一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于福鼎大白商品茶的分子鉴定的引物组。本发明还公开了一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，属分子标记技术领域。该方法将待鉴定样品PCR反应获得扩增产物测序后，与福鼎大白品种条形码比对，当扩增产物的SNP序列与福鼎大白品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为福鼎大白品种。本发明克服了用感官审评或理化分析等方法难以鉴别福鼎大白茶的真伪以及山茶属下不同茶树品种的技术问题，能有效、简便快速地对福鼎大白商品茶的品种进行准确鉴定。
【专利说明】
一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 茶树[Camellia sinensis(L. )0.Kuntze]是一种重要的经济作物，是21世纪最流 行的健康饮料植物之一。中国是茶树的原产地，产茶历史悠久。近年来，中国茶产业快速发 展，产业规模不断扩大，茶园种植面积、产量、出口数量和金额屡创新高。同时，二十世纪九 十年代开始全国各地挖掘、恢复历史名茶和创制新名茶并举，名优茶数量不断增加，质量逐 年提高，市场全面开拓。
[0003] 白茶现在主要产区有两个:福鼎和政和。白茶最早是采摘菜茶鲜叶制作，之后才用 福鼎大白茶(华茶1号）、福鼎大毫茶(华茶2号)来制作白茶。福鼎白茶以原产于福鼎太姥山 的福鼎大白茶和福鼎大毫茶而制成的白茶类产品的统称。根据茶叶的采摘标准不同及加工 制作工艺的差异，主要分白毫银针、白牡丹、贡眉寿眉及新工艺白茶等四种。
[0004] 福鼎大白茶又名白毛茶，简称福大。无性系，小乔木型，中叶类，早生种，二倍体。产 地及分布:原产福鼎市点头镇柏柳村，已有100多年栽培史，主要分布在福建东北部茶区。20 世纪60年代后，福建和浙江、湖南、贵州、四川、江西、广西、湖北、安徽、江苏等省区有大面积 栽培。1985年全国农作物品种审定委员会认定为国家品种，编号GS13001-1985。特征特性： 芽叶生育力和持嫩性强，产量高，每667平方米可达200千克以上。春茶一芽二叶干样约含氨 基酸4.3 %、茶多酚16.2 %、儿茶素总量11.4 %、咖啡碱4.4 %。适制红茶、绿茶、白茶，品质 优。福鼎大白茶树高1.5-2米，幅宽1.6-2米，树势半开张，为小乔木型。分枝较密，节间尚 长。树皮灰色。叶椭圆形，先端渐尖并略下垂，基部稍钝，叶缘略向上。通常大12X5.4厘米， 长宽比平均为2.2。叶色黄绿、具光泽。侧脉明显，7-11对。锯齿较整齐、明显，27-38对。叶 肉略厚，尚软。一芽二叶长5.1厘米，百芽重23克。花型较大，雄蕊低于雌蕊，盛花期10月下旬 至11月中旬，花量多，结果率高，茶子大而饱满。发芽期在3月上旬，11月中旬停止生长。生长 期全年达8个月。生长势旺盛，抗逆性强，耐旱亦耐寒，虽在零下3-4°C或更低亦不受冻。繁 殖力强，压条、扦插发根容易，成活率高达95%以上。产量比当地菜茶高。采制银针以芽洁白 肥壮、茸毛多最为特色。
[0005] 福鼎大毫茶简称大毫，无性系，小乔木型，大叶类，早生种，二倍体。产地及分布:原 产福鼎市点头镇汪家洋村，已有百年栽培史。主要分布在福建茶区。20世纪70年代后，江苏、 浙江、四川、江西、湖北、安徽等省区有大面积栽培。1985年全国农作物品种审定委员会认定 为国家品种，编号GS13002-1985。特征特性:芽叶生育力和持嫩性较强，产量高，每667平方 米可达200~300千克。春茶一芽二叶干样约含氨基酸3.5%、茶多酚25.7%、儿茶素总量 18.4 %、咖啡碱4.3 %。适制红茶、绿茶、白茶。
[0006] 福鼎大白茶与福鼎大毫茶的区别。在外形上，福鼎大白茶:叶片呈椭圆形，叶色绿， 叶面隆起，有光泽，叶缘平，叶身平，叶尖钝尖，叶齿锐较密，叶质较厚软。福鼎大毫茶:叶椭 圆或近长椭圆形，叶色绿，富光泽，叶面隆起，叶缘微波，叶身稍内折，叶尖渐尖，叶齿锐浅、 较密，叶质厚脆。福鼎大白茶:芽叶黄绿色，茸毛特多，一芽三叶百芽重63克。福鼎大毫茶:芽 头肥壮，茸毛密集，一芽三叶百芽重104克。在产量上，由前文比较得知，福鼎大白茶的芽叶 重量一芽三叶百芽重63克，福鼎大毫茶一芽三叶百芽重104克，两茶亩产差别有1/3多。在口 感上，由于两种茶茶氨酸与茶多酚含量有所差异，所以两种茶的形、香、色、味略有区别，但 总体相差不大。
[0007] 目前，福鼎大白因其在茶叶市场中价值高、功效多而且具有收藏价值而不可避免 地遭到了仿冒，因此有必要对名优茶的品质真伪进行鉴别，以保护品茶爱好者的利益，维持 名优茶市场的公平公正性。感官判别和理化检测是最常用的茶叶品质鉴别方法，但感官的 判别方法受品茶师的个人经验、心理和生理因素等影响，往往判别结果的准确性和重复性 差;理化检测的方法只限于某些茶叶内部特定组分的分析，而且分析流程多，成本高。
[0008] 近年来，分子生物学和生物技术迅速发展，遗传标记技术在此基础上也得到了迅 猛发展。分子标记作为继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后一种新的遗传标记技术， 发展时间虽短但具有广阔的应用前景和巨大的应用潜力，在遗传图谱构建、群体遗传结构 和多样性分析、物质演化和亲缘关系研究中具有重要意义。目前，分子标记技术已在茶树研 究中广泛应用，取得较多进展，并且研究也不断改进。在茶树中应用较多的分子标记技术 为限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、简单序列重复 (331〇、扩增片段长度多态性(4?1^)、单核苷酸多态性(3即)等。虽然1^1^、1^?0、331?^?1^在 分子标记技术中具有各自的优点，但是也存在实验操作繁琐、检测周期长、成本高等缺点。 单核苷酸多态性(SNP)作为最常见的一种可遗传变异，广泛存在动植物基因组中。SNPs是指 基因组水平上，单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性，为第三代分子标记的代表。SNP包括 两种形式，碱基的转换或碱基的颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强，基因编码区 的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于自动快速检 测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。
[0009] 经过我们的方法可以对商品碧螺春茶进行鉴定，而福鼎白茶的鉴定也具有重要意 义。而且相对于碧螺春茶，白茶的加工工艺仅为晾晒、干燥，不经过任何的炒青，由于加工工 序少，其中很大程度地保留了茶叶中的各种成分，提取DNA后，其中杂质较多，影响了 SNP的 鉴定。目前茶叶市场上存在拼配的情况，因此对于每个商品茶的鉴定，单单的进行单个芽叶 的提取不能代表该商品的整体情况。在有较多样品以及需要重复检测的情况下，我们利用 下面的方法进行商品茶的DNA提取，能够高效准确的提取DNA，同时可以高效准确的进行后 续的实验。
【发明内容】
[0010] 发明目的:本发明的第一个目的是提供了一种用于福鼎大白商品茶的分子鉴定的 引物组。
[0011] 本发明的第二个目的是提供了一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法。
[0012] 本发明利用分子标记技术克服了感官判别和理化检测方法的不足，利用多个SNP 差异位点，最终达到福鼎大白茶品质真伪快速鉴别的目的检测。
[0013] 技术方案:为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于福鼎大白商品茶的分 子鉴定的引物组，所述引物组包括45对引物序列，所述引物序列如SEQ ID N0:1~90所示。
[0014] 本发明还提供了一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，包括以下步骤：
[0015] 1)确定福鼎大白茶叶样品的45个SNP位点，其SNP序列如SEQ ID N0:91~135所 示.，在NCBI中通过blast找到的对应的45个基因序列;本发明的SNP位点中的S代表：（C/G)， R:(A/G),M:(A/C),ff:(A/T),Y:(C/T),Κ:(G/T)；
[0016] 2)引物的设计;根据找到的45个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物， 并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这45个基因片段的上下游引物;所述 引物序列如上述的45对引物序列；
[0017] 3)基因组DNA提取；
[0018] 4)PCR扩增及检测；
[0019] 5)将扩增产物测序后与福鼎大白品种条形码比对，福鼎大白品种条形码的碱基序 列（1~45个基因序列对应的NCBI上的登录号参见表1)，扩增产物的SNP序列与福鼎大白品 种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为福鼎大白品 种。
[0020] 表1(1~45代表1~45个基因序列。）
[0021]
[0022]
[0023] 其中，上述引物的设计长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50°C_60°C，GC 含量在40 % -60 %之间。
[0024] 其中，上述基因组DNA提取采用QIAGEN 96plate kit法从叶片中提取基因组DNA， 其主要操作步骤为：
[0025]对于少量鉴定样品，其基因组DNA提取操作步骤如下：
[0026] 1)将50mg叶片称重后放入2mL离心管中；
[0027] 2)在2mL离心管中，加入碳化钨珠与石英砂；
[0028] 3)将离心管放于自动化样品研磨机中将样品研磨充分；
[0029] 4)在每个2mL离心管中加入400μ1 API缓冲液与4μ1 RNase A，盖好后涡旋充分； [0030] 5)将混合物在65°C下水浴20min，每隔5min涡旋充分；
[0031] 6)准备冰盒；
[0032] 7)水浴结束后，加入130yLAP2缓冲液，涡旋充分后，冰浴5min;
[0033] 8)14000rpm 离心 5min;
[0034] 9)将上一步中离心的上层清液（约500μ1)小心吸出置于QIA shredder Mini Spin Colum中（紫色离心柱），14000rpm离心2min;
[0035] 10)将上一步中获得的滤液(约400μ1)缓慢吸出至另一新离心管中（避免吸到下层 沉淀）；
[0036] 11)在离心管中加入滤液(400μ1) 1.5倍体积(600μ1)的AP3/E缓冲液，并吸打混合 均匀；
[0037] 12)将上步中混合液(包括形成的沉淀）加入Dneasy Mini Spin Colum中（白色离 心柱），>8000rpm离心lmin，弃废液;将剩余的混合液加入离心柱，再次抽提；
[0038] 13)将AE在65Γ水浴锅中预热；
[0039] 14)将白色离心柱取出放于2mL收集管上；
[0040] 15)在离心柱中加入500μ1的Μ缓冲液，8000rpm离心lmin
[00411 16)弃废液，将离心柱放回收集管，再在离心柱中加入500μ1的AW缓冲液，14000rpm 离心2min;
[0042] 17)将DneasyMiniSpinColum(白色离心柱）放置于1 · 5或2mL离心管上，加入50μ1 65 °C预热的AW，室温放置20min;
[0043] 18)8000rpm 离心 lmin;
[0044] 19)如果需要重复步骤17、18;
[0045] 20)将提取的DNA标记详细信息，存放于-20°C冰箱备用。
[0046] 对于大量鉴定样品，其基因组DNA提取操作步骤如下：
[0047] 1)将50mg叶片称重后放入96孔样品收集管中；
[0048] 2)在收集管中，加入碳化钨珠与石英砂，并用软胶盖住收集管；
[0049] 3)65°C预热API缓冲液，将90mL预热的API缓冲液与225μ1 RNase A(100mg/ml)、 225μ1 Reagent DX混合均勾(混合液为裂解液），放于65°C中水浴；
[0050] 4)将2块96孔样品收集管放于自动化样品研磨机中将样品研磨充分；
[0051] 5)用排枪在每个收集管中加入400μ1裂解液，盖上新的软胶盖后，上下摇晃混匀；
[0052] 6)离心，转速达3000rpm即可停止；
[0053] 7)加入130yLAP2缓冲液，涡旋充分后，将96孔板放于-20°C冰箱静置lOmin;
[0054] 8)将96孔板6000rpm 离心 5min;
[0055] 9)扔掉盖子，将每个收集400μ1上清液转移至新的96孔收集管中（操作时需确保新 的微新集管的方向正确）；
[0056] 10)在每个收集管中中加入1.5体积ΑΡ3/Ε缓冲液，盖上新的软胶盖；
[0057] 11)上下剧烈震摇15s，离心，转速达到3000rpm时离心；
[0058] 12)将两个DNeasy 96Plates置于S-Blocks上面，做好标记（以避免样品混淆）；
[0059] 13)从微型收集管上除去并扔掉盖子，小心将每个样品1ml转移到DNeasy 96Plates;
[0060] 14)用AirPore Tape Sheet密封DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心4min;
[0061] 15)除去胶纸，在每个样品中加入500μ1缓冲液AW;
[0062] 16)用AirPore Tape密封Sheet DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心 15min使 DNeasy膜干燥；
[0063] 17)除去AirPore Tape，在每个样品中加入50μ1 65°C预热的AE缓冲液，在15-25°C 室温下放置20min，在6000rpm下离心2min;
[0064] 18)重复第18步；
[0065] 19)将提取的DNA标记详细信息，存放于-20°C冰箱备用。
[0066] 其中，上述PCR扩增反应程序为：94°C预变性lOmin;然后进入循环，每个循环94°C 变性30sec，52~55°C退火30sec，72°C延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72°C延伸10min; 4°C冷却后取出扩增产物。
[0067] 有益效果:本发明能够节省成本，以及对于样本量没有限制，克服了直接使用单个 位点进行确认不太准确的问题，本发明通过采用45个SNP位点确定更加准确。该方法简单易 行，稳定可靠，只需极少量样品就可完成，具有很好的实用价值。福鼎大白，可以用其他相似 茶叶作为代用品，本发明方法能方便地鉴定出福鼎大白、能方便地将福鼎大白与从形态特 征易与福鼎大白混淆的其它茶叶区别开。因此，本发明方法对保护福鼎大白的收购及茶叶 生产质量具有十分重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0068] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0069] 实施例1:
[0070] 1、材料的选取以及45个SNP位点的确定
[0071] 福鼎大白茶叶样品为不同地区福鼎大白样品。试验中，福鼎大白茶样分别于2015 年6-7月购自福建、浙江、湖南、湖北、江西、江苏和安徽等产茶名区。福鼎大白的45个SNP位 点的基因序列，根据这45个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的基因。
[0072] 表2供试福建福鼎大白茶树品种(系)来源和原产地
[0073]
[0074] 表3参照茶树品种(系）来源和原产地
[0075]
[0076]
[0077] 表4商品福鼎大白茶来源
[0078]
[0079]
[0080] 2、EST_SNP 的开发
[0081 ]在NCBI GenBank中获取(http: //www.ncbi .nlm.nih · gov/)茶树EST序列。在NCBI 数据库中获得了47789条EST序列，这些序列来源于不同茶树品种、不同组织和器官的cDNA 文库。
[0082] (1)去除'噪音'序列:从数据库中直接获取的EST序列往往包含一些低质量的小片 段，同时还带有少量载体序列及末端存在polyA/Τ"尾巴"的序列，去除这些序列；（2)EST数 据的聚类和拼接:利用Phrap软件进行聚类和拼接；（3)筛选:利用AutoSNP软件进行筛选，排 除旁系同源基因的干扰，并解决测序错误引起的假阳性问题。通过上述方法筛选得到福鼎 大白的45个SNP位点的基因序列。
[0083] 3、引物的设计及扩增
[0084] 使用Primer5.0软件在候选SNP对应的45个基因序列两侧设计引物，引物设计的原 则为:长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50 °C-60 °C，GC含量在40 % -60 %之间。共 设计了 45组引物序列。
[0085] 4、基因组DNA提取(采用的是DNeasy Plant Mini Kit试剂盒，该试剂盒在上海嘉 合生物科技有限公司购买）
[0086]采用以下方法从叶片中提取基因组DNA，其主要操作步骤为：
[0087] 1)将50mg叶片称重后放入96孔样品收集管中；
[0088] 2)在收集管中，加入碳化钨珠与石英砂，并用软胶盖住收集管；
[0089] 3)65°C预热API缓冲液，将90mL预热的API缓冲液与225μ1 RNase A(100mg/ml)、 225μ1 Reagent DX混合均勾(混合液为裂解液），放于65°C中水浴；
[0090] 4)将2块96孔样品收集管放于自动化样品研磨机中将样品研磨充分；
[0091] 5)用排枪在每个收集管中加入400μ1裂解液，盖上新的软胶盖后，上下摇晃混匀；
[0092] 6)离心，转速达3000rpm即可停止；
[0093] 7)加入130yLAP2缓冲液，涡旋充分后，将96孔板放于-20°C冰箱静置lOmin;
[0094] 8)将96孔板6000rpm 离心 5min;
[0095] 9)扔掉盖子，将每个收集400μ1上清液转移至新的96孔收集管中（操作时需确保新 的微新集管的方向正确）；
[0096] 10)在每个收集管中中加入1.5体积ΑΡ3/Ε缓冲液，盖上新的软胶盖；
[0097] 11)上下剧烈震摇15s，离心，转速达到3000rpm时离心；
[0098] 12)将两个DNeasy 96Plates置于S-Blocks上面，做好标记（以避免样品混淆）；
[0099] 13)从微型收集管上除去并扔掉盖子，小心将每个样品1ml转移到DNeasy 96Plates;
[0100] 14)用AirPore Tape Sheet密封DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心4min;
[0101] 15)除去胶纸，在每个样品中加入500μ1缓冲液AW;
[0102] 16)用AirPore Tape密封Sheet DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心 15min使 DNeasy膜干燥；
[0103] 17)除去AirPore Tape，在每个样品中加入50μ165Γ预热的AE缓冲液，在15-25°c 室温下放置20min，在6000rpm下离心2min;
[0104] 18)重复第18步；
[0105] 19)将提取的DNA标记详细信息，存放于_20°C冰箱备用。
[0106] 5、PCR扩增及检测
[0107] PCR反应在Bio-Rad DNA Engine Dyad PCR仪上进行，反应体系及反应程序如下： 将上述的45对引物分别进行下述PCR反应，分别得到45个PCR产物。
[0108]
[0109]
[0110] 反应程序为：
[0111]
[0112] 得到的45组PCR产物分别经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Corp.)进行回收。吸取5yL回收产物，用1.0%琼脂糖凝 胶电泳检测有无目的片段，若有则将回收产物置于_20°C下保存备用。
[0113] 6、大肠杆菌感受态DH5a的制备及转化
[0114] 1)、大肠杆菌感受态DH5a的制备
[0115] (1)取大肠杆菌感受态(TaKaRaJapan)与冰上溶化，将溶液全部加入至5mL的LB液 体培养基中，于恒温摇床中37 °C下220rpm振荡培养过夜；
[0116] (2)将5mL菌液全部转移至含有100mL的LB液体培养基的150mL锥形瓶中，于恒温摇 床中37°C下220rpm振荡培养2~3h，至0D600为0.4~0.5(细菌个数小于10 8个/mL);
[0117] (3)将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，冰上放置lOmin;
[0118] (4)4°C下4 OOOrpm离心10min，倒出培养液，将离心管置于超净工作台中倒置约 lmin以便培养液流尽，回收管底沉淀；
[0119] (5)加入冷的20mmol/L的CaCh 10mL悬浮沉淀，于冰上放置30min;
[0120] (6)4°C下4 OOOrpm离心10min，回收管底细菌；
[0121] (7)加入冷的20mmol/L的CaCl2(预先加入15%甘油)2mL悬浮沉淀；
[0122] (8)用冻存管封装感受态细胞，每份100yL-150yL;
[0123] (9)将感受态细胞用液氮速冻后，于_70°C下保存待用。
[0124] 2)感受态转化、测序与比对
[0125] (1)将回收得到的目标片段(约1500bp)与pMD18-T Vector载体进行连接，连接体 系如下：
[0126]
[0127] (2)将上述反应液于16°C下连接3h后，用于大肠杆菌感受态DH5a的转化：
[0128] (3)将感受态细胞取出至冰上融化，然后将5yL连接液加入至感受态细胞中，混匀；
[0129] (4)冰浴达30min后，于42°C水浴热激90s，再迅速于冰上放置5min;
[0130] (5)加入灭菌的LB液体培养基lmL后，用封口膜密封后，置于恒温摇床中37 °C下 220rpm振荡培养lh;
[0131] (6)培养lh后，4°C12 OOOrpm离心lmin。
[0132] (7)用移液器吸取上清液lmL，将剩余的溶液吸打混匀，吸取菌液用L形涂布棒均匀 涂布于LB (含0.1 % Amp)固体培养基上；
[0133] (8)将培养皿倒置于恒温培养箱中37°C黑暗培养至有菌落长出（约8~12h)。
[0134] (9)用灭菌的牙签挑取平板上的单菌落至3mL预先加入0.1%Amp的液态LB培养基 中，于37°C下220rpm振荡培养8~12h;
[0135] (10)将上述菌液用PCR反应(反应体系为10yL，反应程序不变)和琼脂糖凝胶电泳 验证是否转化成功。若能检测到目的条带，则说明大肠杆菌转化成功。将能检测到目的条带 的菌液送至南京金斯瑞生物公司进行测序。将测序结果用DNAMAN进行分析。
[0136] 7、数据处理与分析
[0137] 将扩增广物测序结果与福鼎大白序列比对，所述的福鼎大白的喊基序列如序列表 中碱基序列，当扩增产物的序列所示的碱基序列的相似性较高，且在45个SNP位点碱基相 同，该待鉴定样品为福鼎大白；否则，不是福鼎大白。
[0138] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于福鼎大白商品茶的分子鉴定的引物组，其特征在于，所述引物组包括45对 弓丨物序列，所述引物序列如SEQ ID NO: 1~90所示。2. -种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 确定福鼎大白茶叶样品的45个SNP位点，其SNP序列如SEQ ID N0:91~135所示.，在 NCBI中通过blast找到的对应的45个基因序列； 2) 引物的设计;根据找到的45个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物，并进 行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这45个基因片段的上下游引物;所述引物 序列如权利要求1所述的45对引物序列； 3) 基因组DNA提取； 4. PCR扩增及检测； 5) 将扩增产物测序后与福鼎大白品种条形码比对，福鼎大白品种条形码的碱基序列， 扩增产物的SNP序列与福鼎大白品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以 上，则该待鉴定样品为福鼎大白品种。3. 根据权利要求2所述的一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述引物 的设计长度18_25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50°C-60°C，GC含量在40%-60%之间。4. 根据权利要求2所述的一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述基因 组DNA提取采用以下方法从叶片中提取基因组DNA，对于少量鉴定样品，其基因组DNA提取操 作步骤如下： 1) 将50mg叶片称重后放入2mL离心管中； 2) 在2mL离心管中，加入碳化钨珠与石英砂； 3) 将离心管放于自动化样品研磨机中将样品研磨充分； 4) 在每个2mL离心管中加入400μ1 APl缓冲液与4μ1 RNase A，盖好后祸旋充分； 5) 将混合物在65 °C下水浴20min，每隔5min涡旋充分； 6) 准备冰盒； 7) 水浴结束后，加入130yLAP2缓冲液，涡旋充分后，冰浴5min; 8. HOOOrpm 离心 5min; 9) 将上一步中离心的上层清液小心吸出置于紫色离心柱QIA shredder Mini Spin Colum 中，HOOOrpm 离心 2min; 10) 将上一步中获得的滤液缓慢吸出至另一新离心管中； 11) 在离心管中加入滤液1.5倍体积的AP3/E缓冲液，并吸打混合均匀； 12) 将上步中混合液加入白色离心柱Dneasy Mini Spin Colum中，^8000rpm离心 Imin，弃废液;将剩余的混合液加入离心柱，再次抽提； 13) 将AE在65 °C水浴锅中预热； 14) 将白色离心柱取出放于2mL收集管上； 15) 在离心柱中加入500μ1的AW缓冲液，8000rpm离心Imin 16) 弃废液，将离心柱放回收集管，再在离心柱中加入500μ1的AW缓冲液，HOOOrpm离心 2min； 17) 将白色离心柱DneasyMiniSpinColum放置于1.5或2mL离心管上，加入50μ1 65°C预 热的AW，室温放置20min; 18) 8000rpm 离心 lmin; 19) 重复步骤17、18; 20) 将提取的DNA标记详细信息，存放于-20°C冰箱备用。5. 根据权利要求2所述的一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述基因 组DNA提取采用以下方法从叶片中提取基因组DNA，对于大量鉴定样品，其基因组DNA提取操 作步骤如下： 1) 将50mg叶片称重后放入96孔样品收集管中； 2) 在收集管中，加入碳化钨珠与石英砂，并用软胶盖住收集管； 3) 65°C预热APl缓冲液，将90mL预热的APl缓冲液与225μ1 RNase Α、225μ1 Reagent DX 混合均匀，放于65 °C中水浴； 4) 将2块96孔样品收集管放于自动化样品研磨机中将样品研磨充分； 5) 用排枪在每个收集管中加入400μ1裂解液，盖上新的软胶盖后，上下摇晃混匀； 6) 离心，转速达3000rpm即可停止； 7) 加入130yLAP2缓冲液，涡旋充分后，将96孔板放于-20 °C冰箱静置IOmin; 8) 将96 孔板6000rpm 离心 5min; 9) 扔掉盖子，将每个收集400μ1上清液转移至新的96孔收集管中； 10) 在每个收集管中中加入1.5体积ΑΡ3/Ε缓冲液，盖上新的软胶盖； 11) 上下剧烈震摇15s，离心，转速达到3000rpm时离心； 12) 将两个DNeasy 96Plates置于S-Blocks上面，做好标记； 13) 从收集管上除去并扔掉盖子，小心将每个样品Iml转移到DNeasy 96Plates; 14) 用AirPore Tape Sheet密封DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心4min; 15) 除去胶纸，在每个样品中加入500μ1缓冲液AW; 16) 用AirPore Tape密封Sheet DNeasy 96Plate，在6000rpm下离心 15min使DNeasy膜 干燥； 17) 除去AirPore Tape，在每个样品中加入50μ1 65°C预热的AE缓冲液，在15-25°C室温 下放置20min，在6000rpm下离心2min; 18) 重复第18步； 19) 将提取的DNA标记详细信息，存放于-20°C冰箱备用。6. 根据权利要求2所述的一种福鼎大白商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR 扩增反应程序为:94°C预变性IOmin;然后进入循环，每个循环94°C变性30sec，52~55°C退 火30sec，72°C延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72°C延伸10min;4°C冷却后取出扩增产 物。
【文档编号】C12Q1/68GK105907845SQ201610232109
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】房婉萍, 周琳, 俞滢, 李庆会, 朱旭君, 王玉花, 叶乃兴, 李磊
【申请人】南京农业大学