一种异源生物合成香豆醇，咖啡醇及阿魏醇的方法
【专利摘要】一种异源生物合成香豆醇，咖啡醇及阿魏醇的方法涉及生物技术领域。宿主中分别导入了香豆醇、咖啡醇、阿魏醇生产的代谢途径。更确切的说，是在宿主中高效表达了酪氨酸解氨酶，肉桂酰辅酶A还原酶，醇脱氢酶，香豆酰辅酶A连接酶来生产香豆醇，再加入4?羟基苯乙酸3?单加氧酶来生产咖啡醇，再加入咖啡酰辅酶A O?甲基转移酶或咖啡酸O?甲基转移酶来生产阿魏醇。将酶所编码的基因导入宿主中，分别得到了可以利用葡萄糖生产香豆醇，咖啡醇和阿魏醇的生产宿主，本发明还公开了一种共培养不同宿主的方法，使得咖啡醇和阿魏醇的生产更有效。
【专利说明】
一种异源生物合成香豆醇，咖啡醇及阿魏醇的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成香豆醇，咖啡醇 及阿魏醇的代谢途径及共培养的方法，通过增强上游莽草酸途径酶的表达，选用 Escherichia coli作为宿主细胞，最终提高了香豆醇，咖啡醇及阿魏醇的产量。
【背景技术】
[0002] 香豆醇，咖啡醇，阿魏醇作为大宗化学品，具有广泛的应用。这三种化合物均为木 质素合成的直接前体，可以用来合成木质素，并且可以阐明木质素合成过程中酶的作用。另 一方面，香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的衍生物具有不同的生理和药理作用。2007年Gazak和 Walterova发现一种阿魏醇的衍生物水飞蓟素具有抗癌和护肝的活性。2009年Yu等发现甲 基醚香豆醇对于抗氧化及抗炎有很好的效果。目前，化学合成法可以利用苯基丙酸实现这 三种化合物的合成，但是化学合成方法的成本高，反应条件苛刻，环境污染大，且产物分离 困难。
[0003] 本发明主要目的在于实现这几种化合物的生物学方法的合成。选择催化效率高的 酶来实现香豆醇的生产，同样设计了两条新的代谢途径实现了咖啡醇和阿魏醇的从头合 成，另外本发明还公开了一种共培养的发酵方法来提高咖啡醇和阿魏醇的高产。实验结果 表明，香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的最终产量分别为501.8 ± 41.4mg/L，401.0 ± 15.3mg/L和 124.9±5.1mg/L。
【发明内容】
[0004] 1.-种异源生产香豆醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经 酪氨酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆 酰辅酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇。
[0005] 2. -种异源生产咖啡醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经 酪氨酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆 酰辅酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇，香豆 醇经4-羟基苯乙酸3-单加氧酶催化生成咖啡醇。
[0006] 3. -种异源生产阿魏醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经 酪氨酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆 酰辅酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇，香豆 醇经4-羟基苯乙酸3-单加氧酶催化生成咖啡醇，咖啡醇经咖啡酸0-甲基转移酶催化生成阿 魏醇。
[0007] 4.能够完成酪氨酸到香豆醇的生物合成路径的宿主，其中，所述基因表达元件为 下述1)和2):
[0008] 1)表达下游途径，包括来源于Leucaena leucocephala编码肉桂酰辅酶A还原酶的 基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氢酶的基因 adh，来源于Arabidopsis tha 1 i ana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4c 1;
[0009] 2)表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来源于Escherichia coli编码莽草酸途径tyrAfbr，ppsA, tktA和aroGfbr的基因 tyrAfbr, ppsA, tktA 和 aroGf br 〇
[0010] 5.能够完成酪氨酸到咖啡醇的生物合成路径的宿主，其中，所述基因表达元件为 下述1)和2):
[0011 ] 1)表达下游途径，包括来源于Leucaena leucocephala编码肉桂酰辅酶Α还原酶的 基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氢酶的基因 adh，来源于Arabidopsis thaliana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4cl，来源于Escherichia col i编码4-羟基苯乙酸 3_单加氧酶的基因 hpaBC;
[0012] 2)表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来源于Escherichia coli编码莽草酸途径tyrAfbr，ppsA, tktA和aroGfbr的基因 tyrAfbr, ppsA, tktA 和 aroGf br 〇
[0013] 6.所述的能够完成酪氨酸到阿魏醇的生物合成路径的宿主，其中，所述基因表达 元件为下述1)和2):
[0014] 1)表达下游途径，包括来源于Leucaena leucocephala编码肉桂酰辅酶Α还原酶的 基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氢酶的基因 adh，来源于Arabidopsis thaliana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4cl，来源于Escherichia coli编码4-羟基苯乙酸 3_单加氧酶的基因 hpaBC，来源于Arabidopsis thaliana编码咖啡酸盐0-甲基转移酶的基 因 C0MT;
[0015] 2)表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来源于Escherichia coli编码莽草酸途径tyrAfbr,ppsA, tktA和aroGfbr的基因 tyrAfbr, ppsA, tktA 和 aroGf br 〇
[0016] 7.用大肠杆菌作为宿主进行发酵实验，实验条件如下：在含有2-5g/L葡萄糖、5-15g/L甘油、l-5g//L酵母提取物、l-2g/L MOPS，0 · 5-lg/LNH4Cl、2-5g/L Na2HP04、0 · 5-2g/L KH2P04、0.05-0.25mmol/L CaCl2和0.5-2mmol/L MgS〇4的培养基中培养产香豆醇、咖啡醇、 阿魏醇的宿主，选用〇 . 5-5 %的体积接种量，加入终浓度为0.15-1.50mmol/L的IPTG作为诱 导剂，选用20-40 °C的诱导温度，诱导时间为24-48h。
[0017] 本发明的目的是提供了高产香豆醇的宿主，通过向宿主中导入一条高效生产香豆 醇的途径，下游途径包括来源于Leucaena leucocephala肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，来源于 Saccharomyces cerevisiae醇脱氢酶(ADH)，来源于Arabidopsis thaliana香豆酰辅酶A连 接酶（4CL)，上游途径包括来源于Rhodotorula glut in is酪氨酸解氨酶（TAL)，来源于 Escherichia co 1 i莽草酸途径tyrAfblr，ppsA，tktA和aroGfblr，通过这些酶在宿主种的高效表 达，实现香豆醇的从头合成；
[0018] 本发明的目的是提供了高产咖啡醇的共培养的两个宿主，一个宿主导入来源于 Leucaena leucocephala肉桂酰辅酶A还原酶（CCR)，来源于Saccharomyces cerevisiae醇 脱氢酶(ADH)，来源于Arabidopsis thaliana香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，上游途径包括来源 于Rhodotorula glutinis酪氨酸解氨酶（TAL)，来源于Escherichia coli莽草酸途径 tyrAfblr，ppsA，tktA和aroGfblr;另一宿主导入来源于Escherichia coli 4-羟基苯乙酸3-单 加氧酶(HpaBC)。
[0019] 本发明的目的是提供了高产阿魏醇的共培养的两个宿主，一个宿主导入来源于 Leucaena leucocephala肉桂酰辅酶A还原酶（CCR)，来源于Saccharomyces cerevisiae醇 脱氢酶（ADH)，来源于Arabidopsis thaliana香豆酰辅酶A连接酶（4CL)，来源于 Arabidopsis thaliana咖啡酰辅酶A 0-甲基转移酶（CCoAOMT)，上游途径包括来源于 Rhodotorula glutinis酪氨酸解氨酶(TAL)，来源于Escherichia coli莽草酸途径tyrAfbr, ppsA,tktA和aroGfblr;另一宿主导入来源于Escherichia coli 4_羟基苯乙酸3_单加氧酶 (HpaBC)。
[0020] 本发明的目的是提供了高产阿魏醇的共培养的两个宿主，一个宿主导入来源于 Leucaena leucocephala肉桂酰辅酶A还原酶（CCR)，来源于Saccharomyces cerevisiae醇 脱氢酶(ADH)，来源于Arabidopsis thaliana香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，上游途径包括来源 于Rhodotorula glutinis酪氨酸解氨酶（TAL)，来源于Escherichia coli莽草酸途径 tyrAfblr，ppsA，tktA和aroGfblr;另一宿主导入来源于Escherichia coli 4-羟基苯乙酸3-单 加氧酶(HpaBC)，来源于Arabidopsis thaliana咖啡酸盐0-甲基转移酶(C0MT)。
[0021] 本发明的又一目的是提供一种共培养的方法，通过向两个宿主中导入途径中不同 的基因来实现咖啡醇，阿魏醇的高效生产。
[0022] 本发明的另一个目的是提供所述产香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的不同宿主的发酵生 产方法。
[0023] 为了实现上述目的，本发明提供了能够产香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的宿主，向 Escherichia coli中导入含有这三种化合物生物合成路径相关基因，制备所述的产香豆 醇，咖啡醇，阿魏醇的不同宿主。
[0024] 本发明还提供了微生物产香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的方法:第一种是体外分别添加 香豆酸，咖啡酸和阿魏酸，向宿主细胞中导入肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)，香 豆酰辅酶A连接酶(4CL)的基因。体外添加香豆酸，咖啡酸或阿魏酸。从发酵液中取样，利用 高效液相色谱对产物的浓度进行了分析;第二种是香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的从头合成，分 别将产香豆醇的一个宿主，产咖啡醇的两个宿主，产阿魏醇的两个宿主过夜培养之后，转 接，在20-40°C温度下培养48h。诱导后每隔12h取样测0D，高效液相色谱测香豆醇，咖啡醇及 阿魏醇的浓度。
[0025]本发明还提供了微生物高产香豆醇的方法，增强上游通量的酶TPTA(tyrAfbl:， ppsA, tktA和aroGfbr)表达。最终香豆醇的产量可达501.8±41.4mg/L。
[0026] 本发明还提供了高产咖啡醇的共培养方法，最终咖啡醇的产量可达401.0 土 15·3mg/L〇
[0027] 本发明还提供了高产阿魏醇的共培养方法，筛选高效的甲基转移酶，最终阿魏醇 的产量可达124.9±5.1mg/L。
[0028] 如上文所述，本发明涉及香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的有效生产方法，所述方法的特 征在于:通过筛选活性高及高效表达的酶，设计共培养的方法，并且优化发酵过程中的培养 基及培养条件，从而实现香豆醇，咖啡醇及阿魏醇的高效从头合成。
【附图说明】
[0029] 图1香豆醇，咖啡醇及阿魏醇生物合成的路径
[0030] 图2导入肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)，香豆酰辅酶A连接酶(4CL)基 因的原宿主细胞分别转化香豆酸，咖啡酸，阿魏酸到香豆醇(A)，咖啡醇(B)，阿魏醇(C)的发 酵结果
[0031] 图3导入肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)，香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，酪 氨酸解氨酶(TAL)，莽草酸途径tyrA fbl:，ppSA，tktA和ar〇Gfbl:酶基因的宿主细胞，从头合成香 豆醇，不同酵母粉浓度优化结果(A)和不同时间发酵结果(B);
[0032] 图4从头合成咖啡醇两个宿主共培养的发酵结果，不同接种比例优化结果(A)和不 同时间发酵结果(B)。
[0033] 图5从头合成阿魏醇两个宿主共培养的发酵结果，不同接种比例优化结果(A)和不 同时间发酵结果(B)。
【具体实施方式】 [0034] 具体实施例1
[0035] 体外添加香豆酸，咖啡酸和阿魏酸产香豆醇，咖啡醇和阿魏醇
[0036] 许多细菌可以自然合成芳族化合物。合成芳香族氨基酸的途径，被称为莽草酸途 径。
[0037]莽草酸途径的第一步反应是PEP和E4P的缩合反应，产生DHAP和磷酸。DHAP的合成 是由DHAP合成酶催化。莽草酸途径的第二步反应是DHAP磷酸基团的消除，产生3-脱氢奎尼 酸(DHQ)。该反应是由DHQ合成酶催化。莽草酸途径的第三步反应是DHQ脱水形成3-脱氢莽草 酸(3-DHS)，是由DHQ脱水酶催化。莽草酸途径的第四步反应是3-DHS还原形成莽草酸。大肠 杆菌中，该反应由NADP-依赖的莽草酸脱氢酶催化。在莽草酸途径的第五步反应中，莽草酸 激酶催化莽草酸的磷酸化形成莽草酸3-磷酸(S3P)。莽草酸途径的第六步反应引入了第二 个PEP。PEP与莽草酸3-磷酸(S3P)缩合产生EPSP和无机磷酸。这一可逆反应由EPSP合成酶催 化。莽草酸途径的第七步也是最后一步反应是EPSP的磷酸基团的反式_1，4消除，产生分支 酸。该反应由分支酸合成酶催化。
[0038]由莽草酸途径生成的酪氨酸，经过筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的香 豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)催化生成香豆醇。用PCR 获得片段，接着用内切酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之 后将目的基因插入到质粒pZE12-luc(高拷贝）上，获得pZE-CA4重组质粒(表1)。
[0039]电转法感受态的制备:将大肠杆菌的单菌落分别接种到3mL的液体LB培养基中，37 °C，250rpm过夜培养。之后接种500yL菌液到50mL的LB培养基中，37°C，250rpm振荡培养至0D =0.4-0.6。将菌液于4°C，5000rpm离心10min，弃掉上清，沉淀用3mL 10%的甘油重悬混勾。 接着将菌液于4°C，5000rpm离心10min，弃掉上清，沉淀用3mL 10%甘油重悬混匀。之后将菌 液于4°C，5000rpm离心10min，用400yL 10%的甘油重悬细胞，分装成lOOyL的小管用于转 化。
[0040] 取构建好的高拷贝质粒PZE-CA4 lyL，中拷贝质粒pCS-TAL-TPTA2yL加入到含有 100yL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀。接着将混合物转移到电转杯中。设置电压为 1800V，将电转杯放入卡槽中，按电击按钮一次。电击完成后，加入500yL LB培养基，并将混 合物转移到1.5mL离心管中，复苏45min。之后取200yL菌液涂到含有相应抗生素的平板上， 37 °C过夜培养。
[0041 ] 产香豆醇，咖啡醇，阿魏醇微生物的发酵
[0042]将转化有质粒PZE-CA4的大肠杆菌，定义宿主为BC1，在BC1的平板上挑取单菌落， 接至lj3mL的带有相应抗性的液体LB中，37°C，250rpm振荡培养，之后将菌液转接到50mL的含 有Amp和2-5g/L葡萄糖、5-15g/L甘油、l-5g/L酵母提取物(购至0X0ID公司）、l-2g/L M0PS， 0.5-lg/L NH4Cl、2-5g/L Na2HP04、0.5-2g/L KH2P04、0.05-0.25mmol/L CaCl2和0.5-2mmol/L MgS〇4的培养基中，菌体在37 °C的摇床中培养至0D600值为0.6时，加入0.5mM的 IPTG进行诱导3h。之后分别在诱导后5小时，9小时，13小时和17小时的时候添加香豆酸，咖 啡酸或阿魏酸(最终浓度为200mg/L)，用高效液相色谱测定香豆醇，咖啡醇，阿魏醇的浓度。 最终产量如图2所示。
[0043] 具体实施例2
[0044] 微生物异源合成香豆醇代谢途径的构建
[0045] 香豆醇作为一种重要的木质素合成前体，由莽草酸途径合成的酪氨酸，经过筛选 来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的酪氨酸解氨酶(TAL)，香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉 桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)催化生成香豆醇。用PCR获得相应的基因片段，接着 用内切酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因 插入到质粒PCS27(中拷贝）上，获得pCS-TAL-TPTA(表1)。
[0046] 取构建好的高拷贝质粒pZE-CA4 lyL，中拷贝质粒pCS-TAL-TPTA2yL电转到大肠杆 菌中，之后取200yL菌液涂到含有Amp和Kan的抗生素平板上，37°C过夜培养。
[0047]产香豆醇微生物的发酵
[0048]在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB 中，37°C，250rpm振荡培养，之后将菌液转接到50mL的含有Amp和Kan和2-5g/L葡萄糖、5-15g/L甘油、l-5 g//L酵母提取物(购至0X0ID公司）、l-2g/L MOPS，0 · 5-lg/L NH4CI、2-5g/L Na2HP04、0.5-2g/L KH2P04、0.05-0.25mmol/L CaCl2、0.5-2mmol/L MgS〇4和0.15-1.50mmol/L IPTG的培养基中，30°C诱导。诱导后每隔12hrs取样测0D，用高效液相色谱测定 香豆醇的浓度。
[0049]发酵结果显示，将转化有质粒pCS-TAL-TPTA和pZE-CA4的大肠杆菌，定义宿主为 BC2。在2g/L酵母提取物(购至0X0ID公司）培养基中发酵，体积接种量为1 %时，香豆醇产量 达 501.8±41.4mg/L。
[0050] 具体实施例3
[0051 ]微生物异源合成咖啡醇代谢途径的构建
[0052] PCR获取hpaBC，接着用内切酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回 收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS27(中拷贝）上，获得pCS-HpaBC重组质粒(表 1)〇
[0053]导入异源代谢途径产咖啡醇的微生物
[0054]取构建好的高拷贝质粒pZE-luc lyL，中拷贝质粒pCS-HpaBC 2yL电转到大肠杆菌 中，之后取200yL菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37°C过夜培养。
[0055]产咖啡醇微生物的发酵
[0056]在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB 中，37°C，250rpm振荡培养，之后将菌液转接到50mL的含有Amp和Kan和2-5g/L葡萄糖、5-15g/L甘油、l-5 g//L酵母提取物(购至0X0ID公司）、l-2g/L MOPS，0 · 5-lg/L NH4CI、2-5g/L Na2HP04、0.5-2g/L KH2P04、0.05-0.25mmol/L CaCl2、0.5-2mmol/L MgS〇4和0.15-1.50mmol/L IPTG的培养基，30°C诱导。诱导后每隔12hrs取样测0D，用高效液相色谱测定咖 啡醇的浓度。
[0057]将转化有质粒pCS-TAL-TPTA和pZE-CA4的大肠杆菌，定义宿主为BC2，将转化有质 粒pCS-HpaBC和pZE-luc的大肠杆菌，定义宿主为BC3，通过共同培养的方法，体积接种量为 1 %时，BC2与BC3菌株的体积接种比例为5:1时，咖啡醇产量达401.0 ± 15.3mg/L。
[0058] 具体实施例4
[0059] 微生物异源合成阿魏醇代谢途径的构建
[0060] PCR获取目的基因，8(111，(^，4(311，〇^011'。将酶切后的片段进行胶回收或柱回 收，之后将目的基因插入到质粒pZE-luc(高拷贝）上，获得pZE-CA4C重组质粒(表1)。
[0061] 全基因合成C0MT。接着用内切酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶 回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pZE-luc(高拷贝）上，获得pZE-⑶MT重组质粒 读1)。
[0062] 导入异源代谢途径产阿魏醇的微生物
[0063] 取构建好的高拷贝质粒pZE-CA4C lyL，中拷贝质粒pCS-TAL-TPTA 2yL电转到大肠 杆菌中。同样取构建好的高拷贝质粒pZE-COMT lyL，中拷贝质粒pCS-HpaBC 2yL加入到含有 100yL电转到大肠杆菌中，之后取200yL菌液涂到含有Amp和Kan的抗生素平板上，37 °C过夜 培养。
[0064]产阿魏醇微生物的发酵
[0065]在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB 中，37°C，250rpm振荡培养，之后将菌液转接到50mL含有Amp和Kan和2-5g/L葡萄糖、5-15g/L 甘油、l-5g/L酵母提取物（购至0X0ID公司）、l-2g/L MOPS，0 · 5-lg/L NH4CI、2-5g/L Na2HP04、0.5-2g/L KH2P04、0.05-0.25mmol/L CaCl2、0.5-2mmol/L MgS〇4和0.15-1.50mmol/L IPTG的培养基中，30°C诱导。诱导后每隔12hrs取样测0D，用高效液相色谱测定 阿魏醇的浓度。
[0066]将转化有质粒PZE-CA4C和pCS-TAL-TPTA的大肠杆菌，定义宿主为BC4，将转化有质 粒pCS-HpaBC和pZE-COMT的大肠杆菌，定义宿主为BC5，通过共同培养的方法，BC2和BC5共培 养，BC3和BC4共培养，
[0067] 体积接种量为1 %时，BC3和BC4宿主体积接种比例为1:1时，阿魏醇产量达60.9 土 2 · lmg/L，BC2和BC5，接种比例为1:1时，阿魏醇产量达124 · 9 ± 5 · lmg/L。
[0068] 表1宿主和质粒
【主权项】
1. 一种异源生产香豆醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经酪氨 酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆酰辅 酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇。2. -种异源生产咖啡醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经酪氨 酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆酰辅 酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇，香豆醇经 4-羟基苯乙酸3-单加氧酶催化生成咖啡醇。3. -种异源生产阿魏醇的方法，包括大肠杆菌催化葡萄糖生成酪氨酸，酪氨酸经酪氨 酸解氨酶催化生成香豆酸，香豆酸经香豆酸辅酶A连接酶催化生成香豆酰辅酶A，香豆酰辅 酶A经肉桂酰辅酶A还原酶催化生成香豆醛，香豆醛经醇脱氢酶催化生成香豆醇，香豆醇经 4-羟基苯乙酸3-单加氧酶催化生成咖啡醇，咖啡醇经咖啡酸O-甲基转移酶催化生成阿魏 醇。4. 根据权利要求1所述的能够完成酪氨酸到香豆醇的生物合成路径的宿主，其中，所述 基因表达元件为下述1)和2): 1) 表达下游途径，包括来源于Leucaena Ieucocephala编码肉桂酰辅酶A还原酶的基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氛酶的基因 adh，来源于Arabidopsis tha I i ana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4c 1; 2) 表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来 源于Escherichiacoli编码莽草酸途径tyrAfbr，ppsA，tktA和aroG fbr的基因 tyrAfbr，ppsA， tktA 和 aroGfbr。5. 根据权利要求2所述的能够完成酪氨酸到咖啡醇的生物合成路径的宿主，其中，所述 基因表达元件为下述1)和2): 1) 表达下游途径，包括来源于Leucaena Ieucocephala编码肉桂酰辅酶A还原酶的基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氛酶的基因 adh，来源于Arabidopsis thaliana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4cl，来源于Escherichia col i编码4-羟基苯乙酸 3_单加氧酶的基因 hpaBC; 2) 表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来 源于Escherichiacoli编码莽草酸途径tyrAfbr，ppsA，tktA和aroG fbr的基因 tyrAfbr，ppsA， tktA 和 aroGfbr。6. 根据权利要求3所述的能够完成酪氨酸到阿魏醇的生物合成路径的宿主，其中，所述 基因表达元件为下述1)和2): 1) 表达下游途径，包括来源于Leucaena Ieucocephala编码肉桂酰辅酶A还原酶的基因 ccr，来源于Saccharomyces cerevisiae编码醇脱氛酶的基因 adh，来源于Arabidopsis thaliana编码香豆酰辅酶A连接酶的基因4cl，来源于Escherichia coli编码4-羟基苯乙酸 3_单加氧酶的基因 hpaBC，来源于Arabidopsis thaliana编码咖啡酸盐0-甲基转移酶的基 因 COMT; 2) 表达上游途径，包括来源于Rhodotorula glutinis编码酪氨酸解氨酶的基因 tal，来 源于Escherichiacoli编码莽草酸途径tyrAfbr，ppsA，tktA和aroG fbr的基因 tyrAfbr，ppsA， tktA 和 aroGfbr。7.用大肠杆菌作为宿主进行发酵实验，实验条件如下：在含有2-5g/L葡萄糖、5-15g/L 甘油、l-5g/L 酵母提取物、l-2g/L MOPS, 0.5-lg/L NH4Cl、2-5g/L Na2HP04、0.5-2g/L 1〇12?04、0.05-0.25_〇1/1〇3(：12和0.5-2111111〇1/1]\%504的培养基中培养产香豆醇、咖啡醇、 阿魏醇的宿主，选用〇 . 5-5 %的体积接种量，加入终浓度为0.15-1.50mmol/L的IPTG作为诱 导剂，选用20-40 °C的诱导温度，诱导时间为24-48h。
【文档编号】C12P7/22GK105907804SQ201610391405
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月4日
【发明人】袁其朋, 孙新晓, 陈振娅, 刘少奇, 陈芳
【申请人】北京化工大学