一种水蛭的dna条形码分子鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种水蛭(宽体金线蛭)的DNA条形码分子鉴定的方法和其CO?I序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出水蛭CO?I基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与公开序列进行比对，如果与所述基因序列SEQ?ID?NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭来源。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了宽体金线蛭品种，增强了准确性和可靠性，确保了水蛭作为药材入药的安全性。
【专利说明】—种水蛭的DNA条形码分子鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定方法。【背景技术】
[0002]宽体金线蛭(学名:Whitmania pigra)是传统的名贵中药材,是2010版《中国药典》收录的药材水蛭主要基原动物之一，具有破瘀通经，消积散结等功效，也是疏血通等众多治疗心脏血管疾病中药的主要原料。因此，对宽体金线蛭的鉴定是入药的基础。在我国的药材市场，大部分动物药都是贵重、紧缺药材，通常以粉末等形式入药，市场较为混乱，鉴别十分困难。至于水蛭，在药材市场上，来源相对清晰，但是仍有部分伪品在市场内流通。目前，传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差，可信度低，导致水蛭的鉴定存在很大困难，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
[0003]DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶I号基因(COI)的部分序列。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。运用DNA条形码技术，可以很好的对水蛭的品种进行快速、有效的鉴定。
[0004]本发明提 供一种关于宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现宽体金线蛭的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。
【发明内容】
[0005]本发明克服目前以形态学鉴定水蛭方法存在的缺陷，提高宽体金线蛭鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下:
[0006]首先从采集的各种水蛭提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立各种水蛭的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定宽体金线蛭的目的。对需要鉴定的水蛭样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据序列比对可以鉴定出宽体金线蛭。本发明设计的用于鉴别宽体金线蛭的分子鉴定方法，采用如下步骤:
[0007]1、提取水蛭总DNA按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1 μ g/ μ 1-2 μ g/μ I。
[0008]2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为
[0009]1X01490:5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；[0010]HC02198:5/ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
[0011]扩增程序为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环94°C变性I分钟，50°C退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环72°C延伸5分钟。
[0012]3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA marker检测PCR片段大小。
[0013]4、鉴定结果的判断:若出现明显清晰的709bp大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。
[0014]5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID N0.1同源性在99%以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭。
[0015]其中，所述的水蛭DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。
[0016]所述引物，正向引物为5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'反向引物为 5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。[0017]所使用的DNA聚合酶为Pfu高保真酶。
[0018]所述的电泳为I % -2 %的琼脂糖凝胶电泳。
[0019]所述的条带大小需要用DNA maker检测。
[0020]所述的DNA 序列拼接软件包括 CodonCode Aligner、Sequencher> Genious、DNAstar等软件。
[0021]与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现宽体金线蛭的分子鉴定。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]附图为用COI引物扩增水蛭的电泳检测图谱，其中泳道M为DNA Marker,泳道NI为阴性对照，泳道Ml~M3依次为样品Ml，M2，M3。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明:
[0024]1、水蛭标本的采集与保存采集品系:W1_湖面自育幼苗养殖I期水蛭;W2_湖面自育幼苗养殖II期-水蛭；W3-随机市场收集水蛭样品。采获的标本经10%酒精麻醉处理约20分钟，再经75%酒精浸泡15分钟处死并保存。
[0025]2、试验样品的前处理:取出保存于75%酒精中的水蛭标本，去内脏，避免内脏内容物的污染，剩余部分用蒸馏水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大约20mg解剖剪置入2mlEP管，加入磁珠，震荡粉碎。蛋白酶K56°C温浴I小时，至组织完全溶解。加入350 μ I氯仿:异戊醇(24: I)混匀，10，OOOXg室温离心5分钟，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
[0026]3、DNA模板制备:采用天根生物公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DNA进行提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5 μ g/ μ I。
[0027]4、引物合成:本实施例所用引物如下:
[0028]正向引物5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0029]反向引物5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0030]5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下:[0031]PCR 反应体系为 25μ 1:ddH208.5uL，2XTaq PCR Master Mixl2.5uL，正向引物 /反向引物(2.5umol)各 luL，DNA 模板 2uL2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2X，且不含染料；扩增程序:反应条件为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环94°C变性I分钟，50°C退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环72°C延伸5分钟。
[0032]6、琼脂糖电泳验证PCR结果琼脂糖电泳显示Wl，W2，W3样品扩增良好，条带清晰无杂质，可直接送测序公司进行测序。
[0033]7、测序结果序列拼接将测序结果用CodonCode Aligner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后跟SEQ ID N0.1进行比对，Wl, W2与跟SEQ ID N0.1同源率100%，为宽体金线蛭。W3序列与SEQ ID N0.1差异显著，与药用植物研究所构建的中药材DNA鉴定网站进行(网址www.tcmbarcode.cn)为日本水輕。
[0034]本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化和改进，均落入本 发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种水蛭的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于采用DNA条形码鉴定的水蛭为蚂虫皇Whitmania pigra Whitman,亦称宽体金线蛭。
2.根据权利要求1所述的DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括: (1)从待测的水蛭组织中分离提取总DNA; (2)以该DNA为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出水蛭COI基因； (3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，送生物公司测序； (4)根据测序结果，进行分析比对，如果与所述基因序列SEQID N0.1的同源性在99%以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭来源。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于引物DNA的序列为:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ；
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
4.根据权利要求2所述聚合酶链式反应，其特征在于扩增条件为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环；94°C变性I分钟，50。。退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环；72°C延伸5分钟。
5.根据权利要求2所述扩增产物，其特征在于扩增片段为709bp，用1%-2%琼脂糖电泳检测。
6.根据权利要求2所述的一种水蛭的DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为CO I基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID N0.1:
【文档编号】C12Q1/68GK103898235SQ201410162545
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】李振国, 陈艳明, 务勇圣 申请人:牡丹江友搏药业股份有限公司