL无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生 理盐水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35mL无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中 放入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7 °C保存备用；
[0009] (2)取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.3MP灭菌23-27min，然后将步骤（1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4% (V/V)(菌悬液与培养基的体积比），接种后将二号三角瓶于35-37°C，振荡28-35h，摇床转速 为120_145r/min，得到菌种；
[0010] (3)取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室 温，凝固待用；
[0011] (4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种 在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化；
[0012] (5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。
[0013] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述营养珠包括以下重量份的原料制备而 成:胰蛋白胨1-1 · 5、酵母浸出粉0 · 7-0 · 9、NaCl 1 · 2-1 · 3; pH为7 · 3。
[0014] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述第一培养基包括以下重量份的原料制 备而成:蛋白胨5-7,牛肉膏4-5，NaCl 5-7。
[0015] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述第二培养基包括以下重量份的原料制 备而成:葡萄糖2.5-2.7、豆芽浸汁25-27、酵母浸粉0.8-1.2;p H7.0。
[0016] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)的划线培养，其步骤如下：
[0017] A.融化培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
[0018] B.倒平板:待培养基冷却至50 °C左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15ml )，平 置，待凝固。
[0019] 倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或 瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管 (瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角 瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近 打开一缝，迅速例入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均勾分布在培养皿底 部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
[0020] C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间 的交角应为120°C左右(平板转动一定角度约60°C)，以便充分利用整个平板的面积，而且采 用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
[0021] D.划线操作
[0022] (1)挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
[0023] (2)划A区：将平板倒置于煤气（酒精)灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌 面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁），右手拿接种环先在A区划 3-4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残 菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿 盖上方(不要放入皿盖内），以防止杂菌的污染。
[0024] (3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到 上方，接种环通过A区（菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划 线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免 极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环 上的残菌。
[0025] E.恒温培养:将划线平板倒置，于37°C (或28°C)培养，24h后观察。
[0026] F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
[0027] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(5)的培育方法，其步骤如下:采用 300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3:1.4,装液量73-78%，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯 化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7-9 %，温度30~34 °C，罐压0.13-0.17MPa，搅拌转 速100-120r/min。其中，摇瓶培养时，摇瓶内培养基包括玉米粉3-5重量份，豆饼粉4-6重量 份，营养盐适量，pH 6.6~6.8。
[0028] 由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
[0029] 本发明通过对市售的地衣芽孢杆菌菌种进行培养、扩大，适应之后，进行进一步的 分离纯化，提高了纯化的成功率，使得纯化的地衣芽孢杆菌菌种充分表现出其较佳的生长 性能，经过本发明纯化后的地衣芽孢杆菌菌种，在进行步骤(5)的扩大培育后，检测营养液 内含活菌量(地衣芽孢杆菌)达到3.5 X 101QCFU/m L。
【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0031] 实施例1
[0032] -种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
[0033] (1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31°C培养19h，然后取培养好的 斜面，加入l〇m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然 后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营 养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成:胰蛋白胨1、酵母浸出粉〇 .7、NaCl 1.2;pH为 7.3)，然后在摇床上以100r/min的速度振荡25min，制成均匀菌悬液，5°C保存备用；
[0034] (2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成:蛋白胨5,牛肉膏 4，NaCl 5)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0 . IMP灭菌23min，然后将步骤（1)得到 的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3% (V/V)(菌悬液与培养基的体积 比），接种后将二号三角瓶于35°C，振荡28h，摇床转速为120r/min，得到菌种；
[0035] (3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成:葡萄糖2.5、豆芽 浸汁25、酵母浸粉0.8 ;p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5min，冷却到室 温，凝固待用；
[0036] (4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种 在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化;划线培养的步骤如下：
[0037] A.融化培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
[0038] B.倒平板:待培养基冷却至50°C，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15ml)，平置，待 凝固。
[0039]倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或 瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管 (瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角 瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近 打开一缝，迅速例入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均勾分布在培养皿底 部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
[0040] C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间 的交角应为120°C左右(平板转动一定角度约60°C)，以便充分利用整个平板的面积，而且采 用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
[0041 ] D.划线操作
[0042] D1.挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
[0043] D2.划A区：将平板倒置于煤气（酒精)灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌 面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁），右手拿接种环先在A区划 3-4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残 菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿 盖上方(不要放入皿盖内），以防止杂菌的污染。
[0044] D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到 上方，接种环通过A区（菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划 线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免 极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环 上的残菌。
[0045] E.恒温培养:将划线平板倒置，于37°C (或28°C)培养，24h后观察。
[0046] F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
[0047] (5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育，其步骤为:采用300L不锈钢发酵 罐，高径比为2.3:1.4，装液量73 %，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培 养，然后接种，接种量7%，温度30°C，罐压0.13MPa，搅拌转速100r/min。其中，摇瓶培养时， 摇瓶内培养基包括玉米粉3重量份，豆饼粉4重量份，营养盐适量，pH 6.6。
[0048] 实施例2
[0049] -种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
[0050] (1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于33°C培养20h，然后取培养好的 斜面，加入12m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然 后将无菌生理盐水倾注于另一盛有34m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营 养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成:胰蛋白胨1.3、酵母浸出粉0.8、NaCl 1.3; pH 为7.3)，然后在摇床上以120以11^11的速度振荡261^11，制成均匀菌悬液，6°(：保存备用；
[0051] (2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成:蛋白胨6,牛肉膏 4.5，NaCl 6)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.2MP灭菌25min，然后将步骤（1)得 到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3.5% (V/V)(菌悬液与培养基的 体积比），接种后将二号三角瓶于36°C，振荡30h，摇床转速为130r/min，得到菌种；
[0052] (3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成:葡萄糖2.6、豆芽 浸汁26、酵母浸粉1.0 ;p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8min，冷却到室 温，凝固待用；
[0053] (4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种 在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化;划线培养的步骤如下：
[0054] A.融化培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
[0055] B.倒平板:待培养基冷却至50°C左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15ml)，平 置，待凝固。
[0056]倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或 瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管 (瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角 瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近 打开一缝，迅速例入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均勾分布在培养皿底 部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
[0057] C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间 的交角应为120°C左右(平板转动一定角度约60°C)，以便充分利用整个平板的面积，而且采 用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
[0058] D.划线操作
[0059] D1.挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
[0060] D2.划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌 面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁），右手拿接种环先在A区划 3-4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残 菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿 盖上方(不要放入皿盖内），以防止杂菌的污染。
[0061 ] D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到 上方，接种环通过A区（菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划 线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免 极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环 上的残菌。
[0062] E.恒温培养:将划线平板倒置，于37°C (或28°C)培养，24h后观察。
[0063] F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
[0064] (5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育，其步骤为:采用300L不锈钢发酵 罐，高径比为2.3:1.4，装液量75 %，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培 养，然后接种，接种量8%，温度33°C，罐压0.15MPa，搅拌转速115r/min。其中，摇瓶培养时， 摇瓶内培养基包括玉米粉4重量份，豆饼粉5重量份，营养盐适量，pH 6.7。
[0065] 实施例3
[0066] -种地衣芽孢杆菌的提纯方法，包括如下步骤：
[0067] (1)取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于35°C培养25h，然后取培养好的 斜面，加入15m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐水，然 后将无菌生理盐水倾注于另一盛有35m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放入四粒营 养珠(营养珠包括以下重量份的原料制备而成:胰蛋白胨1.5、酵母浸出粉0.9、NaCl 1.3; pH 为7.3)，然后在摇床上以130以11^11的速度振荡271^11，制成均匀菌悬液，7°(：保存备用；
[0068] (2)取第一培养基(第一培养基包括以下重量份的原料制备而成:蛋白胨7,牛肉膏 5，NaCl 7)，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.3MP灭菌27min，然后将步骤（1)得到 的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按4% (V/V)(菌悬液与培养基的体积 比），接种后将二号三角瓶于37°C，振荡35h，摇床转速为145r/min，得到菌种；
[0069] (3)取第二培养基(第二培养基包括以下重量份的原料制备而成:葡萄糖2.7、豆芽 浸汁27、酵母浸粉1.2;p H7.0)，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸lOmin，冷却到室 温，凝固待用；
[0070] (4)将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种 在平板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化;划线培养的步骤如下：
[0071] A.融化培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
[0072] B.倒平板:待培养基冷却至50°C左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15ml)，平 置，待凝固。
[0073] 倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或 瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰;然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管 (瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角 瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近 打开一缝，迅速例入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均勾分布在培养皿底 部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
[0074] C.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间 的交角应为120°C左右(平板转动一定角度约60°C)，以便充分利用整个平板的面积，而且采 用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
[0075] D.划线操作
[0076] D1.挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
[0077] D2.划A区：将平板倒置于煤气（酒精)灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌 面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁），右手拿接种环先在A区划 3-4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残 菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿 盖上方(不要放入皿盖内），以防止杂菌的污染。
[0078] D3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到 上方，接种环通过A区（菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划 线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免 极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环 上的残菌。
[0079] E.恒温培养:将划线平板倒置，于37°C (或28°C)培养，24h后观察。
[0080] F.取生长态势最为优秀的菌落，作为纯化后的菌种，进行后续的培育。
[0081] (5)将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育，其步骤为:采用300L不锈钢发酵 罐，高径比为2.3:1.4，装液量78 %，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培 养，然后接种，接种量9%，温度34°C，罐压0.17MPa，搅拌转速120r/min。其中，摇瓶培养时， 摇瓶内培养基包括玉米粉5重量份，豆饼粉6重量份，营养盐适量，pH 6.8。
[0082]对比实施例
[0083]采用市售的地衣芽孢杆菌菌种，直接进行扩大培育:采用300L不锈钢发酵罐，高径 比为2.3:1.4,装液量78%，培养周期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接 种，接种量9 %，温度34°C，罐压0.17MPa，搅拌转速120r/min。
[0084] 实验结果如下：
[0086]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【主权项】
1. 一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于:包括如下步骤： (1) 取地衣芽孢杆菌菌种，接种至新鲜试管斜面，于31-35Γ培养19-25h，然后取培养好 的斜面，加入l〇-15m L无菌生理盐水，用接种环将斜面上的菌苔轻轻刮下，振荡无菌生理盐 水，然后将无菌生理盐水倾注于另一盛有30-35m L无菌生理盐水的一号三角瓶中，瓶中放 入四粒营养珠，然后在摇床上以100-130r/min的速度振荡25-27min，制成均匀菌悬液，5-7 °C保存备用； (2) 取第一培养基，并将培养基加入二号三角瓶中，加塞后，0.1-0.31^灭菌23-2711^11， 然后将步骤（1)得到的均匀菌悬液接种到二号三角瓶的培养基中，接种量按3-4%，接种后 将二号三角瓶于35-37°C，振荡28-35h，摇床转速为120-145r/min，得到菌种； (3) 取第二培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸5-10min，冷却到室温，凝 固待用； (4) 将步骤(3)得到的第二培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(2)得到的菌种在平 板上进行划线培养，将地衣芽孢杆菌进行分离、纯化； (5) 将分离、纯化得到的地衣芽孢杆菌进行培育。2. 根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于:所述营养珠包括 以下重量份的原料制备而成：胰蛋白胨1 -1.5、酵母浸出粉O . 7-0.9、NaCl 1.2-1.3 ; pH为 7.3。3. 根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于:所述第一培养基 包括以下重量份的原料制备而成:蛋白胨5-7，牛肉膏4-5，NaCl 5-7。4. 根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于:所述第二培养基 包括以下重量份的原料制备而成：葡萄糖2.5-2.7、豆芽浸汁25-27、酵母浸粉0.8-1.2 ;p H7.0〇5. 根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌的提纯方法，其特征在于:所述步骤(5)的 培育方法，其步骤如下:采用300L不锈钢发酵罐，高径比为2.3:1.4，装液量73-78%，培养周 期90h，将步骤(4)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量7-9%，温度30~34°C， 罐压0 · 13-0 · 17MPa，搅拌转速 100-120r/min。
【文档编号】C12R1/10GK105886445SQ201610489624
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】刘亚民
【申请人】山东中创亿丰肥料集团有限公司