一种具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂及其制备方法以及应用
【专利摘要】本发明提供了一种制备具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂的方法，所述方法包括：(1)分别培养枯草芽孢杆菌(Bacillus substils)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和叶杆菌(Phyllobacterium sp)，获得各自的悬液；(2)将各菌种悬液混合均匀，从而获得混合菌悬液；和(3)将所述混合菌悬液的粘度调节为大于或者等于2000mPa·s，从而获得所述复合微生物菌剂。本发明还提供了由所述方法制得的复合微生物菌剂以及所述复合微生物菌剂在水果保护中的应用。本发明解决了水果生产过程中由于套袋所导致的资源浪费和环境污染等问题，同时，其显著的生防效果使农药的使用量大幅度减少，为发展绿色农业提供新型、环保、安全、高效的果业生产模式。
【专利说明】
一种具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂及其制备方法 以及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及属于生物防治领域，具体涉及一种具有生物抗性和成膜性的复合微生 物菌剂及其制备方法和在水果防护中的应用。
【背景技术】
[0002] 现代水果产业中，由于病害感染所致的作物减产和过量使用化学农药带来的环境 恶化及食品安全危机等问题是危害人类健康、制约农业可持续发展的重要障碍。其中，对水 果病害的防治是核心问题。
[0003] 当前，国内大都采用喷施化学农药和给果实套袋等技术方法来防治病害。但这些 方法仍存在下列问题:化学农药虽然可有效抑制病菌的感染，但长期、过量的使用不仅会对 环境造成污染，作物表面残留的农药还会威胁食品安全和损害人类健康。此外，长期使用还 容易导致真菌产生抗药性而给农业生产带来许多新的难题。为降低农药对果品的直接污染 并保护果实免受外界各种因素的损伤，基于物理防治的套袋技术是当前苹果生产中广泛使 用的方法。但该方法也存在很多缺点：首先，套袋会导致果实在生长期无法接受光照，使糖 分等有机质合成量减少，进而影响到果实的口感和品质，降低其商品价值。其次，由于当前 套袋、去袋的操作多采用人工进行，这既增大了人工需求量，也增加了生产成本。此外，由于 套袋无法反复使用，用后均做焚烧处理，造成巨大的资源浪费和环境污染。因此，寻找一种 安全、有效和经济实用的方法，使其既能有效防治病害，又可保证果品安全、提高果品质量 并降低生产成本，已成为绿色高效水果产业可持续发展过程中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 为克服上述问题，本发明的目的是提供一种具有生物抗性和成膜性的复合微生物 菌剂及其制备方法和在水果防护中的应用。将所述复合微生物菌剂喷施于果实上，可以替 代传统套袋的方法，能够有效地防治病害，又可保证果品安全、提高果品质量。
[0005] 本发明的原理是:在对水果减产的主要病害的长期研究中，本发明人发现了可以 高效抑制各种真菌性病害的生防菌和可产胞外多糖的产糖菌。本发明人将所获生防菌和产 糖菌进行科学复配并制成复合微生物菌剂，从而能够有效发挥它们的协同效应。所述复合 微生物菌剂在发酵过程中可代谢产生各种生物活性物质。这些物质在有效抑制病菌的侵染 和增强作物抗性的同时，还具有良好的成膜性、透气性和延展性，将其喷洒于水果表面可迅 速在果面形成一层薄的半透膜，即可固定复合微生物拮抗菌液，又可防止果实表皮受损；同 时，其透气性使得果实可正常接收光照和呼吸，对果实生长及品质无影响。因此，采用本发 明即可达到安全、有效的防治目标。
[0006] 本发明在第一方面提供了一种制备具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂的 方法，所述方法包括：（1)分别培养枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus substi 1 s)、解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)和叶杆菌（Phyllobacterium sp)，获得枯草芽抱杆菌悬 液、解淀粉芽孢杆菌悬液和叶杆菌悬液;和(2)将所述枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽孢杆菌 悬液和叶杆菌悬液混合均匀，从而获得混合菌悬液；
[0007] (3)将所述混合菌悬液的粘度调节为大于或者等于2000mPa · S，例如2000至 3000mPa · s，从而获得所述复合微生物菌剂。
[0008] 本发明在第二方面提供了由本发明第一方面所述的方法制得的复合微生物菌剂。
[0009] 本发明在第三方面提供了本发明第二方面所述的复合微生物菌剂在水果保护中 的应用。
[0010] 本发明具有下列优点：
[0011] 1、防治效果好、安全性能高
[0012] 本发明提供的复合微生物菌剂具有生物抗性和成膜性，并且具有安全、无毒的特 定，在应用水果果实保护时既可保证防治效果，又可保证水果的安全。
[0013] 2、7K果果实品质好、产量高
[0014] 本发明所述的复合微生物菌剂具有产糖量高、产糖周期短、成膜性好和性能稳定 等特点和优点，而且成膜后具有良好透气性和延展性，不仅可迅速成膜以有效固定抗性物 质，又可在果实表面形成保护层以防止果实表皮受损，同时，其透气性使得果实可正常接收 光照和呼吸，有助于提高作物产量和品质。
[0015] 3、安全无毒无污染、可持续发展
[0016] 本发明的复合微生物菌剂所形成的生物抗性膜安全无毒可食用，既不会污染环 境，也不会损害人体健康。该发明的使用可有效保护生态环境、保障食品安全，。
[0017] 4、降低生产成本
[0018] 本发明所述的复合微生物菌剂易于田间操作，整个操作过程对人力的需求量极 小，因而使生产成本大幅度降低。
[0019] 5、有助于生态农业的建立
[0020] 由本发明所述的复合微生物菌剂形成的生物膜的性能极为稳定，将其用于水果的 生物防治，既可有效防治病害，又可保证作物的品质和产量。本发明的推广和应用有助于建 立安全、环保、绿色、高效的全新果业生产模式，并可推动生态果业的可持续发展。
【附图说明】
[0021] 图1果树生长状况(左侧为实验组，右侧为套袋对照组）；和
[0022] 图2果实表观(左侧为实验组，右侧为套袋对照组）。
【具体实施方式】
[0023] 如上文所述，本发明在第一方面提供了一种制备具有生物抗性和成膜性的复合微 生物菌剂的方法，所述方法包括：
[0024] (1)分别培养枯草芽孢杆菌(Bacillus substiIs)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus &11171〇119116€3(^6118)和叶杆菌(？11711(^3(^61'；[111118。），获得枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽 孢杆菌悬液和叶杆菌悬液；
[0025] (2)将所述枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽孢杆菌悬液和叶杆菌悬液混合均匀，从而 获得混合菌悬液；
[0026] (3)将所述混合菌悬液的粘度调节为大于或者等于2000mPa · s，从而获得所述复 合微生物菌剂。
[0027] 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的模式菌种，它可代谢产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等 多种活性酶，将其用于动物饲料的制备，可有效促进饲料中营养素的降解，提高其营养吸收 率;此外，它在生长过程中可以产生伊枯草菌素、表面活性素、多粘菌素等抗菌性物质，将其 用于作物的病害防治可有效抑制各类菌原菌的活性并增强作物的系统可诱导抗性。
[0028] 解淀粉芽孢杆菌是一种同枯草芽孢杆菌亲缘关系及其接近的菌株，它分布广、易 培养、抗逆性强、繁殖快且可在生长过程产生大量代谢产物，后者对细菌、真菌具有广谱而 高效的抑制作用。因此，解淀粉芽孢杆菌作为极具应用潜力的生防菌株已成为当前生物防 治植物病害的研究热点。
[0029] 叶杆菌是一种好氧的革兰氏阴性菌，可代谢产生各种多糖形成糖被，将其用于抗 性膜的制备可迅速成膜;此外，该菌不水解淀粉、果胶和纤维素，故该菌的使用不会破坏果 实品质。
[0030] 本发明发现，将这三种菌经科学复配后制备成微生物复合菌剂。所得菌剂具有产 糖量高、产糖周期短、成膜性好和性能稳定等特点和优点，而且成膜后具有良好透气性和延 展性，不仅可迅速成膜以有效固定抗性物质，又可在果实表面形成保护层以防止果实表皮 受损。
[0031] 本申请所用菌种均为已知菌种，可通过常规筛选、商业手段或其它途径获得。
[0032] 在一个实施方案中，可通过商业途径获得本文所述的菌种，例如枯草芽孢杆菌可 以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，可选择地，可从西安紫瑞生物科技有限公司（地 址:陕西省眉县滨河新区眉坞大道东段，邮编:722300)获得上述菌株。
[0033] 在一个实施方案中，可通过商业途径获得本文所述的菌种，例如解淀粉芽孢杆菌 可以是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，可选择地，可从西安紫瑞生物科 技有限公司(地址:陕西省眉县滨河新区眉坞大道东段，邮编:722300)获得上述菌株。
[0034] 在一个实施方案中，可通过商业途径获得本文所述的菌种，例如叶杆菌可以是叶 杆菌(Phyllobacterium sp)，可选择地，可从西安紫瑞生物科技有限公司（地址：陕西省眉 县滨河新区眉坞大道东段，邮编:722300)获得上述菌株。
[0035] 在一些实施方式中，在步骤（1)中，将所述枯草芽孢杆菌、所述解淀粉芽孢杆菌和 所述叶杆菌在35 °C的培养温度分别依次进行72小时的试管培养、72小时的摇瓶培养、72小 时的种子罐培养和72小时的发酵罐培养，从而分别得到所述枯草芽孢杆菌悬液、所述解淀 粉芽孢杆菌悬液和所述叶杆菌悬液。
[0036] 在一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌悬液、所述解淀粉芽孢杆菌悬液和所述叶 杆菌悬液的有效活菌数均为大于或者等于109CFU/mL，例如大于或者等于lX10 9CFU/mL、 5X109CFU/mL、lX101()CFU/mL 或 5X109CFU/mL。
[0037] 在一些实施方式中，所述复合微生物菌剂的有效活菌数为大于或者等于109CFU/ mL，例如大于或者等于 lX109CFU/mL、5X109CFU/mL、lX101QCFU/mLS5X10 9CFU/mL。
[0038] 在一些实施方式中，在步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽孢杆菌悬液 和叶杆菌悬液的体积比为1:1:2~1:1:5，最佳比例为1:1: 4。
[0039] 在一些实施方式中，使用氯化钙溶液和甘油溶液来调节粘度，在一些优选的实施 方式中，所述为1 %的氯化钙溶液(w/v)和/或所述为1 % (w/v)的甘油溶液。
[0040] 本发明在第二方面提供了由本发明第一方面所述的方法制得的复合微生物菌剂。 在一些实施方式中，所述菌剂在30°C以0.5mm的厚度成膜30分钟后所制得的膜具有2Mpa至 3.6Mpa(例如为2、2.5、3、3.6MPa)的粘度和大于或者等于1.2%的伸长率(例如大于或者等 于 1.2、1.4、1.6、1.8 或 2.0 的伸长率）。
[0041] 本发明在第三方面提供了本发明第一方面制得的所述复合微生物菌剂或者本发 明第二方面所述的复合微生物菌剂在水果保护中的应用。
[0042] 本发明对所述复合微生物菌剂的施用方式没有特别的限制，但是在一些优选的实 施方式中，采用喷施的方式施用。在一些更优选的实施方式中，所述复合微生物菌剂在座果 期以20千克/亩的量喷施于果实表面。在一些实施方式中，所述水果选自由苹果和猕猴桃组 成的组。
[0043] 实施例
[0044]以下是本发明的具体实施实例，以对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施 方式不限于此。
[0045] 实施例中是用的枯草芽孢杆菌(Bacillus substiIs)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus 已11171〇1丨9116€3(^6118)和叶杆菌(？11711(^3(^61'；[111118。)从西安紫瑞生物科技有限公司购买 获得。所用培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂， 1000mL水）。
[0046] 实施实例1:复合微生物菌剂的制备
[0047] (1)单菌菌悬液的制备
[0048]将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和叶杆菌在35°C分别依次进行如下培养：
[0049]试管培养-摇瓶培养-发酵罐培养，所用培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基（5g牛 肉膏，l〇g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂，1000mL水），培养时间均为72h，最终分别得到有效活菌 数为109CFU/mL以上的枯草芽孢杆菌菌悬液、解淀粉芽孢杆菌菌悬液和叶杆菌菌悬液。
[0050] (2)混合菌悬液的制备
[0051] 将发酵罐培养所得的所述枯草芽孢杆菌菌悬液、解淀粉芽孢杆菌菌悬液和叶杆菌 菌悬液以1:1:4的体积比混合，搅拌均匀后制备成有效活菌数为1 .OX 109CFU/mL的混合菌 悬液。
[0052] (3)滤液粘度的调节
[0053] 使用浓度为1% (w/v)的CaCl2水溶液，将滤液的粘度调节为2000mPa · s，从而获得 黄褐色的复合微生物菌剂。
[0054] (4)复合微生物菌剂的成膜粘度和伸长率的调节
[0055] 使用质构仪，参照GB 16421 -1996标准，使用浓度为1 %的Cac 12水溶液和1 %的甘 油水液，将所述微生物菌剂在30°C以0.5mm的厚度成膜30分钟后所制得的膜的黏度和伸长 率分别调节为3Mpa和1.5% (w/v)，获得具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂。
[0056]黏度的计算公式如下:TF=F/S
[0057] 其中，TF为黏度(g/cm2);F为待测样品破裂时承受的最大张力(g);S为检验前待测 样品的横截面积(cm 2)
[0058] 伸长率的计算公式如下:E% = (L-L，）X 100%L
[0059]其中，E为断裂伸长率（％ ) ;L-L'是膜断裂时的延伸长度(mm)。
[0060]生物抗性膜产品的主要技术参数如下：
[00611外观:黄褐色溶液；
[0062] 溶液粘度为2500mPa · s;
[0063] 黏度为 2Mpa至 3.6Mpa;
[0064] 伸长率为1.2%;
[0065]成膜温度为30 Γ。
[0066] 实施例2利用实施例1中所制得的具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂喷施 苹果
[0067] 在苹果坐果期即6月15日开始，将具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂以 20Kg/亩的喷施量用喷雾器直接喷洒于果实表面，此后每隔15天喷施一次，连续5次。在当年 的10月底，统计测量病果率、单果重、单株产量，并分别从各处理植株东、西、南、北中五个方 位随机摘取5个果实，测其酸度、Vc含量、硬度等各项指标，就果实品质进行评价。试验均重 复三次，对照为常规套袋保护，袋子从洛川果树研究所购得，对照组套袋时间与首次喷施时 间一致。果实品质调查结果如表1和图1所不。
[0068] 表1果实品质调查结果
[0069]
[0070]结果表明，喷施了本发明的复合微生物菌剂的实验组的果树病害发生情况、单果 重、单株产量等主要技术指标均优于套袋对照果树。苹果套袋技术由于果实在生长期一直 处于无光照状态直接导致果实固形物和糖度生成量降低，而使用实验组的果树在自然条件 下生长果树单株产量增加10.93 % ;果实糖度增加32.6 %，固形物增加17.43 %，未检出任何 农药残留，果品的品质、口感、硬度、保存期等主要技术指标均大大优于套袋果实。
[0071] 实施实例3:利用实施例1中所制得的具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂喷 施猕猴桃
[0072] 以猕猴桃生长期的主要致病菌(猕猴桃细菌性叶枯病病原菌和猕猴桃细菌性溃疡 病病原菌)为指示菌，采用平板对峙法检验生防菌枯草芽孢杆菌(Bacillus substils)和解 淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的抑菌效果。结果显示这两株菌可有效防 治。
[0073]复合微生物菌剂的施用。在猕猴桃坐果期，将生产的复合微生物菌剂以20Kg/亩的 喷适量用喷雾器直接喷洒于果实表面。对照组为常规套袋处理。
[0074]田间防治实验。为期一年的生物膜田间防治结果显示，使用复合微生物菌剂喷施 的实验组果树树势生长、新梢生长量和百叶鲜重、病害发生情况、果实大小均一、商品果率 等主要技术指标均优于套袋对照果树。传统的套袋方法由于果实在生长期一直处于无光照 状态直接导致果实固形物和糖度生成量降低，而使用生物膜的果树在自然条件下生长其叶 绿素增加15 % -25 %，产量增加20 % -35 %。经检测果实糖度增加6 % -12 %，固形物增加4 % -108%，VC增加40%，未检出任何农药残留，果品的品质、口感、硬度、保存期等主要技术指标 均大大优于套袋果实。
【主权项】
1. 一种制备具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 分别培养枯草芽孢杆菌（Baci Ilus substi Is)、解淀粉芽孢杆菌（Baci Ilus &11171〇119116€3(^6118)和叶杆菌(？11711(^3(^61'；[111118。），获得枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽 孢杆菌悬液和叶杆菌悬液;和 (2) 将所述枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽孢杆菌悬液和叶杆菌悬液混合均匀，从而获得 混合菌悬液； (3) 将所述混合菌悬液的粘度调节为大于或者等于2000mPa · s，从而获得所述复合微 生物菌剂。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中，将所述枯草芽孢杆菌、所述 解淀粉芽孢杆菌和所述叶杆菌在35 °C的培养温度分别依次进行72小时的试管培养、72小时 的摇瓶培养、72小时的种子罐培养和72小时的发酵罐培养，从而分别得到所述枯草芽孢杆 菌悬液、所述解淀粉芽孢杆菌悬液和所述叶杆菌悬液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌悬液、所述解淀粉芽孢 杆菌悬液和所述叶杆菌悬液的有效活菌数均为大于或者等于10 9CFU/mL。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合微生物菌剂的有效活菌数为大于 或者等于109CFU/mL。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌悬液、解 淀粉芽孢杆菌悬液和叶杆菌悬液的体积比为1:1: 4。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 在步骤(2)之前对所述枯草芽孢杆菌悬液、解淀粉芽孢杆菌悬液和叶杆菌悬液分别进 行浆渣分离的步骤;和/或 在步骤(2)之后并且在步骤(3)之前对所述混合菌悬液进行浆渣分离的步骤。7. 由权利要求1至6中任一项所述的方法制得的复合微生物菌剂。8. 根据权利要求7所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂在30°C以O . 5mm的厚 度成膜30分钟后所制得的膜具有2Mpa至3.6Mpa的粘度和大于或者等于1.2%的伸长率。9. 权利要求7或8所述的复合微生物菌剂在水果保护中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复合微生物菌剂在座果期以20千克/ 亩的量喷施于果实表面。
【文档编号】C12R1/125GK105886435SQ201610305515
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】陈五岭, 付瑞敏
【申请人】陈五岭